Применение производных пептида wnt5-a для лечения меланомы и рака желудка

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к новым неразветвленным карбаматным производным некоторых пептидов Wnt-5a, в частности к N-бутилоксикарбонильному производному, их фармацевтическим композициям и их использованию для лечения меланомы или рака желудка. 5 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 7 пр.

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к некоторым неразветвленным карбаматным производным некоторых производных Wnt5-α, а также к лечению меланомы с использованием этих производных Wnt5-α.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Меланома является злокачественной опухолью меланоцитов, которые встречаются преимущественно в коже, но также в кишечнике и глазу. Она представляет собой один из наиболее редко встречающихся типов рака кожи, но является причиной большинства связанных с раком кожи смертельных исходов. Злокачественная меланома является потенциально опасным типом рака кожи. Это обусловлено неконтролируемым ростом пигментных клеток, называемых меланоцитами. Несмотря на многие годы интенсивного лабораторного и клинического исследования единственным эффективным методом лечения является хирургическое удаление первичной опухоли до достижения ею толщины, большей, чем 1 мм.

Приблизительно 160000 новых случаев меланомы диагностируется во всем мире каждый год, и она наиболее часто встречается у мужчин и представителей европеоидной расы. Она более распространена в европейских популяциях, проживающих в солнечном климате, чем в других группах. В соответствии с сообщением ВОЗ примерно 48000 связанных с меланомой смертельных исходов наблюдается во всем мире в год. Злокачественная меланома является причиной 75 процентов всех смертельных исходов, связанных с раком кожи.

Лечение включает хирургическое удаление опухоли; адъювантное лечение; химио- и иммунотерапию или лучевую терапию.

Риск развития меланомы зависит от двух групп факторов: внутренних и обусловленных окружающей средой. «Внутренние» факторы обычно представляют собой семейный анамнез индивидуумов и унаследованный генотип, тогда как наиболее важным фактором окружающей среды является солнечная экспозиция. Эпидемиологические исследования указывают на то, что экспозиция ультрафиолетового излучения (УФА и УФВ) является одним из основных факторов, способствующих развитию меланомы. УФ-излучение вызывает повреждение в ДНК клеток, в основном димеризацию тимина, которая в отсутствие репарации может приводить к возникновению мутаций. Если клетки делятся, эти мутации передаются в новые поколения клеток. Если мутации происходят в онкогенах или в генах опухолевых супрессоров, скорость митоза в несущих мутацию клетках может становиться неконтролируемой, приводя к образованию опухоли. Случайная чрезмерная солнечная экспозиция (приводящая к «солнечному ожогу») причинно связана с меланомой.

Возможные значимые элементы в определении риска включают интенсивность и продолжительность солнечной экспозиции, возраст, при котором происходит солнечная экспозиция, и степень пигментации кожи. Экспозиция в период детства является более важным фактором риска, чем экспозиция в период зрелого возраста. Это видно из миграционных исследований в Австралии, где жители проявляют тенденцию к сохранению профиля риска своей страны рождения, если они мигрировали в Австралию в зрелом возрасте. Индивиды с солнечными ожогами в виде волдырей или шелушением кожи (особенно в первые двадцать лет жизни) имеют значительно больший риск развития меланомы. Это не означает, что солнечный ожог является причиной меланомы. Наоборот, он просто статистически коррелирует. Причиной является чрезмерная УФ-экспозиция. Было показано, что солнцезащитный крем несмотря на то что предотвращает солнечный ожог, не защищает от меланомы. Многие исследователи утверждают, что солнцезащитный крем может даже увеличить риск развития меланомы. Русые и рыжеволосые жители, персоны с множеством атипичных невусов или с диспластическими невусами и персоны, родившиеся с гигантскими врожденными меланоцитарными невусами, имеют повышенный риск развития меланомы.

Заболеваемость меланомой увеличилась в последние годы, но не ясно, какой объем изменений в поведении, в окружающей среде или в раннем выявлении вовлечены в этот процесс.

Для понимания того, как солнцезащитный крем может уменьшить солнечный ожог и в то же время вызвать развитие меланомы, необходимо различать прямое повреждение ДНК и непрямое повреждение ДНК. Генетический анализ показывает, что 92% всех меланом вызвано непрямым повреждением ДНК. Семейная меланома является генетически гетерогенной, и локусы семейной меланомы были идентифицированы на хромосомных плечах 1p, 9p и 12q.

Признаками и симптомами меланомы являются:

асимметричное повреждение кожи;

граница повреждения неоднородная;

меланомы обычно являются многоцветными;

родинки, большие чем 5 мм, более вероятно являются меланомами, чем родинки меньшего размера.

Эволюция (т.е. изменение) родинки или повреждения может являться указанием на то, что повреждение становится злокачественным.

Наиболее распространенные типы меланомы в коже представляют собой:

поверхностно генерализованную меланому (SSM);

узловатую меланому;

акральную лентигинозную меланому;

злокачественное лентиго (меланома) [меланому типа злокачественного лентиго].

Любая из вышеупомянутых типов может вырабатывать меланин (и являться темной по цвету) или нет (и является амеланотической - нетемной). Аналогично любой подтип может проявлять десмоплазию (реакция плотных волокон с нейротропизмом), которая является маркером агрессивного поведения и тенденции к местному рецидиву.

Другие:

светлоклеточная саркома (меланома мягких тканей);

меланома слизистой;

увеальная меланома.

Особенности, которые влияют на прогноз, представляют собой толщину опухоли в миллиметрах (толщина по Бреслоу), глубину, связанную со структурой кожи (уровень Кларка), тип меланомы, наличие изъязвлений, наличие лимфатической/перинейральной инвазии, наличие опухоль-инфильтрующих лимфоцитов (если имеются, прогноз улучшается), место поражения, наличие сопутствующих поражений и наличие региональных или отдаленных метастазов.

Некоторые типы меланомы имеют плохие прогнозы, но это объясняется их толщиной. Интересно, что менее инвазивные меланомы даже с метастазами в лимфатический узел влекут за собой более лучший прогноз, чем глубокие меланомы без региональных метастазов во время стадии распространения опухоли. Локальные рецидивы имеют тенденцию к поведению, сходному с первичной опухолью, если только они не находятся в областях широкого локального иссечения (в отличие от многоэтапного иссечения или иссечения путем вырубания/срезания), так как такие рецидивы проявляют тенденцию к лимфатической инвазии.

Когда меланомы распространяются в лимфатические узлы, один из наиболее важных факторов представляет собой число узлов со злокачественностью. Степень злокачественности в узле также важна; микрометастазы, у которых злокачественность носит лишь микроскопический характер, имеют более благоприятный прогноз, чем в случае макрометастазов. В некоторых случаях микрометастазы могут быть определены только посредством специального окрашивания, и, если злокачественность определяется только посредством более редко используемого теста, известного как полимеразная цепная реакция (ПЦР), прогноз становится лучше. Макрометастазы, для которых злокачественность клинически очевидна (в некоторых случаях рак полностью замещает узел), имеют значительно худший прогноз, и, если узлы спаяны, или если они имеют внекапсульное протяжение, прогноз становится еще более плохим.

Когда они представляют собой отдаленные метастазы, рак обычно считается неизлечимым. Пятилетняя частота выживания составляет менее чем 10%. Средняя выживаемость 6-12 месяцев. Лечение является паллиативным, сфокусированным на продлении жизни и качестве жизни. В некоторых случаях пациенты могут жить многие месяцы или даже годы с метастазирующей меланомой (в зависимости от агрессивности лечения). Метастазы в кожу и легкие имеют более лучший прогноз. Метастазы в головной мозг, кость и печень ассоциированы с худшим прогнозом.

Меланома проявляется на различных стадиях, которые обозначаются как Стадия 0, которая представляет собой меланому in situ, имеющая 100% выживаемость, Стадия I/II, которая представляет собой инвазивную меланому, имеющая 85-95% выживаемость, Стадия II, которая представляет собой меланому высокого риска, имеющая 40-85% выживаемость, Стадия III, которая представляет собой региональный метастаз, имеющая 25-60% выживаемость, Стадия IV, которая представляет собой отдаленный метастаз, имеющая 9-15% выживаемость, основанную на AJCC 5-летней выживаемости при надлежащем лечении.

Хирургия является способом лечения первого выбора для локализованной кожной меланомы. Также имеется зависимость от стадии выполненной биопсии сторожевого лимфатического узла, хотя существует разногласие по опытным данным этой процедуры. Лечение прогрессирующей злокачественной меланомы проводится на основе многопрофильного подхода.

Меланомы высокого риска могут потребовать адъювантного лечения. В Соединенных Штатах большинство пациентов в остальном с хорошим здоровьем будут начинать с года лечения высокой дозой интерферона, которая имеет тяжелые побочные эффекты, но может улучшить прогноз для пациента. Это требование не поддерживается всей научной работой на данный момент, и в Европе интерферон обычно не используется вне объема клинических испытаний.

Используются разные химиотерапевтические агенты, включая дакарбазин (также названный как DTIC), иммунотерапия (с использованием интерлейкина-2 (IL-2) или интерферона (IFN)), а также локальная перфузия используется различными центрами. Они могут иногда показывать значительный успех, но в целом благоприятный исход при метастазирующей меланоме довольно ограничен. IL-2 (Пролейкин®) является первой новой терапией, одобренной для лечения метастазирующей меланомы в течение 20 лет. Исследования показывают, что IL-2 дает возможность полной и продолжительной ремиссии этого заболевания, хотя только у небольшого процента пациентов. Ряд новых агентов и новых подходов находятся на экспертизе и являются перспективными.

Лучевая терапия часто используется после хирургической резекции для пациентов с локально или регионально прогрессирующей меланомой, или для пациентов с нерезецируемыми отдаленными метастазами. Она может снижать частоту локальных рецидивов, но не увеличивает выживаемость.

Была интенсивно исследована молекулярная основа меланомной прогрессии, и анализ экспрессии генов идентифицировал несколько генов, дифференциально экспрессируемых в инвазивных формах меланомы по сравнению с менее инвазивной меланомой или доброкачественным невусом, один такой ген представляет собой Wnt-5a (Bittner et al., 2000). Wnt-5a является секретируемым, обогащенным цистеином белком, который подвергается посттрансляционному гликозилированию и липидным модификациям (Kurayoshi et al., 2007). После своей секреции Wnt-5a действует ауто- или паракринным образом путем связывания со своим рецептором, было показано, что в злокачественной меланоме Wnt-5a связывается с сопряженным с G-белком рецептором Frizzled-5 (Weeraratna, 2002). Он считается как не канонический белок Wnt, указывая на то, что он не действует первоначально через сигнальный путь β-катенина. Значение Wnt-5a в прогрессии рака было исследовано на различных типах рака в течение последних лет. Было показано, что Wnt-5a проявляет активность опухолевого супрессора при раке молочной железы, раке щитовидной железы, лимфоме, нейробластоме, раке толстой кишки и раке печени (Jönsson 2002; Kremenevskaja 2005; Liang 2003; Blanc 2005; Dejmek 2005; Liu 2008). Однако в других типах рака, подобного злокачественной меланоме и раку желудка, было показано, что увеличенная экспрессия Wnt-5a стимулирует опухолевую прогрессию (Bittner et al., 2000, Weeraratna, 2002; Lewis et al., 2005; Kurauoshi et al., 2006). На основании этих результатов можно заключить, что в некоторых раках вещество, имитирующее эффекты Wnt-5a, может служить ингибитором опухолевой прогрессии (Säfholm, 2006), тогда как в других раках, подобных злокачественной меланоме, ингибитор опосредованной Wnt-5a опухолевой прогрессии будет необходим.

В отношении нижележащих функциональных эффектов белка Wnt-5a в злокачественной меланоме доступны лишь ограниченные данные (Weeraratna, et al., 2002; Dissanayake et al., 2007). В клетках, полученных из образцов меланомной ткани, было показано, что увеличенная экспрессия Wnt-5a индуцирует усиление клеточной адгезии, миграции и инвазии. В том же исследовании авторы также показали, что эффекты Wnt-5a опосредовались через рецептор Frizzled-5 и сигнал нижележащей протеинкиназы C (PKC) (Weeraratna, 2002). В более поздней статье авторы далее показывают, что Wnt-5a индуцирует эпителиально-мезенхимный переход (EMT) при посредстве PKC-индуцированной экспрессии Snail, которая приводит к снижению уровня E-кадгерина, но увеличению уровня виментина (Dissanayake et al., 2007). Однако остается еще вопрос в отношении подлинной причины увеличенной экспрессии Wnt-5a в злокачественных меланомах.

В недавнем исследовании Hoek и соавторы на основании анализа ДНК-микрочипов предположили, что трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) играет решающую роль в регуляции экспрессии гена Wnt-5a (Hoek et al., 2006). Весьма интересно, что члены суперсемейства TGF-β (Van Belle et al., 1996) и костного морфогенетического белка (BMP, Rothhammer et al., 2005) проявляют увеличенную экспрессию в злокачественной меланоме. Кроме того, по меньшей мере некоторые функциональные эффекты TGF-β также перекрываются с таковыми Wnt-5a. Конкретнее, как упоминалось выше для Wnt-5a, TGF-β1 индуцирует EMT и увеличивает в меланомной клетке миграцию и метастатический потенциал (Janji et al., 1999; Gouon et al., 1996). Наконец, Wnt-5a и TGF-β1 опосредуют изменения в клеточном белке уровней E-кадгерина, некоторых интегринов и матриксных металлопротеиназ (Dissanayake et al., 2007; Janji et al., 1999). Существуют публикации по нераковым системам, которые демонстрируют прямую связь между сигнальной системой TGF-β и экспрессией Wnt-5a. Например, было показано, что в мезенхимных клетках зачатка крыла курицы TGF-β3 увеличивает экспрессию Wnt-5a, приводя к активации PKCα и хондрогенной дифференцировке (Jin et al., 2006). В более недавней публикации на мышах показали, что TGF-β1 увеличивает экспрессию Wnt-5a в эпителиальных клетках молочной железы, приводя к ингибированию протокового вытяжения и бокового ветвления в развивающейся молочной железе (Roarty и Serra, 2007). Вследствие этого ингибирование сигнальной системы TGF-β1 может потенциально являться привлекательным механизмом, посредством которого Wnt-5a опосредует миграцию опухолевой клетки, и метастазирование может быть замедлено.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производному Wnt-5a, используемому для лечения меланомы и рака желудка, а также к способу лечения меланомы и рака желудка.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В частности, изобретение относится к неразветвленным карбаматным производным, особенно N-бутоксикарбонильным производным некоторых пептидов Wnt-5a, и конкретнее к неразветвленному карбаматному производному, в частности N-бутоксикарбонильному производному одного или нескольких пептидов

Другой аспект по изобретению относится к неразветвленным карбаматным производным, в частности N-бутоксикарбонильному производному вышеупомянутых пептидов для применения в лечении меланомы и рака желудка.

Другой аспект по изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно из неразветвленных карбаматных производных, в частности N-бутоксикарбонильное производное вышеупомянутых пептидов для применения в лечении меланомы и рака желудка.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой топическую композицию.

Другой аспект по изобретению относится к способу лечения меланомы путем введения терапевтически эффективного количества неразветвленного карбаматного производного, в частности N-бутоксикарбонильного производного вышеупомянутых пептидов пациенту, страдающему меланомой и раком желудка.

Другой аспект по изобретению относится к способу профилактического лечения меланомы путем введения терапевтически эффективного количества неразветвленного карбаматного производного, в частности N-бутилоксикарбонильного производного вышеупомянутых пептидов пациенту, находящемуся в зоне риска развития меланомы и рака желудка.

Термин “неразветвленное карбаматное производное” в настоящем описании означает одно из производных группы N-метилоксикарбонильного, N-этилоксикарбонильного, N-n-пропилоксикарбонильного или N-бутилоксикарбонильного производного, при этом последнее может быть предпочтительным.

Настоящее изобретение будет описано ниже путем ссылки на некоторые выполненные эксперименты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 иллюстрирует характеристику меланомных клеточных линий A2058 и HTB63.

A) Анализ отсутствия или присутствия мРНК Wnt-5a, Frizzled-2 и Frizzled-5 в меланомных клетках A2058 и HTB63. Клеточная линия MCF-7 (M) рака молочной железы человека служила в качестве положительного контроля для всех этих транскриптов и β-актин - в качестве нагрузочного контроля. Плюс (+RT) и минус (-RT) указывают реакции, выполненные с и без обратной транскриптазы. Для Fzd2 и Fzd5 ПЦР-реакции выполняются с использованием в 3,5 раза большего количества кДНК, чем для β-актинового контроля.

B) Для дальнейшей характеристики присутствия транскрипта Wnt-5a в клетках HTB63 изобретатель также определял с помощью Вестерн-блота клеточные уровни белка Wnt-5a в клетках A2058 и HTB63 с использованием рекомбинантного Wnt-5a (rW5a) в качестве положительного контроля и β-актина в качестве нагрузочного контроля. Изобретатель также выполнял Вестерн-блот анализ в бессывороточной культуральной среде, собранной из клеток A2058 и клеток HTB63 через 48 часов для выявления отсутствия или присутствия секретируемого из этих клеток белка Wnt-5a. Рекомбинантный белок Wnt-5a служил в качестве положительного контроля. Каждый из представленных результатов повторяли как независимые эксперименты по меньшей мере три раза.

Фиг. 2 иллюстрирует Foxy5, который является Wnt-5a агонистом в меланомных клетках. A показывает структуру Foxy5 (формильная группа выделена). B показывает, что Foxy5 (50 мкМ) стимулирует миграцию клеток A2058 (анализ ранения-заживления) в пределах периода, составляющего 0, 16, 24, 40 и 48 часов. Планка погрешностей представлена s.e.m. Двусторонний критерий Стьюдента; *p<0,05.

Фиг. 3 показывает структуру Box5, который является модифицированным аналогом Foxy5.

Фиг. 4 иллюстрирует эффекты Wnt-5a и нового N-бутилоксикарбонильного гексапептида, Box5, на адгезию и миграцию меланомных клеток.

A) Меланомные клетки A2058 стимулировали указанными концентрациями Wnt-5a, разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде в присутствии или в отсутствие рекомбинантного Wnt-5a в указанных концентрациях. Клеткам затем обеспечивали прилипание в 96-луночном планшете. По истечении периода 60 минут неприлипшие клетки смывали, в то время как прилипшие клетки окрашивали и определяли их число. Это число представлено как процент контрольной (без Wnt-5a) стимуляции.

B) Меланомные клетки A2058 культивировали до слияния в 12-луночном планшете, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду, не содержащую (закрашенные кружки) или содержащую 0,2 мкг/мл Wnt-5a (незакрашенные квадраты).

C) Меланомные клетки A2058 культивировали до слияния в 12-луночном планшете, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду в отсутствие любой добавки (закрашенный кружок), присутствии 0,2 мкг/мл Wnt-5a одного (незакрашенные квадраты) или в присутствии 0,2 мкг/мл Wnt-5a со 100 мкМ Box5 (незакрашенный треугольник).

D) Меланомные клетки HTB63 культивировали до слияния в 12-луночной чашке, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду (закрашенный кружок), кондиционированную среду (незакрашенные квадраты) или кондиционированную среду с добавлением 100 мкМ Box5 (незакрашенный треугольник). Для регистрации изменений в миграции на панелях B-D картину учитывали с каждого росчерка/лунки из одной и той же области клеток спустя 0, 16, 24, 40 или 48 часов, и ранение-заживление выявляли как процент закрытия раневой поверхности.

E) До начала каждого эксперимента клетки A2058 (шесть столбцов слева) и клетки HTB63 (два столбца справа) разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде. Клетки предварительно инкубировали в течение 40 минут с использованием непрерывного встряхивания в отсутствие (незакрашенные столбцы) или присутствии (залитые краской столбцы) 100 мкМ Box5. Аликвоту клеточной суспензии, содержащую 25000 клеток, затем добавляли в верхнюю Transwell камеру и нижнюю камеру заполняли содержащей сыворотку (10%) средой. Как указывалось, 0,1 мкг/мл Wnt-3a, 0,2 мкг/мл Wnt-5a и/или 100 мкМ Box5 добавляли в верхнюю камеру. Клеткам затем давали возможность внедриться в течение 24 часов, после чего прикрепленные клетки на нижней стороне мембраны подсчитывали. Результаты даны как среднее ± SEM (n=5-7). *=p<0,05, **=p<0,01 и ***=p<0,001, где значения сравниваются с контролем (Фиг. 5D, CM против CM + Box5, ^=p<0,05, ^^=p<0,01 и ^^^=p<0,001).

Фиг. 5 иллюстрирует, что Box5 не оказывает влияния на спонтанную миграцию меланомных клеток A2058, но может ингибировать индуцированную TGFβ1 миграцию. A) Анализ заживления раны клеток A2058 в присутствии (□) или в отсутствие (●) 100 мкМ Box5. B) Анализ заживления раны клеток A2058, предварительно инкубированных с или без 100 мкМ Box5 в течение 40 минут и затем далее стимулированных с или без 5 нг/мл TGFβ1, как указывалось. Все данные по заживлению раны выражаются как процент закрытия раневой поверхности через 0, 16, 24, 40 и 48 часов.

Фиг. 6 иллюстрирует, что сигнальный путь Wnt-5a/Ca2+ является необходимым для опосредованной Wnt-5a инвазии меланомных клеток. A) rWnt-5a (0,1 мкг/л; добавление указывается стрелкой) запускает быстрый цитозольный сигнал Ca2+ в клетках A2058. B) Предварительная инкубация клеток A2058 с 10 мкМ MAPT/AM в течение 30 минут отменяет rWnt-5a (0,1 мкг/мл) стимуляцию (показано стрелкой) цитозольного Ca2+. C) MAPT/AM отменяет индуцированную Wnt-5a клеточную инвазию A2058. Клетки предварительно инкубировали с 10 мкМ MAPT/AM в течение 30 минут, затем стимулировали с/без rWnt-5a (0,2 мкг/л), и затем с 1 мкМ MAPT/AM на всем протяжении эксперимента по инвазии (24 часа), где последнее условие обработки обладало таким же хелатирующим эффектом на Ca2+, как 10 мкМ MAPT/AM в течение 30 минут, показано на Фиг. 6A. Планка погрешностей представляет s.e.m. Двусторонний критерий Стьюдента; *p<0,05, ***p<0,001.

Фиг. 7 иллюстрирует влияние Box5 на индуцированную Wnt-5a сигнальную систему Ca2+ и активацию PKC.

Флуоресцентные сигналы от нагруженных fura-2 меланомных клеток A2058, предварительно инкубированных (в течение ночи) и инкубированных в отсутствие или присутствии Box5 (100 мкМ,) регистрировали после стимуляции с использованием Wnt-5a (0,1 мкг/мл), эндотелина-1 (ET-1)(10 нМ) или карбакола (5 мкМ). A) Репрезентативные следы Ca2+ от клеток A2058, стимулированных Wnt-5a, эндотелином-1 или карбаколом, последние два представляют собой контроли лиганда рецептора G-белка. B) Два следа Ca2+ от меланомных клеток A2058, предварительно инкубированных и инкубированных с Box5 и затем стимулированных с использованием Wnt-5a (первая стрелка), и затем снова с использованием эндотелина-1 (вторая стрелка верхний след) или карбакола (вторая стрелка в нижнем следе). Все показанные следы являются репрезентативными для по меньшей мере пяти отдельных экспериментов. C) Показаны накопленные результаты изменений ∆Ca2+ в отношении значений (спонтанный уровень к уровню пика), зарегистрированных от клеток A2058, стимулированных Wnt-5a, эндотелином-1 или карбаколом в отсутствие (незакрашенные столбцы) или в присутствии Box5 (залитые краской столбцы). D) Предварительная инкубация с Box5 (100 мкМ) в течение ночи ингибирует фосфорилирование MARCKS через 45 минут или стимуляцию с использованием rWnt-5a (0,2 мкг/мл). 1 нМ PMA использовали как положительный индикатор фосфорилирования MARCKS. Результаты даны как среднее ±SEM, ***p<0,001.

Фиг. 8 иллюстрирует эффекты сигнальной системы TGF-β1 на экспрессию белка Wnt-5a в меланомных клетках A2058 и HTB63.

A) Репрезентативный Вестерн-блот показывает эффекты инкубированных меланомных клеток HTB63 в отсутствие или присутствии селективного TGF-β1 рецепторного антагониста SB431542 (10 мкМ) в течение 4 или 5 дней на эндогенную экспрессию Wnt-5a. Рекомбинантный Wnt-5a служил в качестве положительного контроля и β-актин в качестве нагрузочного контроля.

B) Вестерн-блоты показывают эффекты 24-часовой стимуляции с использованием увеличенных концентраций TGF-β1 на экспрессию Wnt-5a в клетках A2058. Рекомбинантный Wnt-5a служил в качестве положительного контроля и β-актин в качестве нагрузочного контроля. C) Вестерн-блоты показывают эффекты стимуляции с использованием 5 нг/мл TGF-β1 для увеличенных периодов времени на экспрессию Wnt-5a в клетках A2058. Рекомбинантный Wnt-5a служил в качестве положительного контроля и β-актин в качестве нагрузочного контроля. Каждый из представленных результатов повторяли как независимые эксперименты по меньшей мере четыре раза.

Фиг. 9 иллюстрирует эффекты TGF-β1 и Box5 на адгезию и миграцию меланомных клеток.

A) Меланомные клетки A2058 стимулировали указанными концентрациями TGF-β1, разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде. Клеткам затем обеспечивали прилипание в 96-луночном планшете и после периода 60 минут не прилипшие клетки смывали, в то время как прилипшие клетки окрашивали и определяли их число. Это число представлено как процент контрольной (без Wnt-5a) стимуляции.

B) Меланомные клетки HTB63 культивировали до слияния в 12-луночной чашке, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду в отсутствие (закрашенный кружок) или в присутствии 10 мкМ SB431542 (незакрашенный квадрат).

C) Меланомные клетки A2058 культивировали до слияния в 12-луночной чашке, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду в отсутствие любой добавки (закрашенный кружок) или в присутствии 5 нг/мл TGF-β1 индивидуально (незакрашенный квадрат), или в присутствии 5 нг/мл TGF-β1 со 100 мкМ Box5 (незакрашенный треугольник). В приведенных экспериментах на панелях B и C картину получали от каждого росчерка/лунки из одной и той же области клеток через 0, 16, 24, 40 или 48 часов, и заживление раны выражали как процент закрытия раневой поверхности.

D) До начала каждого эксперимента клетки A2058 (два столбца слева) и клетки HTB63 (два столбца справа) разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде RPMI. Аликвоту клеточной суспензии, содержащую 25000 клеток, затем добавляли в верхнюю Transwell камеру и нижнюю камеру заполняли содержащей сыворотку (10%) средой. Как указывалось, клеткам давали возможность внедриться в отсутствие (незакрашенные столбцы) или в присутствии 5 нг/мл TGF-β1 (залитый краской столбец), или 10 мкМ SB431542 (залитый краской столбец) в верхней камере. Клеткам затем давали возможность внедриться в течение 24 часов, после чего прикрепленные клетки на нижней стороне мембраны подсчитывали. Результаты даны как среднее ± SEM (n=5-10). *=p<0,05, **=p <0,01 и ***=p<0,001.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Антитела и пептиды

Использовали следующие первичные антитела: β-актин моноклональное AC-15 Ab (Sigma Aldrich, St. Louis, MO); TGF-β1 куриное поликлональное Ab (R&D Systems Europe Ltd., Абингдон, Великобритания). Поликлональное антитело к Wnt-5a получили в лаборатории изобретателя против аминокислот 275-290 зрелой молекулы Wnt-5a, как ранее описано (Jonsson et al., 2002). Вторичная конъюгированная с пероксидазой анти-куриная IgY (IgG) полная молекула изготовлена Sigma Aldrich (St. Louis, MO); все другие конъюгированные с пероксидазой IgG получили от Dakopatts (Глоструп, Дания). Inbiolabs Ltd (Таллинн, Эстония) синтезировал новый производный от Wnt-5a N-бутилоксикарбонильный гексапептид (Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu; Box5) для двух различных событий. Две партии пептида Box5 имели сходные результаты в анализах исследователя. Синтезированные партии пептида Box5 (>95% чистоты) проверяли на качество с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC) и масс-спектрометрии. Использованный формилированный контрольный пептид: формил-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys изготовлен Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Химические реактивы - бензамидин, бычья сыворотка, все типы среды для тканевой культуры изготовлены Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Человеческие рекомбинантные белки Wnt-5a, Wnt-3a и TGF-β1 приобретены у R&D Systems Europe Ltd. (Абингдон, Великобритания). Человеческий и свиной эндотелин-1 и карбакол приобретены у Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Протеазные ингибиторы пефаблок, лейпептин и апротинин изготовлены Roche Molecular Biochemicals (Мангейм, Германия). Селективный ингибитор рецептора типа 1 TGF-β1, подобной рецептору активина киназы ALK5 и ее родственных форм ALK4 и 7, SB431542 (Inman et al., 2002) приобретен у Tocris Bioscience (Tocris Cookson Ltd., Бристоль, Великобритания). Реагенты для определения усиленной хемилюминесценции (ECL) приобретены у Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Стокгольм, Швеция), тогда как все другие реагенты для электрофореза поступили от BioRad (Ричмонд, Калифорния). Все другие химические реактивы были химически чистыми и приобретены у Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Клеточная культура

Человеческая злокачественная меланомная клеточная линия A2058 была любезно предоставлена László Kopper из Department of Pathology and Experimental Cancer Research [Отдел патологии и экспериментального исследования рака], Университет Земмельвейс, Будапешт, Венгрия. Клетки A2058 поддерживались в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 5 ед/мл пенициллина, 0,5 ед/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина.

HTB63 (также названная как HT144) человеческая злокачественная меланомная клеточная линия приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC; LGC Promochem AB, Boras, Швеция) и поддерживалась в среде Мак-Коя 5A с добавлением 10% FBS, 5 ед/мл пенициллина, 0,5 ед/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина.

Человеческие клетки карциномы молочной железы, MCF7 (положительный контроль экспрессии Wnt-5a) выращивали в DMEM с добавлением 10% FBS, 5 ед/мл пенициллина, 0,5 ед/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина. Все клеточные культуры поддерживались при 37°C в увлажненной атмосфере 5% двуокиси углерода.

Вестерн-блот

Клетки прямо лизировали в 1X буфере Лэммли, содержащем DTT, и кипятили в течение 10 минут, или лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 1% Тритон X-100, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 20% глицерин, 1 мМ Na3VO4 и протеазные ингибиторы (20 мкг/мл апротинина, 1 мкг/мл лейпептина, 2,5 мМ бензамидина и 2 мМ пефаблока). Клетки, обработанные лизирующим буфером, центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут при 4°C. Содержание белка в каждом образце определяли и регулировали обеспечением равной нагрузки белка на каждой дорожке. Затем добавляли 50 мМ DTT и 5x концентрированный буфер Лэммли и образцы кипятили в течение 5 минут. Образцы разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) и впоследствии переносили на мембраны PVDF. Для иммуноблоттинга мембраны блокировали в PBS с добавлением 0,2% Твин 20 и 1% обезжиренного молока для Wnt-5a или 3% обезжиренного молока в случае всех других антител в течение 1 часа. Затем мембраны инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°C с индикаторным первичным Ab (1:25000 для β-актина; 1:1000 для Wnt-5a и 1:1000 для TGF-β1) в 2% обезжиренном молоке или 1,5% BSA. После экстенсивного промывания в PBS с 0,2% Твина мембраны инкубировали в течение 1 часа с конъюгированным с пероксидазой хрена вторичным Ab в 2% обезжиренном молоке или 1,5% BSA и снова экстенсивно промывали. Наконец, Ab-антигенные комплексы определяли с использованием усиленной хемилюминесценции. Для повторного зондирования мембраны освобождали с использованием раствора для стриппинга Reblot Strong solution от Chemicon International (Темекула, Калифорния). Показано, что Вестерн-блоты являлись репрезентативными в по меньшей мере трех независимых экспериментах.

ОТ-ПЦР

Экстракцию РНК выполняли с использованием TRIzol® от Invitrogen в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрацию РНК измеряли с использованием нанокапельного спектрофотометра ND-1000 (Bio-Rad (Геркулес, Калифорния). Перед обратной транскрипцией РНК обрабатывали 1 ед/мл ДНКазыI (Invitrogen). кДНК синтезировали с использованием случайных гексамеров от Fermentas (Хельсингборг, Швеция), 1-2 мкг общей РНК с использованием обратной транскриптазы (RT) M-MuLV [вирус лейкоза мышей Молони] (Fermentas, Хельсингборг, Швеция). Для ПЦР-реакций в объеме 50 мкл использовали 5 мкл RT реакции в 1X Taq полимеразном буфере (75 мМ Трис-HCl, 20 мМ [NH4]2SO4, 0,01% Твин 20) с добавлением 2,5 мМ MgCl2, 200 мМ дНТФ, 1 мкМ каждого праймера и 1 единицу ДНК-полимеразы Taq (Fermentas, Хельсингборг, Швеция). ПЦР-праймеры были следующими: Wnt-5a прямой: 5'-GGATTGTTAAACTCAACTCTC-3' (SEQ. ID. NO: 16);

Wnt-5a обратный: 5'-ACACCTCTTTCCAAACAGGCC-3' (SEQ. ID. NO: 17); β-актин прямой: 5'-TTCAACACCCCAGCCATGTA-3' (SEQ. ID. NO: 18);

β-актин обратный: 5'-TTGCCAATGGTGATGACCTG-3' (SEQ. ID. NO: 19); Frizzled-2 прямой: 5'-ACATCGCCTACAACCAGACC-3' (SEQ. ID. NO: 20); и

Frizzled-2 обратный: 5'-CTCGCCCAGAAACTTGTAGC-3' (SEQ. ID. NO: 21);

Frizzled-5 прямой: 5'-ACACCCGCTCTACAACAAGG-3' (SEQ. ID. NO: 22); и

Frizzled-5 обратный: 5'-CGTAGTGGATGTGGTTGTGC-3' (SEQ. ID. NO: 23). Реакции ОТ-ПЦР, показанные на Фиг. 1, являются репрезентативными в по меньшей мере трех независимых экспериментах.

Клеточная адгезия

Клетки, предварительно обработанные и стимулированные, как описано ниже, разъединяли Версеном и ресуспендировали в бессывороточной среде RPMI и образцы, содержащие 30000 клеток из каждой обработанной группы, добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Клеткам затем обеспечивали прилипание в течение 60 минут при 37°C в увлажненной атмосфере 5% двуокиси углерода, после чего неприлипшие клетки смывали с использованием PBS. Прилипшие [адгезивные] клетки фиксировали в 1% глутаральдегиде в течение 10 минут при комнатной температуре и затем окрашивали с использованием 0,5% кристаллвиолета в 20% метаноле в течение 10 минут. Наконец краситель из каждой группы клеток растворяли в 50% уксусной кислоте. Количество растворенного красителя из каждой лунки затем измеряли в планшете-ридере Fluostar [спектрофотометр для прочтения планшетов] (BMG Lab Technologies GmbH, Оффенберг, Германия) при 544 нм. Индивидуальные образцы от каждого отдельного эксперимента анализировали четырехкратно и накопленные данные основывались на 5 отдельных экспериментах. Результаты иллюстрированы на Фиг. 4.

A) Меланомные клетки A2058 стимулировали указанными концентрациями Wnt-5a, разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде в присутствии или в отсутствие рекомбинантного Wnt-5a в указанных концентрациях. Клеткам затем обеспечивали прилипание в 96-луночном планшете. По истечении периода 60 минут неприлипшие клетки смывали, в то время как прилипшие клетки окрашивали и определяли их число. Это число представлено как процент контрольной (без Wnt-5a) стимуляции (Фиг. 4A).

B) Меланомные клетки A2058 культивировали до слияния в 12-луночном планшете, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду, не содержащую (закрашенные кружки) или содержащую 0,2 мкг/мл Wnt-5a (незакрашенные квадраты) (Фиг. 4B).

C) Меланомные клетки A2058 культивировали до слияния в 12-луночном планшете, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду в отсутствие любой добавки (закрашенный кружок), присутствии 0,2 мкг/мл Wnt-5a одного (незакрашенные квадраты) или в присутствии 0,2 мкг/мл Wnt-5a со 100 мкМ Box5 (незакрашенный треугольник) (Фиг. 4C).

D) Меланомные клетки HTB63 культивировали до слияния в 12-луночной чашке, после чего росчерком вносили в каждую лунку, среду заменяли на свежую бессывороточную среду (закрашенный кружок), кондиционированную среду (незакрашенные квадраты) или кондиционированную среду с добавлением 100 мкМ Box5 (незакрашенный треугольник). Для регистрации изменений в миграции на панелях B-D картину учитывали с каждого росчерка/лунки из одной и той же области клеток спустя 0, 16, 24, 40 или 48 часов, и ранение-заживление выявляли как процент закрытия раневой поверхности (Фиг. 4D).

E) До начала каждого эксперимента клетки A2058 (шесть столбцов слева) и клетки HTB63 (два столбца справа) разъединяли Версеном и ресуспендировали как одиночные клетки в бессывороточной среде. Клетки предварительно