Способ определения содержания лиганда в образце (варианты)

Способ определения содержания лиганда в образце (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять качественно или количественно наличие лиганда в образце.

Известен способ (Патент США 3,935,074, выдан 27 января 1976 г.), в котором используется молекулярный Реагент, имеющий два эпитопа, причем первый эпитоп схож с детектируемым лигандом, а второй эпитоп, детектирующий, отличается от лиганда. Эти два эпитопа должны быть расположены на Реагенте настолько близко друг к другу, что при связывании первого антитела с первым эпитопом стерически блокируется второй эпитоп так, что второе антитело, анти(детектирующий лиганд), не может связаться со вторым эпитопом. При этом количество связавшегося второго антитела будет коррелировать с количеством лиганда в образце. Определение количества связавшегося или несвязавшегося второго антитела дает информацию о количестве лиганда, находившегося в образце, по сравнению с образцами с известным содержанием лиганда.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) Реагент, несущий на себе два эпитопа, заявлен как молекула. При этом, например, в случае использования данного метода в режиме гетерогенного иммуноанализа, в котором присутствует процесс разделения несвязавшихся антител от связавшихся, метод чрезвычайно трудоемок, время- и трудозатратен, а также сложен в исполнении. Для такого разделения могут быть использованы известные методы хроматографии или центрифугирования, что потребует дополнительного оборудования и, следовательно, ограничивают использование известного способа лабораторными условиями. Возможная иммобилизация данного Реагента на твердой фазе может вызывать частичную пространственную блокировку, например только первого эпитопа, за счет чего существенно снизится чувствительность способа, т.к. первое антитело не сможет вызывать пространственной блокировки второго эпитопа, и тот всегда будет либо заблокирован, либо, наоборот, всегда доступен для связывания, из-за чего появится побочный сигнал, снижающий чувствительность анализа.

2) На Реагенте иммобилизованы молекулы детектируемого в неизвестном образце лиганда, либо его аналога. При этом чувствительность метода невысока, т.к. для изменения детектируемого сигнала требуется концентрация лиганда в образце, достаточная для блокирования первых антител, т.е. превышающая концентрацию первых антител (точнее сайтов связывания на первых антителах), которые, в свою очередь, добавляют в избытке для возможности блокировки существенной часть лиганда на Реагенте в отсутствии лиганда в образце.

3) Для определения количества связанных или несвязанных лигандов на реагенте используется комбинация детектирующего лиганда на реагенте и детектанта. Причем детектирующий лиганд заявлен лишь как сайт для связывания второго антитела (анти-(детектирующий лиганд)) и не представляет собой метки, производящей сигнал (т.е. не может быть флуоресцентной или ферментной меткой). Это означает, что в данном известном способе сигнал производится детектантом, который определяет, сколько второго антитела связалось с детектирующим лигандом на реагенте, а сколько не связалось.

4) В качестве стерического блокиратора используется один «слой» рецептора (анти-лиганд), что может приводить к недостаточному стерическому блокированию и, следовательно, ухудшать динамический диапазон или чувствительность анализа.

Известен способ (Патент США 4,208,479, выдан 17 июня 1980 г.), в котором иммуноанализ проводится с использованием меченого рецептора и модифицирующего реагента, который способен модифицировать метку на рецепторе в случае рецептора, не связанного с лигандом или полилигандным аналогом. В случае же рецептора, связанного с лигандом, последний стерически блокирует подход модифицирующей молекулы к метке. При этом по изменению сигнала от метки можно определить количество л и ганда в анализируемом образце.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) Для проведения анализа обязательно требуется добавление модифицирующего реагента, влияющего на сигнал, создаваемый меткой. Разграничение между рецепторами, связанными и не связанными с лигандом или полилигандным аналогом, осуществляется за счет влияния модифицирующей молекулой на способность метки производить сигнал. При этом способ ограничен в выборе меток, для которых существует подходящий модифицирующий агент, доступ которого к метке может быть стерически ограничен.

2) По определению, данному в описании данного изобретения, модифицирующая молекула взаимодействуете меткой таким образом, что сигнал, создаваемый меткой, уменьшается. При этом из-за стерических затруднений модифицируется только метка вне комплекса рецептор - лиганд (или рецептор - полилигандный аналог) таким образом, что наблюдаемый сигнал производится только немодифицированной меткой в комплексе и остаточным сигналом модифицированных меток вне комплекса. При этом в случае детекции моноэпитопного соединения в образце производимый сигнал будет тем меньше, чем больше этого соединения в образце (и чем меньше полилигандных аналогов маскирует метку от модификатора), что, как правило, приводит к ухудшению чувствительности способа.

3) В случае детекции в образце полиэпитопного лиганда или рецептора полиэпитопного лиганда стерически заблокировать метку от взаимодействия с модифицирующей молекулой должен сам лиганд или рецептор лиганда из образца, при этом в случае полиэпитопных, но небольших, лигандов (например, белков до 30 кДа) их возможности по стерической блокировки весьма ограничены.

4) Метка ковалентно конъюгирована непосредственно с рецептором. При этом, например, неудобно использовать в качестве метки фермент, способный деградировать упомянутый рецептор. Например, если рецептор - белок, то при использовании протеазы в качестве метки будет происходить протеолиз рецептора, как правило, обусловленный расщеплением меткой на одном рецепторе другого рецептора в растворе, что делает результаты такого анализа нестабильными.

Известен способ детекции аналита в образце (Патент США 4,193,983, выдан 18 марта 1980 г.), в котором детектируемый аналит является членом специфически связывающейся пары лиганда и антилиганда, и в котором используется метка, производящая детектируемый сигнал, величина которого зависит от близости упомянутого антилиганда к упомянутой метке из-за объема антилиганда или из-за вещества, конъюгированного с упомянутым антилигандом, которое взаимодействует с меткой. При этом процесс детекции аналита включает в себя, в том числе, смешение в водной среде: 1) образца, содержащего детектируемый аналит, 2) реагента, состоящего из лиганда (или его аналога) и метки, причем данный аналог лиганда способен связываться с упомятнутым антилигандом, и 3) антилиганда в случае, когда лиганд является аналитом или упомянутый антилиганд конъюгирован с упомянутым веществом, которое взаимодействует с меткой, причем реагент представляет собой отдельные коллоидные частицы, состоящие из большей части липофильных компонент и меньшей части метки и лиганда (или его аналога), причем упомянутая метка ковалентно связана по крайней мере с одним липофильным компонентом, а лиганд или аналог лиганда липофилен или сделан таковым за счет соединения с липофильным компонентом.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) На Реагенте иммобилизованы молекулы детектируемого в неизвестном образце лиганда либо его аналога. При этом чувствительность метода невысока, т.к. для изменения детектируемого сигнала требуется концентрация лиганда в образце, способная конкурентно связаться с первыми антителами, а значит концентрация лиганда в образце должна превышать концентрацию первых антител (точнее сайтов связывания на первых антителах), которые добавляют в избытке для возможности блокировки существенной части лиганда на Реагенте в отсутствии лиганда в образце.

2) Реагент состоит из большей части липофильных компонент и меньшей части метки и лиганда (или его аналога) и представляет из себя коллоидные частицы, которые по определению, данному в описании данного способа, относятся к классу ассоциированных коллоидов, являющихся термодинамически стабильными системами, в которых диспергированная фаза состоит из агрегатов молекул или ионов сравнительно малых размеров. Кроме того, указано, что упомянутая метка ковалентно связана по крайнейп мере с одним липофильным компонентом, а лиганд или аналог лиганда липофилен или сделан таковым за счет соединения с липофильным компонентом, причем и метка, и лиганд связаны с частицей нековалентно, а именно за счет липофильной группы. При этом из известного уровня техники известно, что в такой системе помимо меток и лигандов, связанных с частицей, могут присутствовать индивидуальные свободные молекулы метки и лиганда (меченных или не меченных липофильным компонентом), не ассоциированные с частицами (по крайней мере, в случае использования амфифильных компонент). Значит, такие индивидуальные метки будут производить паразитный сигнал, а индивидуальные лиганды конкурировать за связывание с антилигандом, что будет ухудшать параметры анализа, например, чувствительность.

3) Т.к. метка и молекулы лиганда связаны с реагентом и друг с другом нековалентно, а за счет лишь липофильного взаимодействия, то при связывании первых антител с молекулами лиганда на реагенте, метки в составе того же реагента могут мигрировать по поверхности реагента и выходить из под пространственной блокировки первых антител, что будет приводить к невысокой чувствительности способа.

Таким образом, требуемый технический результат состоит в повышении чувствительности метода к определяемому лиганду, сокращении времени проведения анализа, уменьшении количества требуемых реагентов для проведения анализа, повышении удобства проведения анализа, обеспечении возможности проведения анализа, в том числе в полевых условиях.

Для достижения указанного технического результата предложен способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

А) выбор, по крайней мере, одного носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду на носителе, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

В) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого носителя,

iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы выбран не определяемый лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания носителей друг с другом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя или схожего с носителем аналога.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого носителя или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал. Кроме того, способ, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым носителем упомянутых молекул или частиц.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющий, по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

причем, упомянутая молекула и упомянутый блокируемый объект упомянутого агента косвенно связаны друг с другом, в том числе посредством связей в упомянутом агенте, преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающим в себя липофильное взаимодействие,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой на упомянутом агенте, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой молекулой на упомянутом агенте пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, состоящего из липофильных и/или амфифильных компонент, несущих на себе по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, являющейся нано- или микро-частицей надмолекулярной природы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой упомянутого агента, причем упомянутое связывание зависит от присутствия лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой молекулой упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа полиэпитопного лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому полиэпитопному лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, состоящей из, по крайней мере, двух молекул полиэпитопного лиганда, или несущей на себе молекулы полиэпитопного лиганда, или способной связываться с рецептором к определяемому полиэпитопному лиганду в составе агента посредством других вспомогательных молекул в. зависимости от присутствия определяемого лиганда, причем такой, что при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду в составе упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый рецептор, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый полиэпитопный лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого полиэпитопного лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством, по крайней мере, одного связующего объекта, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешивание:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

(iii) упомянутого связующего объекта, когда в качестве упомянутого связующего объекта не выбран определяемый лиганд,

iv) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу,

причем при связывании определяемого лиганда с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешивание:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу, зависящему от специфического связывания с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.) После упомянутого смешивания и пропускания полученной смеси по упомянутой дополнительной твердой фазе или инкубации в контакте с ней.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор поверхности твердой фазы, несущей, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутой поверхности твердой фазы, причем связывание упомянутой поверхности твердой фазы и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой поверхностью твердой фазы пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутой поверхности твердой фазы, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) приведение в контакт, по крайней мере:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутой поверхности твердой фазы,

iii) жидкой среды, содержащей, по крайней мере, упомянутую блокирующую частицу, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, способ, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к усилению (увеличению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы упомянутого агента выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал. Кроме того, способ, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

Кроме того, способ, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, которое не приводит к специфическому связыванию двух носителей (или агентов).

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы, не включающими те, которые находятся на других носителях (или агентах), идентичных или подобных упомянутому (имеющие другие блокируемые объекты).

Кроме того способ, в котором для произведения упомянутого детектируемого сигнала упомянутый блокируемый объект взаимодействует, по крайней мере, с одним сигнальным объектом, причем упомянутый сигнальный объект выбирают отличный от носителя (или агента) и не аналогичный носителю (или агенту), и на создание упомянутого детектируемого сигнала существенно влияет количество взаимодействий «блокируемый объект-сигнальный объект», и не существенно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым сигнальным объектом несколько носителей (или агентов) или только один.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал регистрируют без определения степени агрегации носителей (или агентов) друг с другом.

Кроме того способ, в котором возможная происходящая агрегация носителей (или агентов) друг с другом не влияет существенным образом на упомянутый детектируемый сигнал.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится за счет прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем агрегация носителей (или агентов) не вносит существенного вклада в детектируемый сигнал.

Кроме того способ, в котором участие упомянутого блокируемого объекта в произведении упомянутого детектируемого сигнала заключается во взаимодействии с сигнальным объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя (или агента) и не аналогичным носителю (или агенту), и на создание упомянутого детектируемого сигнала существенно влияет количество взаимодействий «блокируемый объект-сигнальный объект», но несущественно влияет то, взаимодействует ли с каждым сигнальным объектом несколько носителей (или агентов) или только один (когда в качестве сигнального объекта выбрана молекула или частица, а не поверхность твердой фазы).

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, являются, в том числе, возможность быстрой и легкой сепарации связанных молекул от несвязанных, повышение чувствительности метода за счет снятия ограничения на местоположение рецептора и аналога лиганда, возможность отказа от дополнительных сигнализирующих молекул (детектантов) или модификаторов метки на реагенте, например за счет использования в качестве реагента сложносоставной конструкции агента, представляющей собой нано- или микрочастицу с блокируемым объектом, специфически распознающим не лиганд, а третье вещество, и возможности считывать сигнал по взаимодействию пространственно или пространственно-электростатически заблокированного или не заблокированного блокируемого объекта агента с его естественным или синтетическим аналогом.

Кроме того, техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования активных детектирующих лигандов (блокируемого объекта), например ферментов, способных прямо или косвенно производить сигнал (в том числе в случае активации ферментом на реагенте зимогена, который затем начинает перерабатывать, например, неокрашенный субстрат в окрашенный).

Кроме того, возможность использования в качестве стерического блокиратора «многослойной блокирующей системы», в которой первая блокирующая частица, например, распознает эпитоп определяемого лиганда или рецептора к определяемому лиганду на агенте, а каждая последующая блокирующая частица распознает либо эпитоп определяемого лиганда или рецептора к определяемому лиганду на агенте, либо эпитоп или эпитопы на предыдущих блокирующих частицах.

Кроме того, возможность использования блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду агента, причем в зависимости от присутствия определяемого лиганда, и такой, что при связывании блокирующей частицы с рецептором к определяемому лиганду агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, возможность разграничения рецепторами на агенте, связанными и не связанными с лигандом или блокирующей частицей, без необходимости привлечения молекулы, модифицирующей сигнал блокируемого объекта.

Кроме того, возможность разграничения между рецепторами на агенте, связанными и не связанными с лигандом или блокирующей частицей, за счет способности модифицирующей молекулы модифицировать блокируемый объект на агенте таким образом, что сигнал, создаваемый блокируемым объектом, увеличивается. При этом из-за стерических затруднений модифицируется только блокируемый объект вне комплекса рецептор - лиганд (или рецептор - блокирующая частица) таким образом, что детектируемый сигнал производится только модифицированными метками вне комплекса и побочным сигналом немодифицированных меток в комплексе.

Кроме того, возможность использования низкоаффинных рецепторов к определяемому лиганду для получения высокой чувствительности метода.

Кроме того, возможность использования в качестве агента поверхности твердой фазы.

В рамках данного изобретения Лиганд-рецептор может быть любой парой специфически взаимодействующих молекул. В качестве примера, но не органичения, можно привести следующие пары: антиген-антитело, лектин-углевод, лектин-гликопротеин, стрептавидин-биотин, протеин А-иммуноглобулин, фермент-субстрат, фермент-активатор-зимоген и пр. При этом в приведенных парах лигандом или рецептором, в рамках данного описания, можно считать как первую часть, так и вторую, т.е. например, лиганд может быть антителом, а рецептор - антигеном к упомянутому антителу; лиганд может быть лектином, а рецептор к нему - соответствующим углеводом и т.п. В понятии лиганда для удобства описания подразумевается как сам лиганд, так и его аналоги, т.е. любые молекулы или молекулярные комплексы и частицы, часть которых гомологична лиганду, в том числе комплексы молекул. Так, например, понятие рецептор к определяемому лиганду включает в себя понятие рецептор к аналогу определяемого лиганда.

Кроме того, в одном воплощении метода, вместо лиганда может подразумеваться любое воздействие способное образовать или разрушить связь между блокирующей частицей и агентом (или носителем). Это может быть pH, повышенная температура, электромагнитное излучение и т.п. В этом случае понятие рецептор к определяемому лиганду следует понимать как комбинацию атомов, способных образовать связь под действием упомянутого воздействия или связь которой с блокирующей частицей может быть разрушена упомянутым воздействием. Так, под лигандом может в том числе пониматься молекулы и ионы, подобные этилендиаминтетраацетату, который способен, например, деметаллизировать металлозависимые рецепторы, например, многие лектины. При деметаллизировании таких рецепторов многие из них теряют способность связывать свой естественный лиганд.

Блокируемым объектом, участвующим прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, может быть любой атом, молекула или частица, пространственное или пространственно-электростатическое блокирование которой изменяет детектируемый сигнал.

Пространственная или электростатически-пространственная блокировка блокируемого объекта заключается в затрудненности блокируемого объекта взаимодействовать прямо или косвенно с определенными другими молекулами из-за стерических и/или