Fc-варианты с измененным связыванием с fcrn

Fc-варианты с измененным связыванием с fcrn

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании 35 U.S.С. 119 (е) в отношении USSN 60/951536, поданной 24 июля, 2007, и представляет собой частичное продолжение USSN 11/436266, поданной 17 мая, 2006, которая представляет собой частичное продолжение USSN 11/274065, поданной 14 ноября, 2005, обе из которых испрашивают приоритет на основании 35 U.S.С. 119 (е) в отношении USSN 60/627763, поданной 12 ноября, 2004; USSN 60/642886, поданной 11 января, 2005; USSN 60/649508, поданной 2 февраля, 2005; USSN 60/662468, поданной 15 марта, 2005; USSN 60/669311, поданной 6 апреля, 2005; USSN 60/681607, поданной 16 мая, 2005; USSN 60/690200, поданной 13 июня, 2005; USSN 60/696609, поданной 5 июля, 2005; USSN 60/703018, поданной 27 июля, 2005; и USSN 60/726453, поданной 12 октября, 2005, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством отсылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая заявка относится к оптимизированным вариантам иммуноглобулина IgG, инженерным способам их получения и их применению, в частности в терапевтических целях.

Уровень техники

Антитела представляют собой иммунологические белки, которые связываются с конкретным антигеном. У большинства млекопитающих, включая людей и мышей, антитела образуются из парных тяжелых и легких полипептидных цепей. Каждая цепь состоит из индивидуальных доменов иммуноглобулина (Ig) и поэтому для таких белков используют общий термин «иммуноглобулин». Каждая цепь состоит из двух отдельных областей, называемых «вариабельными» и «константными» областями. Вариабельные области легкой и тяжелой цепи демонстрируют существенное различие последовательностей антител и являются ответственными за связывание с антигеном-мишенью. Константные области демонстрируют меньшее различие последовательностей и являются ответственными за связывание с рядом природных белков для стимулирования важных биохимических реакций. У людей существует пять различных классов антител, включая IgA (который включает подклассы IgA1 и IgA2), IgD, IgE, IgG (который включает подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) и IgM. Отличительным признаком данных классов антител являются их константные области, несмотря на то, что тонкие различия могут существовать в V-области. На фиг.1 показано антитело IgG1, используемое в настоящем описании в качестве примера для описания общих структурных признаков иммуноглобулинов. Антитела IgG представляют собой тетрамерные белки, состоящие из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Тяжелая цепь IgG состоит из четырех доменов иммуноглобулина, связанных от N- к С-концу в порядке VH-CH1-CH2-CH3, что относится к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену 1 тяжелой цепи, константному домену 2 тяжелой цепи и константному домену 3 тяжелой цепи, соответственно (также обозначаемая как VH-Cγ1-Сγ2-Сγ3, что относится к вариабельному домену тяжелой цепи, константному домену гамма 1, константному домену гамма 2 и константному домену гамма 3, соответственно). Легкая цепь IgG состоит из двух доменов иммуноглобулина, связанных от N- к С-концу в порядке VL-CL, что относится к вариабельному домену легкой цепи и константному домену легкой цепи, соответственно.

Вариабельная область антитела содержит антигенсвязывающие детерминанты молекулы и таким образом определяет специфичность антитела в отношении антигена-мишени. Вариабельная область так названа из-за того что она больше всего отличается по своей последовательности от других антител в пределах одного класса. Большая часть вариабельности последовательностей встречается в гипервариабельных участках (CDR). Существует всего 6 CDR, на тяжелую и легкую цепь приходится по три области, обозначаемые VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3. Вариабельная область за пределами CDRs называется каркасной областью (FR). Несмотря на то, что она не такая разнообразная как CDR, вариабельность последовательностей действительно встречается в области FR между различными антителами. В целом, данная характерная структура антител обеспечивает устойчивый каркас (область FR), на основе которого значительное различие в связывании антигенов (CDR) может быть выявлено иммунной системой с приобретением специфичности в отношении широкого круга антигенов. Существует ряд структур высокого разрешения для множества фрагментов вариабельной области различных организмов, некоторые из которых не связаны с антигеном, и некоторые из которых находятся в комплексе с антигеном. Последовательность и структурные признаки вариабельных областей антитела хорошо охарактеризованы (Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки), а консервативные признаки антител облегчили развитие множества технологий создания антител (Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Например, можно трансплантировать CDRs одного антитела, например, антитела мыши, в каркасную область другого антитела, например, антитела человека. Указанный способ называется в данной области техники «гуманизацией» и позволяет получать менее иммуногенные лекарственные средства на основе антител из антител нечеловеческого происхождения. Фрагменты, содержащие вариабельную область, могут существовать при отсутствии других областей антитела, включая, например, антигенсвязывающий фрагмент (Fab), включающий VH-Cγ1 и VH-CL, вариабельный фрагмент (Fv), включающий VH и VL, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), включающий VH и VL, связанные в одной и той же цепи, а также множество других фрагментов вариабельной области (Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Область Fc антитела взаимодействует с рядом рецепторов и лигандов Fc, передавая ряд важных функциональных возможностей, называемых «эффекторными функциями». Для IgG область Fc, как показано на фиг.1 и 2, содержит домены Ig Сγ2 и Сγ3 и N-концевой шарнир, ведущий в Сγ2. Важное семейство рецепторов Fc для класса IgG представляет собой гамма рецепторы Fc (FcγR). Данные рецепторы опосредуют взаимодействие между антителами и клеточным «звеном» иммунной системы (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). У людей данное семейство белков включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы H131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Данные рецепторы, как правило, содержат внеклеточный домен, который опосредует связывание с Fc, трансмембранный домен и внутриклеточный домен, который может опосредовать какое-либо сигнальное явление внутри клетки. Эти рецепторы экспрессируются во множестве иммуноцитов, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, тромбоциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты, клетки Лангерганса, естественные киллерные (ЕК) клетки и γγ Т-клетки. При образовании комплекса Fc/FcγR происходит рекрутирование указанных эффекторных клеток к участкам связанного антигена, как правило, приводящее к явлениям передачи сигнала внутри клеток и важным последующим иммунным ответам, таким как высвобождение медиаторов воспаления, активация В-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Способность опосредовать цитотоксические и фагоцитарные эффекторные функции представляет собой возможный механизм, посредством которого антитела разрушают целевые клетки. Опосредуемая клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγRs, распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают лизис указанной клетки-мишени, называется «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC)» (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Опосредуемая клетками реакция, в которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие FcγRs, распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают фагоцитоз указанной клетки-мишени, называется «антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз (ADCP)». Ряд структур был создан с использованием внеклеточных доменов FcγRs человека, включая FcγRIIa (код доступа в pdb 1H9V, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (код доступа в pdb 1FCG, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), FcγRIIb (код доступа в pdb 2FCB, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки); и FcγRIIIb (код доступа в pdb 1E4J, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Все FcγRs связываются с одной и той же областью Fc, в N-концевой области домена Сγ2 и предшествующем шарнире, показанном на фиг.1. Данное взаимодействие хорошо структурно охарактеризовано (Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и некоторые структуры Fc человека, связанного с внеклеточным доменом FcγRIIIb человека были установлены (код доступа в pdb 1E4K, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (коды доступа в pdb 1IIS и 1IIX, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки) (Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки), а также структура комплекса Fc/FcεRIα IgE человека (код доступа в pdb 1F6A, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) (Garman et al., 2000, Nature 406:259-266, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Реакция эффекторной функции может быть модифицирована посредством варианта в области Fc (Lazar et al. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111):4005-4010, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Различные подклассы IgG обладают разными значениями аффинности к FcγRs, при этом IgG1 и IgG3, как правило, существенно лучше связываются с рецепторами по сравнению с IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Все FcγRs связываются с одной и той же областью Fc IgG, но с различными значениями аффинности: Kd обладающего высокой аффинностью рецептора FcγRI для IgG1 равна 10^-8 М^-1, в то время как обладающие низкой аффинностью рецепторы FcγRII и FcγRIII в целом связываются при 10^-6 и 10^-5 соответственно. Внеклеточные домены FcγRIIIa и FcγRIIIb являются на 96% идентичными; однако FcγRIIIb не содержит внутриклеточный сигнальный домен. Кроме того, в то время как FcγRI, FcγRIIa/c и FcγRIIIa представляют собой позитивные регуляторы активации, инициируемой иммунным комплексом, характеризующиеся наличием внутриклеточного домена, который содержит иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), FcγRIIb содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM), и, следовательно, является ингибирующим. Таким образом, первые рецепторы называются «активирующими рецепторами», а FcγRIIb называется «ингибирующим рецептором». Указанные рецепторы также отличаются по профилям и уровням экспрессии в различных иммуноцитах. Еще один уровень сложности представляет собой наличие ряда полиморфизмов FcγR в протеоме человека. Конкретный важный полиморфизм, обладающий клинической значимостью, представляет собой V158/F158 FcγRIIIa. IgG1 человека связывается с более высоким значением аффинности с аллотипом V158, чем с аллотипом F158. Было показано, что данное отличие в аффинности и, вероятно, его влияние на ADCC и/или ADCP является важным фактором эффективности антитела анти-СВ20, ритуксимаба (Ритуксан (Rituxan®), BiogenIdec). Пациенты с аллотипом V158 положительно реагируют на лечение ритуксимабом; однако, пациенты с аллотипом F158, обладающим более низким значением аффинности, слабо реагируют (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Приблизительно 10-20% людей являются гомозиготными V158/V158, 45% являются гетерозиготными V158/F158 и 35-45% людей являются гомозиготными F158/F158 (Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Таким образом, 80-90% людей обладают низким иммунным ответом, т.е. они имеют, по меньшей мере, один аллель F158 FcγRIIIa.

Перекрывающийся, но отдельный участок Fc, показанный на фиг.1, служит в качестве границы для белка комплемента C1q. Подобно тому как связывание Fc/FcγR опосредует ADCC, связывание Fc/C1q опосредует комплементзависимую цитотоксичность (CDC). C1q образует комплекс с сериновыми протеазами C1r и C1s с образованием комплекса С1. C1q может связываться с шестью антителами, несмотря на то, что связывание с двумя IgG является достаточным для активации каскада реакций комплемента. Подобно взаимодействию Fc с FcγR, различные подклассы IgG обладают разной аффинностью к C1q, при этом IgG1 и IgG3 как правило существенно лучше связываются с FcγRs, чем IgG2 и IgG4 (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

В IgG участок Fc между доменами Cg2 и Cg3 (фиг.1) опосредует взаимодействие с неонатальным рецептором FcRn, связывание с которым возвращает подвергшееся эндоцитозу антитело из эндосомы обратно в кровоток (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Данный процесс, сопряженный с нарушением фильтрации почек вследствие большого объема полноразмерной молекулы, приводит к подходящему времени полужизни антител в сыворотке в диапазоне от одной до трех недель. Связывание Fc с FcRn также играет ключевую роль в транспорте антитела. Сайт связывания в области Fc для FcRn также представляет собой участок, в котором связываются бактериальные белки А и G. Прочное связывание данными белками, как правило, используют в качестве способа очистки антител путем применения аффинной хроматографии с белком А или белком G в ходе очистки белка. Таким образом, точность данного участка в области Fc имеет важное значение как для клинических свойств антител, так и для их очистки. Имеющиеся структуры комплекса Fc/FcRn крысы (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки) и комплексов Fc с белками А и G (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481, все полностью включены в настоящее описание посредством отсылки), дают представление о взаимодействии Fc с указанными белками. Рецептор FcRn также ответственен за перенос IgG в кишечник новорожденных и в просвет эпителия кишечника у взрослых (Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:739-766; Yoshida et al., Immunity, 2004, 20(6):769-783, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки).

Исследования доменов Fc крысы и человека продемонстрировали важное значение некоторых остатков Fc для связывания FcRn. Последовательности крысы и человека обладают примерно 64% идентичности последовательностей в областях Fc (остатки 237-443 согласно нумерации Kabat et al.). См. фиг.3, 4 и 5 на предмет выравниваний Fc крыса/человек, тяжелая цепь FcRn и легкая цепь FcRn (бета-2-микроглобулин). Была создана модель комплекса Fc/FcRn человека исходя из имеющейся структуры комплекса Fc/FcRn крысы (Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Последовательности крысы и человека содержат некоторые общие остатки, имеющие ключевое значение для связывания FcRn, например Н310 и Н435 (Medesan et al., 1997 J. Immunol. 158(5):221-7; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Однако во многих положениях белки человека и крысы содержат разные аминокислоты, обеспечивающие указанным остаткам в последовательности человека отличным окружением и возможно отличной идентичностью, чем в последовательности крысы. Указанная вариабельность ограничивает способность передавать особенности одного гомолога другому гомологу.

В Fc мышей случайная мутация и отбор на основе фагового дисплея по сайтам Т252, Т254 и Т256 приводит к тройному мутанту T252L/T254S/T256F, обладающему 3,5-кратным повышением аффинности к FcRn и 1,5-кратным увеличением времени полужизни в сыворотке (Ghetie et al., 1997, Nat. Biotech. 15(7):637-640, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Нарушение взаимодействия Fc/FcRn посредством мутаций в положениях 253, 310 и 435 также приводит к уменьшению времени полужизни in vivo (Medesan et al J. Immunol. 1997 158(5):2211-7, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

На основе кристаллических структур комплекса Fc/FcRn крысы были идентифицированы остатки Fc, имеющие важное значение для связывания FcRn (Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994); Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Первоначальная структура комплекса Fc/FcRn было установлена в 1994 году при разрешении 6 Å (таблица 2а, Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994), полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Структура более высокого разрешения, установленная в 2001 году Marin et al, представила более детальное изображение положений боковых цепей (Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001), полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Данная кристаллическая структура Fc крысы, связанного с FcRn крысы, была установлена с использованием димера Fc с одним мономером, содержащим мутации T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E, нарушающие связывание FcRn, и одним мономером, содержащим мономер Fc дикого типа.

Были проведены исследования мутаций в Fcγ человека в некоторых остатках, имеющих важное значение для связывания с FcRn, и данные исследования продемонстрировали увеличенное время полужизни в сыворотке. В Fcγ1 человека Hinton et al. индивидуально подвергли мутации три остатка в другие 19 обычных аминокислот. Hinton et al. обнаружили, что некоторые мутанты, двойной мутант, повышали аффинность к связыванию FcRn (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216. Hinton et al. Journal of Immunology 2006, 176:346-356, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Две мутации обладали увеличенным временем полужизни у обезьян. Shields et al. подвергли мутации остатки практически исключительно в А1а и исследовали их связывание с FcRn и FcγR (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки).

Dall'Acqua et al. использовали фаговый дисплей для отбора мутаций Fc, которые связывали FcRn с повышенной аффинностью. (Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Выбранные последовательности ДНК преимущественно представляли собой двойные и тройные мутанты. Dall'Acqua et al. экспрессировали белки, кодируемые многими выбранными последовательностями, и были обнаружены некоторые, которые связывались с FcRn более прочно, чем в случае Fc дикого типа.

Для введения антител и слитых с Fc белков в качестве лекарственных средств необходимы инъекции с заданной частотой, связанной с клиренсом и параметрами времени полужизни белка. Более продолжительное время полужизни in vivo позволяет реже осуществлять инъекции или уменьшать дозу, что очевидно является преимуществом. Несмотря на то, что полученные в прошлом мутации в домене Fc привели к получению некоторых белков, обладающих повышенной аффинностью к связыванию FcRn и увеличенным временем полужизни in vivo, данные мутации не определили оптимальные мутации и увеличенное временя полужизни in vivo.

Одним из признаков области Fc является консервативное N-связанное гликозилирование, происходящее по N297, показанном на фиг.1. Данный углевод или олигосахарид, как его иногда называют, играет ключевую структурную и функциональную роль для антитела и представляет собой одну из основных причин, по которой антитела должны быть получены с использованием систем экспрессии млекопитающих (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477; и Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989, все полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки).

Антитела были получены для терапевтического использования. Типичные публикации, относящиеся к таким видам терапии, включают Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200, Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410, McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833 и Cobleigh et al., 1999, J din Oncol 17:2639-2648, все из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. В настоящее время для противораковой терапии любое небольшое снижение в уровне смертности означает успех. Некоторые варианты IgG, указанные в настоящем описании, увеличивают способность антител ограничивать дальнейший рост или разрушать по меньшей мере частично целевые раковые клетки.

Противоопухолевая активность антител реализуется посредством увеличения их способности опосредовать цитотоксические эффекторные функции, такие как ADCC, ADCP и CDC. Примеры включают Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446 и Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством отсылки.

IgG1 человека представляет собой чаще всего используемое в терапевтических целях антитело и в связи с этим было проведено большинство поисковых исследований. Однако различные изотипы класса IgG, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, обладают уникальными физическими, биологическими и клиническими свойствами. В данной области техники существует необходимость создания улучшенных вариантов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Также существует необходимость создания указанных вариантов для улучшения связывания с FcRn и/или увеличения времени полужизни in vivo, no сравнению с нативными полипептидами IgG. Кроме того, существует необходимость комбинирования вариантов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, с вариантами, содержащими модификации, для улучшения эффективности посредством измененного связывания FсгаммаR. Настоящая заявка соответствует этим и другим потребностям.

Раскрытие изобретения

Настоящая заявка относится к Fc-вариантам исходного полипептида, содержащим по меньшей мере одну модификацию в области Fc указанного полипептида. В различных вариантах осуществления вариантные полипептиды демонстрируют измененное связывание с FcRn по сравнению с исходным полипептидом. В некоторых вариантах модификация может быть выбрана из группы, включающей: 246Н, 246S, 247D, 247Т, 248Н, 248Р, 248Q, 248R, 248Y, 249Т, 249W, 250Е, 250I, 250Q, 250V, 251D, 251E, 251H, 251I, 251K, 251M, 251N, 251T, 251V, 251Y, 252Q, 252Y, 253L, 253T, 253V, 254H, 254L, 254N, 254T, 254V, ^254N, 255E, 255F, 255H, 255K, 255S, 255V, 256E, 256V, 257A, 257C, 257D, 257E, 257F, 257G, 257H, 257I, 257K, 257L, 257M, 257N, 257Q, 257R, 257S, 257T, 257V, 257W, 257Y, 258R, 258V, 259I, 279A, 279D, 279C, 279F, 279G, 279H, 279I, 279K, 279M, 279N, 279P, 279Q, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y, 280H, ^281A, ^281D, ^281S, ^281T, 282D, 282F, 282H, 282I, 282T, 283F, 283I, 283L, 283Y, 284H, 284K, 284P, 284Q, 284R, 284S, 284Y, 285S, 285V, 286D, 286#, 286L, 287H, 287S, 287V, 287Y, 288H, 288Q, 288S, 305H, 305T, 306F, 306H, 306I, 306N, 306T, 306V, 306Y, 307D, 307P, 307Q, 307S, 307V, 307Y, 308C, 308D, 308E, 308F, 308G, 308H, 308I, 308K, 308L, 308M, 308N, 308Q, 308P, 308R, 308S, 308W, 308Y, 309F, 309H, 309N, 309Q, 309V, 309Y, 310K, 310N, 310T, 311A, 311L, 311P, 311T, 311V, 311W, 312H, 313Y, 315E, 315G, 315H, 315Q, 315S, 315T, 317H, 317S, 319F, 319F, 319L, 339P, 340P, 341S, 374H, 374S, 376H, 376L, 378H, 378N, 380A, 380T, 380Y, 382H, 383H, 383K, 383Q, 384E, 384G, 384H, 385A, 385C, 385F, 385H, 385I, 385K, 385L, 385M, 385N, 385P, 385Q, 385S, 385T, 385V, 385W, 385Y, 386E, 386K, 387#, 387A, 387H, 387K, 387Q, 389E, 389H, 426E, 426H, 426L, 426N, 426R, 426V, 426Y, 427I, 428F, 428L, 429D, 429F, 429K, 429N, 429Q, 429S, 429T, 429Y, 430D, 430H, 430K, 430L, 430Q, 430Y, 431G, 431H, 431I, 431P, 431P, 431S, 432F, 432H, 432N, 432S, 432V, 433E, 433P, 433S, 434A, 434F, 434H, 434L, 434M, 434Q, 434S, 434Y, 435N, 436E, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H и 438K, где нумерация приведена согласно Индексу EU у Kabat et al., и ^ означает инсерцию после указанного положения, и # означает делецию указанного положения.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 250Q/252Y, 250Q/256E, 250Q/286D, 250Q/308F, 250Q/308Y, 250Q/311A, 250Q/311V, 250Q/380A, 250Q/428L, 250Q/428F, 250Q/434H, 250Q/434F, 250Q/434Y, 250Q/434A, 250Q/434M и 250Q/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 250E/252Y, 250Е/256Е, 250E/286D, 250E/308F, 250E/308Y, 250Е/311А, 250E/311V, 250Е/380А, 250E/428L, 250E/428F, 250Е/434Н, 250E/434F, 250E/434Y, 250Е/434А, 250Е/434М и 250E/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 252Y/250Q, 252Y/250E, 252Y/256E, 252Y/286D, 252Y/308F, 252Y/308Y, 252Y/311A, 252Y/311V, 252Y/380A, 252Y/428L, 252Y/428F, 252Y/434H, 252Y/434F, 252Y/434Y, 252Y/434A, 252Y/434M и 252Y/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 256E/250Q, 256Е/250Е, 256E/252Y, 256E/286D, 256E/308F, 256E/308Y, 256Е/311А, 256E/311V, 256Е/380А, 256E/428L, 256E/428F, 256Е/434Н, 256E/434F, 256E/434Y, 256Е/434А, 256Е/434М и 256E/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 286D/250Q, 286D/250E, 286D/252Y, 286D/256E, 286D/308F, 286D/308Y, 286D/311A, 286D/311V, 286D/380A, 286D/428L, 286D/428F, 286D/434H, 286D/434F, 286D/434Y, 286D/434A, 286D/434M и 286D/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 308F/250Q, 308F/250E, 308F/252Y, 308F/256E, 308F/286D, 308F/311A, 308F/311V, 308F/380A, 308F/428L, 308F/428F, 308F/434H, 308F/434F, 308F/434Y, 308F/434A, 308F/434M и 308F/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 308Y/250Q, 308Y/250E, 308Y/252Y, 308Y/256E, 308Y/286D, 308Y/311A, 308Y/311V, 308Y/380A, 308Y/428L, 308Y/428F, 308Y/434H, 308Y/434F, 308Y/434Y, 308Y/434A, 308Y/434M и 308Y/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 311A/250Q, 311А/250Е, 311A/252Y, 311А/256Е, 311A/286D, 311A/308F, 311A/308Y, 311А/380А, 311A/428L, 311A/428F, 311А/434Н, 311A/434F, 311A/434Y, 311А7434А, 311А/434М и 311A/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 311V/250Q, 311V/250E, 311V/252Y, 311V/256E, 311V/286D, 311V/308F, 311V/308Y, 311V/380A, 311V/428L, 311V/428F, 311V/434H, 311V/434F, 311V/434Y, 311V/434A, 311V/434M и 311V/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 380A/250Q, 380А/250Е, 380A/252Y, 380А/256Е, 380A/286D, 380A/308F, 380A/308Y, 380А/311А, 380A/311V, 380A/428L, 380A/428F, 380А/434Н, 380A/434F, 380A/434Y, 380А/434А, 380А/434М и 380A/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 428L/250Q, 428L/250E, 428L/252Y, 428L/256E, 428L/286D, 428L/308F, 428L/308Y, 428L/311A, 428L/311V, 428L/380A, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M и 428L/434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434H/250Q, 434Н/250Е, 434H/252Y, 434Н/256Е, 434H/286D, 434H/308F, 434H/308Y, 434Н/311А, 434H/311V, 434Н/380А, 434H/428L и 434H/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434F/250Q, 434F/250E, 434F/252Y, 434F/256E, 434F/286D, 434F/308F, 434F/308Y, 434F/311A, 434F/311V, 434F/380A, 434F/428L и 434F/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434Y/250Q, 434Y/250E, 434Y/252Y, 434Y/256E, 434Y/286D, 434Y/308F, 434Y/308Y, 434Y/311A, 434Y/311V, 434Y/380A, 434Y/428L и 434Y/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434A/250Q, 434А/250Е, 434A/252Y, 434А/256Е, 434A/286D, 434A/308F, 434A/308Y, 434А/311А, 434A/311V, 434А/380А, 434A/428L и 434A/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434M/250Q, 434М/250Е, 434M/252Y, 434М/256Е, 434M/286D, 434M/308F, 434M/308Y, 434М/311А, 434M/311V, 434М/380А, 434M/428L и 434M/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере две модификации, выбранные из группы, включающей: 434S/250Q, 434S/250E, 434S/252Y, 434S/256E, 434S/286D, 434S/308F, 434S/308Y, 434S/311A, 434S/311V, 434S/380A, 434S/428L и 434S/428F.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, M252Y/S254T/T256E/N434S, M252Y/S254T/T256E/V308F, M252Y/S254T/T256E/M428L, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: Y319L, T307Q, V259I, M252Y, V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S, V308F/M428L/N434S, V259I/V308F/N434S, T307Q/V308F/N434S, T250I/V308F/N434S, V308F/Y319L/N434S, V259I/V308F/M428L, V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y, T307Q/V308F/Y319L и T250Q/V308F/M428L.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: 250I, 250V, 252Q, 252Y, 254Т, 256V, 259I, 307Р, 307Q, 307S, 308F, 309N, 309Y, 311P, 319F, 319L, 428L и 434S.

В другом варианте осуществления Fc-вариант содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из группы, включающей: 250V/308F, 250I/308F, 254T/308F, 256V/308F, 259I/308F, 307P/208F, 307Q/308F, 307S/308F, 308F/309Y, 308F/309Y, V308F/311P, 308F/319L, 308F/319F, 308F/428L, 252Q/308F, M252Y/S254T/T256E, 259I/434S, 428L/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S, 308F/319L/434S, 259I/308F/428L, 259I/307Q/308F, 250I/259I/308F, 259I/308F/319L, 307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L и 250Q/308F/428L.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение эффективного количества Fc-варианта, указанного в настоящем описании.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ увеличения времени полужизни антитела или иммуноадгезина путем модификации Fc согласно модификациям, указанным в настоящем описании.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Структура и функция антитела. Показана модель полноразмерного антитела IgG1 человека, смоделированная с использованием гуманизированной структуры Fab на основании кода доступа в pdb 1CE1 (James et al., 1999, J Mol Biol 289:293-301, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки) и структуры Fc IgG1 человека на основании кода доступа в pdb 1DN2 (DeLano et al., 2000, Science 287:1279-1283, полностью включенный в настоящее описание посредством отсылки). Гибкий шарнир, связывающий области Fab и Fc, не показан. IgG1 представляет собой гомодимер гетеродимеров, состоящий из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. Домены Ig, содержащие антитело, являются мечеными и содержат V_L and C_L для легкой цепи и V_H, Сгамма1 (Сγ1), Сгамма2 (Сγ2) и Сгамма3 (Сγ3) для тяжелой цепи. Область Fc является меченой. Центры связывания для соответствующих белков являются мечеными, включая антигенсвязывающий центр в вариабельной области и центры связывания для FcγRs, FcRn, C1q и белков А и G в области Fc.

Фиг.2. Последовательности IgG человека, используемые в соответствии с настоящим изобретением с нумерацией EU согласно Kabat et al.

Фиг.3. Пример последовательностей IgG человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением с нумерацией EU согласно Kabat.

Фиг.4. Пример последовательностей тяжелых цепей FcRn человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.5. Пример последовательностей бета-2-микроглобулина человека и грызунов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.6. Модель комплекса Fc/FcRn человека, созданная на основе структур крысы (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877, оба полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки). Некоторые остатки гистидина показаны в виде атомов пространственной модели в цепях FcRn (светло-серые) и в полипептиде Fc (темно-серые).

Фиг.7. Иллюстрация некоторых концепций, используемых в создании вариантов, содержащих инсерции или делеции.

Фиг.8. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.9. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.10. Варианты согласно настоящему изобретению.

Фиг.11. Диаграмма вектора pcDNA3.1 Zeo+, который может быть использован в создании Fc-вариантов.

Фиг.12. Данные конкурентного связывания с FcRn Fc дикого типа и Fc-вариантов согласно настоящему изобретению. На каждом графике Fc-варианты согласно настоящему изобретению показаны в виде левой кривой (красной или темно-серой), а антитело анти- HER2 дикого типа показано в виде правой кривой (синей или светло-серой).

Фиг.13. Вывод относительно способностей Fc-вариантов связывать FcRn. В колонках слева направо показаны модификации связывания FcRn, используемый иммуноглобулин, другие модификации, относительная аффинность к FcRn по данным конкурентных анализов AlphaScreen™ по сравнению с диким типом (медианное значение) и число выполненных анализов. Значения относительной аффинности к FcRn больше 1,0 демонстрируют увеличенное связывание по сравнению с диким типом. Данные получали при pH 6,0 (0,1М фосфат натрия, 25 мМ хлорид натрия).

Фиг.14. Данные связывания с FcRn Fc-вариантов. Fc-варианты включены в алемтузумаб или антитело анти-HER2. Показаны кратные увеличения в связывании по сравнению с диким типом, т.е. значения больше единицы указывают на более прочное связывание с FcRn, в то время как значения меньше единицы указывают на уменьшенное связывание с FcRn.

Фиг.15. Результаты исследований методом поверхностного плазмонного резонанса Fc-вариантов, обладающих улучшенным связыванием с FcRn. На гистограмме показано кратное увеличение аффинности к связыванию FcRn каждого варианта по сравнению с доменом Fc дикого типа.

Фиг.16. Исследования методом поверхностного плазмонного резонанса антитела дикого типа и вариантов согласно настоящему изобретению. Показанные следы представляют собой ассоциацию и диссоциацию Fc-вариант антитела с FcRn при pH 6,0.

Фиг.17. Анализы связывания Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn. Показаны данные анализов прямого связывания, измеренные с помощью AlphaScreen™ при pH 6,0 (а и b) и pH 7,0 (с).

Фиг.18. Анализы связывания Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn. Показаны единицы измерения поверхностного плазмонного резонанса, полученные при связывании Fc-варианта с поверхностно-связанным FcRn.

Фиг.19. Измерение поверхностного плазмонного резонанса аффинности к связыванию Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека при pH 6,0.

Фиг.20. Результаты измерений поверхностного плазмонного резонанса (ППР) аффинности к связыванию Fc-вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека, макаки и мыши. Значения больше единицы указывают на увеличенное связывание Fc-варианта с FcRn, как определено путем подгонки кривых ПНР к 1:1 модели связывания Ленгмюра.

Фиг.21. Вывод относительно способностей Fc-вариантов связывать FcRn. В колонках слева направо показаны модификации связывания FcRn, используемый иммуноглобулин, другие модификации, относительная аффинность к FcRn по данным конкурентных анализов AlphaScreen™ по сравнению с диким типом (среднее значение) и число выполненных анализов. Значения относительной аффинности к FcRn больше 1,0 демонстрируют увеличенное связывание по сравнению с диким типом. Данные получали при pH 6,0 (0,1М фосфат натрия, 125 мМ хлорид натрия).

Фиг.22. Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антитела анти-HER2.

Фиг.23. Аминокислотные последовательности константных областей (СН1-СН3) некоторых тяжелых цепей IgG1, используемых в настоящем описании.

Фиг.24. Аминокислотные последовательности константных областей (СН1-СН3) некоторых тяжелых цепей гибридного IgG1/2, используемых в настоящем описании.

Фиг.25. Связывание Fc-вариантов с FсгаммаRIIIA (Аллотип V158) по данным конкурентных анализов AlphaScreen™.

Фиг.26. Связывание Fc-вариантов с белком А по данным конкурентных анализов AlphaScreen™.

Фиг.27. Сывороточные концентрации дикого типа и вариантов антител у мышей с нокином (knockin) FcRn человека. Используемые антитела анти-VEGF были дикого типа (незакрашенные квадраты), V308F (закрашенные квадраты), P257L (закрашенные треугольники) и P257N (крестики).

Фиг.28. Примеры вариантов связывания FcRn согласно настоящему изобретению. Антитела анти-VEGF перечислены с указанием объема культурных сред и выхода очищенного белка.

Фиг.29. Аффинность к связыванию вариантов согласно настоящему изобретению с FcRn человека при pH 6,0. Значения приведены в виде кратного увеличения связывающей способности указанного варианта относительно антитела дикого типа. Например, вариант 434S связывается с FcRn в 4,4 раза более прочно, чем антитело дикого типа.

Фиг.30. Связывание антител дикого типа и вариантных антител с FcRn на поверхности клеток 293Т.

Фиг.31. Комбинированные варианты согласно настоящему изобретению, содержащие многочисленные замены.

Фиг.32. Картина взаимодействий вариантного домена CH3 человека, содержащего 434S, меченый Ser434, и FcRn человека.

Осуществление изобретения

Согласно настоящему изобретению описано получение новых вариантов доменов Fc, включая варианты, содержащиеся в антителах, слитых с Fc белках и иммуноадгезинах, которые обладают увеличенным связыванием с рецептором FcRn. Как указано в настоящем описании, связывание с FcRn приводит к более продолжительному удерживанию в сыворотке in vivo.

Для того чтобы увеличить удерживание белков Fc in vivo повышение аффинности к связыванию должно происходить при