Мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных кислот

Мультизимы и их использование в получении полиненасыщенных жирных кислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка провозглашает приоритет предварительной заявки США № 60/909790 от 3 апреля 2007 года и предварительной заявки США № 61/027898 от 12 февраля 2008 года, на которые в данном тексте сделаны полные ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к области биотехнологии. Более конкретно, данное изобретение касается полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют мультизимы, и их использования в синтезе длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Важность ПНЖК неоспорима. Например, некоторые ПНЖК являются важными биологическими компонентами здоровых клеток и признаны как: «незаменимые» жирные кислоты, которые не могут быть синтезированы de novo в млекопитающих, и вместо этого должны получаться или через пищу или путем дополнительного удлинения и десатурации линолевой кислоты (ЛК; 18:2 омега-6) или α-линоленовой кислоты (АЛК; 18:3 омега-3); составляющие плазматических клеточных мембран, где они могут быть найдены в таких формах как фосфолипиды или триацилглицерины; необходимые для соответствующего развития (особенно в развитии мозга младенца) и для формирования и восстановления ткани; и, предшественники нескольких биологически активных эйкозаноидов, важных для млекопитающих (например, простациклинов, эйкозаноидов, лейкотриенов, простагландинов). Кроме того, значительное потребление длинноцепочечных омега-3 ПНЖК продуцирует кардиоваскулярные защитные эффекты (Dyerberg et al., Amer. J. Clin. Nutr. 28:958-966 (1975); Dyerberg et al., Lancet. 2(8081):117-119 (1978); Shimokawa, H., World Rev. Nutr. Diet 88:100-108 (2001); von Schacky et al., World Rev. Nutr. Diet 88:90-99 (2001)). Многочисленые другие исследования свидетельствуют о значительной пользе для здоровья, которую приносит использование омега-3 и/или омега-6 ПНЖК против разнобразных симптомов и болезней (например, астмы, псориаза, экземы, диабета, рака).

В настоящее время исследуется множество различных хозяев, включая растения, водоросли, грибы и дрожжи, как средств для промышленного производства ПНЖК путем использования многочисленных разнообразных попыток. Хотя производительные способности организмов-хозяев в отношении природных ПНЖК иногда существенны для данной методологии, генная инженерия также показала, что природные способности некоторых хозяев (даже тех, которым присуща природная ограниченная способность к производству ЛК и АЛК жирных кислот) могут быть значительно изменены в плане повышения уровня производства различных длинноцепочечных омега-3/омега-6 ПНЖК. Независимо от того, является ли этот эффект результатом природных способностей или рекомбинантной технологии, арахидоновая кислота (АРК; 20:4 омега-6), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК; 20:5 омега-3), и докозагексаеновая кислота (ДГК; 22:6 омега-3) требуют экспрессии либо дельта-9-элонгаза/дельта-8-десатуразного пути (который действует в некоторых организмах, таких как вид эвгленоидных, и который характеризуется выработкой эйкозадиеновой кислоты (ЭДК; 20:2 омега-6) и/или эйкозатриеновой кислоты (ЭТрК; 20:3 омега-3)) или дельта-6-десатураза/дельта-6-элонгазного пути (который находят, преимущественно, в водорослях, мхах, грибах, нематодах и человеческом организме, и который характеризуется выработкой гамма-линоленовой кислоты (ГЛК; 18:3 омега-6) и/или стеаридоновой кислоты (СТК; 18:4 омега-3)) (ФИГ.1). Дельта-6-элонгаза известна также как C_18/20-элонгаза.

Идентифицированные до сих пор дельта-8-десатуразные ферменты обладают способностью к превращению как ЭДК в дигомо гамма-линоленовую кислоту (ДГЛК (известную также как ГГЛК); 20:3, n-6) так и ЭТрК в эйкозатетраеновую кислоту (ЭТК; 20:4, n-3). АРК и ЭПК потом синтезируются из ДГЛК и ЭТК, соответственно, по реакции с дельта-5-десатуразой. Однако синтез ДГК требует последующей экспрессии дополнительной C_20/22-элонгазы и дельта-4-десатуразы. Большинство идентифицированных до сих пор C_20/22-элонгаз обладают главной способностью к превращению ЭПК в ДПК, и вторичной активностью в отношении превращения арахидоновой кислоты (АРК; 20:4 омега-6) в докозатетраеновую кислоту (ДТК; 22:4 омега-6), тогда как большинство идентифицированных до сих пор дельта-4-десатуразных ферментов обладают главной способностью к превращению ДПК в ДГК, и вторичной активностью в отношении превращения докозатетраеновой кислоты (ДТК; 22:4 омега-6) в ω-6 докозапентаеновую кислоту (ДПКn-6; 22:5 омега-6).

Исходя из той роли, которую играют C_20/22-элонгазный и дельта-4-десатуразный ферменты в синтезе ДГК, были предприняты значительные усилия для идентификации и анализа этих ферментов из различных источников. Как таковые, многочисленные C_20/22-элонгазы были раскрыты как в открытой так и патентной литературе (например, Pavlova sp. CCMP459 (номер доступа GenBank AAV33630), Ostreococcus tauri (номер доступа GenBank AAV67798) и Thalassiosira pseudonana (номер доступа GenBank AAV67800)). Подобно этому, были раскрыты следующие дельта-4-десатуразы: Euglena gracilis (SEQ ID NO:13; номер доступа GenBank AAQ19605; Meyer et al., Biochemistry, 42(32):9779-9788 (2003)); Thalassiosira pseudonana (SEQ ID NO:29; номер доступа GenBank AAX14506; Tonon et al., FEBS J., 272(13):3401-3412 (2005)); Thraustochytrium aureum (SEQ ID NO:27; номер доступа GenBank AAN75707); Thraustochytrium sp. (номер доступа GenBank CAD42496; патент США № 7087432); Schizochytrium aggregatum (SEQ ID NO:28; PCT публикация № WO 2002/090493); Pavlova lutheri (номер доступа GenBank AAQ98793); and Isochrysis galbana (SEQ ID NO:30; номер доступа GenBank AAV33631; Pereira et al., Biochem. J., 384(2):357-366 (2004); PCT публикация № WO 2002/090493)].

Правопреемник заявителя имеет ряд патентных заявок, которые касаются производства ПНЖК в жировых дрожжах (т.е. Yarrowia lipolytica), включая, например: патенты США №№ 7238482 и 7125672; заявка США № 11/265761 (от 2 ноября 2005 года); заявка США № 11/264784 (от 1 ноября 2005 года); заявка США № 11/264737 (от 1 ноября 2005 года).

Подобным образом, PCT публикация № WO 2004/071467 (опубликована 26 августа 2004 года) касается производства ПНЖК в растениях, тогда как РСТ публикация № WO 2004/071178 (опубликована 26 августа 2004 года) касается аннексиновых промоторов и их использования в экспрессии трансгенов в растениях. Обе являются совместными заявками правопреемника заявителя, которые находятся на рассмотрении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается мультизима, который включает отдельный полипептид, обладающий по меньшей мере двумя независимыми и раздельными ферментативными активностями.

Во втором варианте ферментативные активности данного мультизима могут выбираться из группы, которая состоит из элонгазы жирных кислот, десатуразы жирных кислот, ацилтрансфераз, ацил CoA синтаз и тиоэстераз. Более конкретно, ферментативные активности могут включать по меньшей мере одну элонгазу жирных кислот, связанную с по меньшей мере одной десатуразой жирных кислот.

В третьем варианте данный мультизим может включать первую ферментативную активность, связанную со второй ферментативной активностью, и указанная связь выбирается из группы, которая состоит из полипептидной связи, SEQ ID NO:198 (линкер EgDHAsyn1), SEQ ID NO:200 (линкер EgDHAsyn2), SEQ ID NO:235 (1 линкер EaDHAsyn), SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:472, и SEQ ID NO:504.

В четвертом варианте изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего ДГК синтазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как это изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В пятом варианте данное изобретение касается полинуклеотида, кодирующего полипептид, который обладает ДГК синтазной активностью, где нуклеотидная последовательность включает SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410.

В шестом варианте данное изобретение касается полипетида данного изобретения, обладающего ДГК синтазной активностью, где аминокислотная последовательность данного полиппетида включает SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, или SEQ ID NO:97.

В седьмом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего C₂₀-элонгазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C₂₀-элонгазы, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202 (EgDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:204 (EgDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:231 (EaDHAsyn1 домен C_20-элонгазы), SEQ ID NO:232 (EaDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы) или SEQ ID NO:233 (EaDHAsyn3 домен C₂₀-элонгазы);

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C₂₀-элонгазы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C₂₀-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C₂₀-элонгазы);

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью C₂₀-элонгазы, где данный нуклеотид гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C₂₀-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C₂₀-элонгазы); или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В восьмом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего дельта-4-десатуразу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает дельта-4-десатуразной активностью, где данный полипептид имеет по меньшей мере 80% аминокислотную идентичность, основываясь на методе группировки Clustal V, при сравнении с аминокислотной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, или SEQ ID NO:408;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности, основываясь на сравнительном анализе первичной структуры согласно программе BLASTN, при сравнении с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID No:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает активностью дельта-4-десатуразы, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как изложено в SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407; или

(d) комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В девятом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, который кодирует ДГК синтазу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, или SEQ ID NO:410.

В десятом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего C₂₀-элонгазу, указанный фермент полинуклеотид кодирует C₂₀-элонгазу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (EgDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы, SEQ ID NO:206 (EgDHAsyn1* домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:203 (EgDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:227 (EaDHAsyn1 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:228 (EaDHAsyn2 домен C₂₀-элонгазы), SEQ ID NO:229 (EaDHAsyn3 домен C₂₀-элонгазы) или SEQ ID NO:230 (EaDHAsyn4 домен C₂₀-элонгазы).

В одиннадцатом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего дельта-4-десатуразу, указанный полинуклеотид включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID No:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405, или SEQ ID NO:407.

В двенадцатом варианте данное изобретение касается рекомбинантного конструкционного элемента, который включает любой из выделенных полинуклеотидов данного изобретения, связанный оперативно с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью.

В тринадцатом варианте данное изобретение касается клетки-хозяина, которая содержит в своем геноме рекомбинантный конструкционный элемент данного изобретения. Более конкретно, клетка-хозяин представляет собой рекомбинантную микробную клетку-хозяина, включающую мультизим изобретения, где первой ферментативной активностью является дельта-9-элонгаза, и второй ферментативной активностью является дельта-8-десатураза. В другом аспекте первая ферментативная активность представляет собой С₂₀-элонгазу, и вторая ферментативная активность представляет собой дельта-4-десатуразу.

В четырнадцатом варианте данное изобретение касается трансформированного вида Yarrowia, включающего рекомбинантный конструкционный элемент изобретения.

В пятнадцатом варианте данное изобретение касается способа трансформирования клетки, который включает трансформацию клетки рекомбинантным конструкционным элементом данного изобретения и селекцию этих клеток, трансформированных посредством указанного рекомбинантного конструкционного элемента.

В шестнадцатом варианте данное изобретение касается способа получения трансформированного растения, который включает трансформацию растительной клетки любым из полинуклеотидов данного изобретения и восстановление растения из трансформированной растительной клетки.

В семнадцатом варианте данное изобретение касается способа получения дрожжей, который включает трансформацию дрожжевой клетки любым из полинуклеотидов данного изобретения и выращивание дрожжей из трансформированной дрожжевой клетки.

В восемнадцатом варианте данное изобретение касается растения, которое содержит в своем геноме рекомбинантный конструкционный элемент изобретения. Также представляют интерес семена, полученные от таких растений, масло, полученное из таких семян, пища или корм, которые содержат такое масло, и напиток, который содержит масло данного изобретения.

В девятнадцатом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует C₂₀-элонгазу, как представлено в SEQ ID NO:183, где по меньшей мере 147 кодонов кодон-оптимизировано для экспрессии в Yarrowia.

В двадцатом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует C₂₀-элонгазу, как представлено в SEQ ID NO:188, где по меньшей мере 134 кодона кодон-оптимизированы для экспрессии в Yarrowia.

В двадцать первом варианте данное изобретение касается изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует дельта-4-десатуразный фермент, как представлено в SEQ ID NO:192, где по меньшей мере 285 кодонов кодон-оптимизированы для экспрессии в Yarrowia.

В двадцать втором варианте данное изобретение касается способа получения мультизима, который включает:

(a) связывание первого полипетида с по меньшей мере вторым полипептидом, где каждый полиппетид обладает независимой и раздельной ферментативной активностью; и

(b) оценку продукта стадии (a) в отношении независимой и раздельной ферментативных активностей.

В двадцать третьем варианте данное изобретение касается способа изменения жирнокислотного профиля масличного растения, который включает:

a) трансформацию клетки масличного растения посредством рекомбинантного конструкционного элемента данного изобретения;

b) восстановление растения из трансформированной клетки масличного растения стадии (a), где данное растение имеет измененный жирнокислотный профиль.

В двадцать четвертом варианте данное изобретение касается выделенного полинуклеотида, кодирующего ДГЛК синтазу, включая:

(a) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГЛК синтазной активностью, где данный полипептид представлен в SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:515, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518, или SEQ ID NO:519;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который обладает ДГЛК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495, или SEQ ID NO:496;

(c) нуклеотидную последовательность, кодирующую полиппетид, котрый обладает ДГЛК синтазной активностью, где данная нуклеотидная последовательность гибридизуется при жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495, или SEQ ID NO:496; или

комплемент нуклеотидной последовательности (a), (b) или (c), где данные комплемент и нуклеотидная последовательность состоят из одинакового количества нуклеотидов и являются на 100% комплементарными.

В двадцать пятом варианте данное изобретение касается способа превращения линолевой кислоты в дигомо гамма-линоленовую кислоту, которая включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГЛК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-9-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-8-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между дельта-9-элонгазой и дельта-8-десатуразой; и

ii) источник линолевой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется дигомо гамма-линоленовая кислота.

В двадцать шестом варианте данное изобретение касается способа превращения α-линоленовой кислоты в эйкозатриеновую кислоту, который включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГЛК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-9-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-8-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между дельта-9-элонгазой и дельта-8-десатуразой; и

ii) источник α-линоленовой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется эйкозатриеновая кислота.

В двадцать седьмом варианте данное изобретение касается способа превращения эйкозапентаеновой кислоты в докозагексаеновую кислоту, котрый включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий C₂₀-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-4-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между C₂₀-элонгазой и дельта-4-десатуразой; и

ii) источник ейкозапентаеновой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется докозагексаеновая кислота.

В двадцать восьмом варианте данное изобретение касается способа превращения арахидоновой кислоты в докозапентаеновую кислоту, который включает:

a) предоставление рекомбинантной микробной клетки-хозяина, которая включает:

i) ДГК синтазу, включая:

1) по меньшей мере один полипептид, кодирующий C₂₀-элонгазу;

2) по меньшей мере один полипептид, кодирующий дельта-4-десатуразу; и

3) полипептидный линкер;

где данный линкер помещен между C₂₀-элонгазой и дельта-4-десатуразой; и

ii) источник арахидоновой кислоты; и

b) выращивание клетки-хозяина (a) при условиях, в которых образуется докозапентаеновая кислота.

В двадцать девятом варианте данное изобретение касается способа идентификации полипептида, обладающего улучшенной активностью дельта-4-десатуразы, который включает:

a) предоставление дельта-4-десатуразного полипептида дикого типа, выделенного из Euglena anabena, обладающего базисной активностью дельта-4-десатуразы;

b) усечение полипептида (a) дикого типа на приблизительно от 1 до приблизительно 200 аминокислот для создания усеченного мутантного полипептида, обладающего активностью дельта-4-десатуразы, которая повышена по сравнению с базисной активностью дельта-4-десатуразы.

В тридцатом варианте данное изобретение касается микробной клетки-хозяина, которая продуцирует полиненасыщенную жирную кислоту и экспрессирует полипептиды, кодирующие ферменты, на следующем последовательном пути:

1) дельта-9-десатураза,

2) дельта-12-десатураза,

3) дельта-9-элонгаза,

4) дельта-8-десатураза,

5) дельта-5-десатураза,

6) дельта-17-десатураза,

7) C_20/22-элонгаза, и

8) дельта-4-десатураза;

где данные полипептиды включают по меньшей мере один мультизим, слияние, включая слияние между по меньшей мере одной смежной ферментной парой.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ДЕПОЗИТЫ

Следующие биологические материалы сохраняются в Американском собрании типовых культур (АСТК), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, и имеют следующие обозначения, номера доступа и даты вложения (Таблица 1).

ТАБЛИЦА 1АСТК депозиты
Описание	Номер доступа	Дата вложения
Плазмида pKR72	АСТК PTA-6019	28 мая 2004 г.
Yarrowia lipolytica Y4128	ACTK PTA-8614	23 августа 2007 г.
Yarrowia lipolytica Y4127	АСТК РТА-8802	29 ноября 2007 г.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ И ЛИСТИНГОВ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данное изобретение может быть лучше понято из последующего подробного описания и сопроводительных рисунков, и листинга последовательностей, которые образуют часть данной заявки.

ФИГ.1 представляет собой репрезентативный омега-3 и омега-6 жирнокислотный путь, представленный для превращения миристиновой кислоты через разные интермедиаты в ДГК.

ФИГ.2 изображает группировку Clustal W между участком кодирующей последовательности EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:21), кДНК последовательностью Euglena gracilis дельта-40-десатуразы (SEQ ID NO:23) (номер доступа НЦБИ AY278558 (GI 33466345), локус AY278558, Meyer et al., Biochemistry 42(32):9779-9788 (2003)), и кодирующей последовательностью Euglena gracilis дельта-4-десатуразы (SEQ ID NO:24) (Meyer et al., supra).

ФИГ.3A и 3B изображают группировку Clustal W между аминокислотной последовательностью EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12), EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22), и EgC₂₀elo1 (SEQ ID NO:6).

ФИГ.4A и 4B изображают группировку Clustal W N-конца EgDHAsyn1 (SEQ ID NO:12) и N-конца EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) ch EgC₂₀elo1 (SEQ ID NO:6), Pavlova sp. CCMP459 C₂₀-PUFA Elo (SEQ ID NO:2), Ostreococcus tauri ПНЖК элонгаза 2 (SEQ ID NO:25) (номер доступа НЦБИ AAV67798 (GI 55852396), локус AAV67798, CDS AY591336; Meyer et al., J. Lipid Res. 45(10):1899-1909 (2004)), и Thalassiosira pseudonana ПНЖК элонгаза 2 (SEQ ID NO:26) (номер доступа НЦБИ AAV67800 (GI 55852441), локус AAV67800, CDS AY591338; Meyer et al., J. Lipid Res. 45(10):1899-1909 (2004)).

ФИГ.5A , 5B, 5C и 5D изображают группировку Clustal W C-конца EgDHAsyn1 (EgDHAsyn1_CT; аминокислоты 253-793 SEQ ID NO:12; N-конец EgDHAsyn1 не показан и обозначен “…”) и C-конца EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_CT; аминокислоты 253-793 SEQ ID NO:22, N-конец EgDHAsyn2 не показан и обозначен “…”) с Euglena gracilis дельта-4-десатуразы жирных кислот (SEQ ID NO:13), Thraustochytrium aureum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:27) (номер доступа НЦБИ AAN75707(GI 25956288), локус AAN75707, CDS AF391543), Schizochytrium aggregatum дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:28) (PCT публикация № WO 2002/090493), Thalassiosira pseudonana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:29) (номер доступа НЦБИ AAX14506 (GI 60173017), локус AAX14506, CDS AY817156; Tonon et al., FEBS J. 272 (13):3401-3412 (2005)), и Isochrysis galbana дельта-4-десатуразой (SEQ ID NO:30) (номер доступа НЦБИ AAV33631 (GI 54307110), локус AAV33631, CDS AY630574; Pereira et al., Biochem. J., 384(2):357-366 (2004) и PCT публикация № WO 2002/090493).

ФИГ.6 изображает группировку внутренних фрагментов EgDHAsyn1 (EgDHAsyn1_ NCT; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:12) и EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_NCT; аминокислот 253-365 SEQ ID NO:22), связывающую как участок C₂₀-элонгазы, так и дельта-4-десатуразный домен (основываясь на гомологии), с C-концами C₂₀-элонгаз (EgC₂₀elo1_CT, аминокислот 246-298 SEQ ID NO:6; PavC20elo_CT, аминокислот 240-277 SEQ ID NO:2; OtPUFAelo2_CT, аминокислот 256-300 SEQ ID NO:25; TpPUFAelo2_CT, аминокислот 279-358 SEQ ID NO:26) и N-концы дельта-4-десатураз (EgD4_NT, аминокислот 1-116 SEQ ID NO:13; TaD4_NT, аминокислот 1-47 SEQ ID NO:27; SaD4_NT, аминокислот 1-47 SEQ ID NO:28; TpD4_NT, аминокислот 1-82 SEQ ID NO:29; IgD4_NT, аминокислот 1-43 SEQ ID NO:30).

ФИГ.7 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY115 (см. также SEQ ID NO:33); (B) Yarrowia lipolytica Gateway® дестинационный вектор pBY1 (см. также SEQ ID NO:34); (C) Yarrowia lipolytica Gateway® дестинационный вектор pY159 (см. также SEQ ID NO:38); и (D) pBY-EgC₂₀elo1 (см. также SEQ ID NO:39).

ФИГ.8 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY132 (см. также SEQ ID NO:40); (B) pY161 (см. также SEQ ID NO:41); (C) pY164 (см.также SEQ ID NO:42); и (D) pY141 (см. также SEQ ID NO:49).

ФИГ.9 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY143 (см. также SEQ ID NO:52); (B) pY149 (см. также SEQ ID NO:55); (C) pY150 (см. также SEQ ID NO:62); и (D) pY156 (см. также SEQ ID NO:64).

ФИГ.10 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY152 (см. также SEQ ID NO:67); (B) pY157 (см. также SEQ ID NO:69); (C) pY153 (см. также SEQ ID NO:72); и (D) pY151 (см. также SEQ ID NO:76).

ФИГ.11 представляет собой карту pY160 (см. также SEQ ID NO:77).

ФИГ.12 представляет хроматограмму липидного профиля Euglena anabaena клеточного экстракта, как описано в Примерах.

ФИГ.13A, 13B и 13C изображают группировку Clustal W аминокислотных последовательностей для EaDHAsyn1 (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97), и EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98).

ФИГ.14 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pY165 (см. также SEQ ID NO:99); (B) pY166 (см. также SEQ ID NO:100); (C) pY167 (см. также SEQ ID NO:101); и (D) pY168 (см. также SEQ ID NO:102).

ФИГ.15 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKR1061 (см. также SEQ ID NO:111); (B) pKR973 (см. также SEQ ID NO:128); (C) pKR1064 (см. также SEQ ID NO:132); и (D) pKR1133 (см. также SEQ ID NO:145).

ФИГ.16 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKR1105 (см. также SEQ ID NO:156); (B) pKR1134 (см. также SEQ ID NO:161); (C) pKR1095 (см. также SEQ ID NO:167); и (D) pKR1132 (см. также SEQ ID NO:170.

ФИГ.17 представляет собой карту KS373 (см. также SEQ ID NO:179).

ФИГ.18 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации, и вычисленные % десатурации для клонов (кроме pBY-EgC₂₀elo1), показанных в Таблице 24ФИГ.19 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации, и вычисленные % десатурации для подачи ЭПК только к контрольному вектору, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157, и pY160.

ФИГ.20 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации и вычисленные % десатурации для подачи ДПК только к контрольному вектору, pY141, pY150, pY151, pY152, pY153, pY156, pY157, и pY160.

ФИГ.21 представляет схему относительной доменной структуры для каждого конструкционного элемента, описанного в Таблице 25.

ФИГ.22 изображает жирнокислотные профили, вычисленные % элонгации и вычисленные % десатурации для подачи ЭПК, АРК и ДПК к клеткам Yarrowia, трансформированным pY141 (EgDHAsyn1; SEQ ID NO:49), и только к контрольному вектору.

ФИГ.23 изображает жирнокислотные профили для индивидуальных зародышей из репрезентативного события в соматических соевых зародышах, трансформированных соевыми экспрессирующими векторами pKR973 и pKR1064 (см. Таблицу 26).

ФИГ.24 изображает жирнокислотные профили из пяти наилучших элонгационных событий в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором KS373.

ФИГ.25 резюмирует данные BLASTP и значения процентов идентичности для EgC₂₀elo1 (Пример 3), EgDHAsyn1 (Пример 4), и EgDHAsyn2 (Пример 5).

ФИГ.26 изображает жирнокислотные профили от питания соевых зародышей ЭПК. Данные соевые зародыши были выбраны из наилучших C₂₀/дельта-5-элонгазной и дельта-4-десатуразной активностей в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором pKR1105.

ФИГ.27 изображает хроматограмму липидного профиля Euglena gracilis клеточного экстракта, как описано в данных Примерах.

ФИГ.28 представляет собой карту pKR1183 (см. также SEQ ID NO:266).

ФИГ.29 резюмирует Euglena anabaena ДГК синтазные доменные последовательности.

ФИГ.30 представляет собой карту pKR1253 (см. также SEQ ID NO:270).

ФИГ.31 представляет собой карту pKR1255 (см. также SEQ ID NO:275).

ФИГ.32 представляет собой карту pKR1189 (см. также SEQ ID NO:285).

ФИГ.33 представляет собой карту pKR1229 (см. также SEQ ID NO:296).

ФИГ.34 представляет собой карту pKR1249 (см. также SEQ ID NO:297).

ФИГ.35 представляет собой карту pKR1322 (см. также SEQ ID NO:314).

ФИГ.36 показывает жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1189, которые имеют самое низкое среднее содержание АЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей), совместно с событием (2148-3-8-1), которое имеет жирнокислотный профиль, типичный для зародышей дикого типа для этого эксперимента. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК и АЛК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.37 показывает жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1183, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей). Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, ДГЛК и ЭТК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.38 показывает усредненные жирнокислотные профили (среднее из 10 соевых соматических зародышей) для 20 событий, трансформированных pKR1249 и pKR1253, которые имеют наивысшее АРК. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другие", включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.39 показывает фактические жирнокислотные профили для каждого соевого соматического зародыша из одного события (AFS 5416-8-1-1), со средним содержанием АРК 17,0% и средним содержанием ЭПК 1,5%. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК. Составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другие”, включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.40 показывает усредненные жирнокислотные профили (среднее из 9 или 10 соевых соматических зародышей) для 20 событий, тансформированных pKR1249 и pKR1255, которые имеют наивысшее АРК. Жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, СКК, ДГЛК, АРК, ЭРК, ЮН, ЭТК и ЭПК; составы жирных кислот выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот. Жирные кислоты, перечисленные как "другие", включают: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), СТК, 20:0, 20:1(11), 20:2 (7,11) или 20:2 (8,11), и ДПК.

ФИГ.41 показывает жирнокислотные профили при питании зародышей ЭПК. Соевые зародыши выбирались из событий с наилучшими активностями C₂₀-дельта-элонгазы и дельта-4-десатуразы в соевых зародышах, трансформированных соевым экспрессирующим вектором pKR1134. Жирные кислоты на ФИГ.41 идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭПК, 22:0 (докозановая кислота), ДПК, 24:0 (тетракозановая кислота), ДГК и 24:1 (невоновая кислота). Составы жирных кислот, перечисленных на ФИГ.41, выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.42 показывает жирнокислотные профили при питании соевых зародышей ЭПК. Соевые зародыши выбирались из событий с наилучшими активностями C₂₀-дельта-5-элонгазы и дельта-4-десатуразы из 20 новых событий, проанализированных для сои, трансформированной pKR1105. Жирные кислоты на ФИГ.42 идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭПК, 22:0 (докозановая кислота), ДПК, 24:0 (тетракозановая кислота), ДГК и 24:1 (невоновая кислота). Составы жирных кислот, перечисленных на ФИГ.42, выражены в виде весового процента (вес. %) от общего содержания жирных кислот.

ФИГ.43 представляет собой график, изображающий относительные активности событий, трансформированных или pKR1105 (C₂₀-элонгаза и дельта-4-десатуразы экспрессированы отдельно) или pKR1134 (C₂₀-элонгаза и дельта-4-десатураза экспрессированы как гибрид), когда соевые зародыши питались ЭПК.

ФИГ.44 представляет схему создания штамма Y4305U3 Yarrowia lipolytica.

ФИГ.45 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKLeuN-29E3 и (B) pY116.

ФИГ.46 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pKO2UF8289 и (B) pZKSL-555R.

ФИГ.47 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZP3-Pa777U и (B) pY117.

ФИГ.48 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZP2-2988 и (B) pZKUE3S.

ФИГ.49 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKL2-5U89GC и (B) pZKL1-2SP98C.

ФИГ.50 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKUM и (B) pZKD2-5U89A2.

ФИГ.51A представляет схему создания штамма Y4184U Yarrowia lipolytica. ФИГ.51B представляет плазмидную карту для pEgC20ES.

ФИГ.52 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZUFmEgC20ES и (B) pZKL4-220EA4. ФИГ.52C представляет схему, показывающую перекрывание участка 3′ EaC20E домена (SEQ ID NO:231) участком 5′ EaD4 домена (SEQ ID NO:246) внутри EaDHAsyn1 (SEQ ID NO:95).

ФИГ.53A показывает группировку N-концов EaD4S (SEQ ID NO:193), EaD4S-1 (SEQ ID NO:382), EaD4S-2 (SEQ ID NO:384), и EaD4S-3 (SEQ ID NO:386). ФИГ.53B показывает группировку N-концов EgD4S (SEQ ID NO:388), EgD4S-1 (SEQ ID NO:404), EgD4S-2 (SEQ ID NO:406), и EgD4S-3 (SEQ ID NO:408).

ФИГ.54 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZKLY-G204, (B) pEgC20ES-K, (C) pYNTGUS1-CNP, и (D) pZKLY.

ФИГ.55 представляет плазмидные карты для следующего: (A) pZUFmG9G8fu и (B) pZUFmG9A8.

ФИГ.56 представляет собой карту pKR1014.

ФИГ.57 представляет собой карту pKR1152.

ФИГ.58 представляет собой карту pKR1151.

ФИГ.59 представляет собой карту pKR1150.

ФИГ.60 представляет собой карту pKR1199.

ФИГ.61 представляет собой карту pKR1200.

ФИГ.62 представляет собой карту pKR1184.

ФИГ.63 представляет собой карту pKR1321.

ФИГ.64 представляет собой карту pKR1326.

Для ФИГ.65-71, жирные кислоты идентифицированы как 16:0 (пальмитат), 18:0 (стеариновая кислота), 18:1 (олеиновая кислота), ЛК, АЛК, ЭДК, ЭРК, ДГЛК и ЭТК, и составы жирных кислот выражены как весовой процент (вес. %) от общего количества жирных кислот. Кроме того, элонгационная активность выражена как % дельта-9-элонгации C18 жирных кислот (C18% дельта-9-элонг), вычисленный в соответствии со следующей формулой: ([продукт]/[субстрат+продукт])*100. Более конкретно, комбинированный процент элонгации для ЛК и АЛК определяется как: ([ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК]/[ЛК+АЛК+ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100. Комбинированный процент десатурации для ЕДК и ЭРК, представленный как “C₂₀ % дельта-8-десат”, определяется как: ([ДГЛК+ЭТК]/[ДГЛК+ЭТК+ЭДК+ЭРК])*100, и на него также ссылаются как на полный % десатурацииФИГ.65 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1014, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.66 представляет жирнокислотные профили для пяти событий, трансформированных pKR1152, которые имеют самое высокое среднее содержание ДГЛК (среднее из 5 проанализированных соевых соматических зародышей).

ФИГ.67 представляет жирноки