Моноклональные антитела, которые связываются с hgm-csf, и содержащие их композиции медицинского назначения

Моноклональные антитела, которые связываются с hgm-csf, и содержащие их композиции медицинского назначения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые связываются с человеческим колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (обозначен также как «hGM-CSF») и нейтрализуют активность hGM-CSF, к композициям, которые содержат одно или несколько указанных моноклональных антител, и способам применения указанных моноклональных антител и композиций.

Предпосылки создания изобретения

Установлено, что колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) представляет собой гуморальный фактор, который ускоряет пролиферацию находящихся в костном мозге клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и ускоряет формирование колоний гранулоцитов и макрофагов in vitro.

В настоящее время известно, что GM-CSF представляет собой стимулирующий фактор в широком разнообразии типов клеток. Он индуцирует дифференцировку и пролиферацию линий гранулоцитов-макрофагов клеток крови, усиливает функции антигенпрезентирующих клеток, поддерживает функции некоторых типов эпителиальных клеток и индуцирует функции альвеолярных макрофагов (например, повышает катаболизм сурфактанта, бактерицидную функцию и экспрессию Fc-рецептора) (The Cytokine Handbook, 4-ое изд., под ред. Thomson А. и др., изд-во Academic Press, 2003). Известно, что GM-CSF вызывает различные болезни, включая: 1) аллергические заболевания, такие как астма, атопия и полиноз, 2) отторжение трансплантата и реакцию «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и 3) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

Например, для человеческого GM-CSF (hGM-CSF) характерна сверхэкспрессия в легких страдающих аллергией индивидуумов и в суставах страдающих ревматоидным артритом пациентов; сверхэкспрессия мРНК hGM-CSF обнаружена в коже страдающих аллергией индивидуумов. Описано также, что выживаемость моноцитов, представляющих собой индуцирующие воспаление клетки при атопическом дерматите, повышается в результате производства GM-CSF (Bratton D.L. и др., Granulocyte macrophage colonystimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis. J. Clin. Invest., 95, 1995, cc.211-218).

Кроме того, установлено, что GM-CSF стимулирует пролиферацию лейкозных клеток. Таким образом, считается, что GM-CSF является фактором, вызывающим лейкоз.

Существует необходимость в разработке путей лечения заболеваний и состояний, обусловленных человеческим GM-CSF. Одним из путей терапии указанных заболеваний и состояний является связывание hGM-CSF и ингибирование его биологической активности. Для этой цели можно применять, например, моноклональные антитела к hGM-CSF, которые обладают повышенной аффинностью и достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF, но не индуцируют иммунологическую реакцию.

Однако описанные к настоящему времени ингибирующие антитела к hGM-CSF не обладают достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. Кроме того, очень вероятно, что доступные в настоящее время моноклональные антитела к hGM-CSF могут индуцировать нежелательный иммунный ответ у реципиентов. Поликлональное антитело и моноклональное антитело, как правило, получают из экспериментальных животных, таких как мыши, кролики и козлы. Однако полученные таким путем антитела имеют последовательность, характерную для типа животных, используемых для их получения. Если их вводят людям, то иммунная система человека может распознавать антитела как чужеродные и это может приводить к человеческому гуморальному иммунному ответу на антитело животного происхождения (то есть такое антитело вызывает продуцирование собственных антител организма).

Кроме того, для лечения таких болезней необходимо длительное применение и в результате могут возникать проблемы, связанные с безопасностью, которые могут быть обусловлены небольшим количеством примесей вводимых лекарственных средств. Антитела с более высокой нейтрализующей активностью, чем доступные в настоящее время, могут быть более ценными в качестве терапевтических средств с позиций эффективности, безопасности и расходов на медицинское обслуживание.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится по меньшей мере частично к разработанным при создании изобретения конкретным моноклональным антителам к человеческому GM-CSF, которые отличаются их очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. При создании изобретения неожиданно было установлено, что нейтрализующая активность указанных антител выше, чем можно было бы ожидать на основе их аффинности к связыванию с hGM-CSF. Два из указанных моноклональных антител к hGM-CSF обозначены в настоящем описании как EV1018 и EV1019.

Одним из объектов изобретения являются антитела к hGM-CSF и их фрагменты, связывающие и нейтрализующие hGM-CSF.

Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:

(а) тяжелую цепь, включающую консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и X₂ обозначает G или А,

(II) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(III) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и

(б) легкую цепь, включающую консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(II) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(III) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO:319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L;

и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:

(а) тяжелую цепь, включающую V_H-CDR1, V_H-CDR2 и V_H-CDR3, в которых:

(I) V_H-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SYGMH (SEQ ID NO: 10) и SHAMH (SEQ ID NO: 333),

(II) V_H-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) и VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), и

(III) V_H-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) и EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335); и

(б) легкую цепь, включающую V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, в которых:

(I) V_L-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) и SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),

(II) V_L-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и GKSPAS (SEQ ID NO: 331), и

(III) V_L-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) и STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332), и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.

Например, связывание описанного выше антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с человеческим GM-CSF характеризуется значением K_D, составляющим менее 400 пМ, более предпочтительно значением K_D, составляющим менее 160 пМ.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC₅₀ для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ (например, менее 30 пМ, менее 20 пМ) при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при концентрации, соответствующей ED₈₀, согласно методу, представленному в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄). Тяжелую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183 и 222-245.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая лямбда-цепь может содержать одну или обе из следующих аминокислотных замен: R100G и A153G, которые обозначены относительно последовательности дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения легкую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-37 и 202-221. Легкая цепь может представлять собой легкую лямбда-цепь или легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄), а легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь. В любом из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь может содержать одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164 и L165A, относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, которая несет одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A, а легкая цепь несет одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G и A153G.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO:5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 330-335.

В любом из вариантов осуществления изобретения антитело может включать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄), и легкую цепь, представляющую собой каппа- или лямбда-цепь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать дополнительно сигнальную последовательность, например, представленную в SEQ ID NO: 324, 325 и 326.

Под объем изобретения подпадают последовательности дикого типа, а также их варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент содержит тяжелую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 10, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 11-33, 38-80, и содержит также легкую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 34, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 35-37. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 160, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 161-245, а легкая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 202, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 203-221.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 153-158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 185-200 и 201.

В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152 и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 348, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 349-362 и 363, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 364 или SEQ ID NO: 365.

В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 364. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, как представлено в настоящем описании, отличается тем, что содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9 и SEQ ID NO: 330-335. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно в CDR заменять, изымать путем делеции, встраивать или добавлять одну или несколько аминокислот. Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, может отличаться тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию клеток линии TF-1 примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови.

В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, обладает аффинностью к связыванию с hGM-CSF, для которой характерно значение K_D 4×10^-10 M или ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ). В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело.

Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и векторам, содержащих их. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Одним из вариантов осуществления изобретения является вектор, содержащий ДНК, которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании.

Изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, который содержит ДНК-вектор, предлагаемый в изобретении.

Изобретение относится также к набору, содержащему: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении; и (б) один или несколько контейнеров, содержащих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, предназначенный/предназначенное для применения в медицине.

В изобретении предложены композиции, содержащие антитело к hGM-CSF или его фрагмент, которое/который связывается и нейтрализует hGM-CSF. Указанная композиция может представлять собой фармацевтическую композицию (например, лекарственное средство), которая содержит антитело к hGM-CSF и/или его фрагмент (или их комбинацию) и фармацевтически приемлемый носитель. Под объем изобретения подпадает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное/указанный выше в любом из вариантов осуществления изобретения.

Согласно другим вариантам осуществления изобретения композиция содержит более одного вида антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций, которые все представлены в настоящем описании. Например, композиция может включать также второе выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, в результате композиция содержит более одного (несколько) вида/типа антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, которые все связываются с GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из нескольких антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, связывающихся с hGM-CSF, представляет собой полипептид, выбранный из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-80, 152-245, 320-323 и 348-365.

Изобретение относится также к композиции медицинского назначения, пригодной для применения с целью лечения заболевания, которое вызывается hGM-CSF, содержащей: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в любом варианте осуществления изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Примерами болезней, вызываемых избыточным производством hGM-CSF, являются: а) аллергические заболевания, такие как астма, атония и полиноз (аллергический ринит; сенная лихорадка); б) отторжение трансплантата и реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD), и в) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

Указанные композиции или ветеринарная лекарственная композиция может содержать целый ряд видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических для одного конкретного антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция отличается тем, что входящие в ее состав несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, можно выбирать из представленных ниже в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делении, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Такая композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция может ингибировать пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при применении каждой из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.

Одним из объектов изобретения является также набор, содержащий любую из композиций, представленных в настоящем описании, и один или несколько контейнеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также инструкцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также этикетку, инструкцию или включает и этикетку, и инструкцию.

Изобретение относится также к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, или композиции, которая содержит указанное антитело или фрагмент. Любое представленное в настоящем описании антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент или композицию можно применять для производства или получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание или нарушение выбирают из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз.

Для применения согласно указанным показаниям антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.

Одним из объектов изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, представленных в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Например, заболевание или нарушение может представлять собой хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз или рассеянный склероз. Указанное применение предусматривает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или содержащей его композиции, предлагаемых в изобретении, индивидууму, в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.

Изобретение относится также к способам лечения индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, которое ассоциировано с аномальной экспрессией hGM-CSF, с помощью антитела к hGM-CSF или его фрагмента. Способ заключается в том, что вводят индивидууму, у которого диагностировано или который имеет риск развития заболевания или нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией) hGM-CSF, композицию, которая содержит антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, нейтрализующее/нейтрализующий активность hGM-CSF in vivo, в количестве, достаточном для достижения по меньшей мере одного терапевтического действия на индивидуума.

Изобретение относится также к способу повышения опосредуемой антителом к hGM-CSF нейтрализующей активности в отношении hGM-CSF, отличающемуся тем, что вводят одновременно несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения два или большее количество антител или их антигенсвязывающих участков выбирают из указанных в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Объектами изобретения являются способы повышения активности, отличающиеся тем, что два или несколько типов антител или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при использовании каждого из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.

Изобретение относится также к эпитопу hGM-CSF, который распознается антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Эпитоп hGM-CSF представляет собой полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2 и 3, где эпитоп распознается антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, представленным в настоящем описании, и где полипептидные последовательности представляют собой прерывистый сегмент hGM-CSF (представленный в SEQ ID NO: 1). Эпитоп представляет собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, в котором эпитоп содержит все или часть аминокислотных остатков 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1), и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержим 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.

Изобретение относится также к применению эпитопа, предлагаемого в изобретении. Изобретение относится также к способам скрининга и/или идентификации молекулы, специфически связывающейся с эпитопом, представленным в настоящем описании, который распознается антителами и антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются способы идентификации молекулы, которая связывается с эпитопом, представленным в настоящем описании, заключающиеся в том, что (I) осуществляют скрининг биологического образца или пептидной библиотеки с помощью зонда, который содержит эпитоп; (II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и (III) идентифицируют молекулу. Молекула, которая связывается с эпитопом, может представлять собой, например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является зонд, включающий также выявляемый маркер. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что зонд является иммобилизованным.

Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментов. Изобретение относится также к способам получения в клетке-хозяине моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который связывается с hGM-CSF, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность. Способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:

(I) получают клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, где:

(а) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А,

(б) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(в) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G,

(г) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(д) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(е) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L;

(II) экспрессируют ДНК в клетке-хозяине; и

(III) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК и производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна ДНК кодирует тяжелую цепь или ее участок и легкую цепь или ее участок, где тяжелую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362 и 363, и легкую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 34-37, 184-221, 364 и 365.

Указанный выше процесс может включать также выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Указанный выше процесс может включать также получение композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретение относится также к векторам, содержащим ДНК, которая кодирует по меньшей мере участок антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании. Под объем изобретения подпадает также клетки-хозяева, экспрессирующие вектор.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую V_H-CDR1, V_H-CDR2 и а V_H-CDR3, где:

V_H-CDR1 представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333),

V_H-CDR2 представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и

V_H-CDR3 представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, где

V_L-CDR1 представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),

V_L-CDR2 представляет собой GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) или GKSPASG (SEQ ID NO: 331) и

V_L-CDR3 представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335. Выделенная ДНК может обладать способностью гибридизоваться в строгих условиях с ДНК, описанной выше. Еще одним объектом изобретения являются векторы, включающие любую указанную ДНК, а также клетки-хозяева, которые экспрессируют рекомбинантный(ые) вектор(ы).

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - блок-схема выделения продуцирующих антитела клонов клеток;

на фиг.2 - схема анализа аффинности моноклональных антител к GM-CSF;

на фиг.3 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию дендритных клеток периферической крови в присутствии GM-CSF;

на фиг.4 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);

на фиг.5 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);

на фиг.6 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);

на фиг.7 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);

на фиг.8 - два графика, демонстрирующие ингибирование в зависимости от дозы в присутствии: человеческого GM-CSF (8А) и GM-CSF макака-резус (8Б);

на фиг.9А - столбиковая диаграмма, демонстрирующая активность миелопероксидазы (МРО), измеренную в дебрисе бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) из организма мышей, подвергнутых воздействию сигаретного дыма, -CS: мышей обрабатывали наполнителем (300 мкл наполнителя i.p. в день 1 и 3 без воздействия сигаретного дыма. +CS, изотип AT: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела соответствующего изотипа в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. +CS, антитело к GM-CSF: мышей обраба