2517733 - Вакцина ассоциированная против аденовирусной, герпесвирусной инфекцией, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная

Вакцина ассоциированная против аденовирусной, герпесвирусной инфекцией, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная

Иллюстрации

Показать все

Представленная вакцина содержит концентрированные антигенные материалы из штамма «Adeno III WBR-1-ДЕП» 3-го серотипа I подгруппы, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы, из штамма «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» 4-го серотипа II подгруппы, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки теленка Taurus-1, из штамма «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы, из штамма «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток легких эмбриона коровы и из штамма «ВК-1-ДЕП» вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы. Концентрированные и авирулентные антигенные материалы, инактивированные формалином, соединяют с адъювантом в эффективном соотношении. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против указанных инфекций и обеспечивает надежную защиту новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма. 2 з.п. ф-лы, 7 табл., 9 пр.

Реферат

Вакцина ассоциированная против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности против вирусных респираторно-кишечных инфекций телят и обуславливаемых ими нарушений репродуктивной функции взрослого поголовья крупного рогатого скота (КРС).

Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота остаются одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии животных во многих странах мира, в том числе и России. В этиопатогенезе их с большей постоянностью регистрируются вирус парагриппа-3 (ПГ-3), герпесвирус типа I, вирус вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), респираторно-синцитиальный вирус, парво- и реовирусы, а также рота-, коронавирусы, патогенные виды бактерий, хламидий и микоплазм. Эти болезни, протекающие преимущественно в виде смешанной инфекции, широко распространены в современных крупных молочных комплексах и потери молодняка в них достигают 35-50% (Гаффаров Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов // Автореф. дис. … док. вет. Наук. - Казань. - 1986. - 39 с.).

Достоверно установлено участие в данной патологии и аденовирусов КРС I и II подгрупп, которые по мнению ряда ученых являются одним из четырех наиболее вероятных возбудителей респираторных заболеваний КРС и по распространенности стоят на втором месте после парагриппа-3. Кроме того, они признаны этиологическим агентом неопластических процессов и бессимптомных инфекций у человека и животных и потому имеют гораздо большее эпизоотическое и социально-экономическое значение, чем предполагалось раньше (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., Вертинская К.К. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота / Малоизвестные вирусные инфекции крупного рогатого скота. - Москва, 1972.- 47 с.; Mocsari Е. et al., 1974. - // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1974. -24. - №1-2. - P.39-43; Mohanty S.B. Comparative studies of Bovine Adenovims // Amer. J. Vet. Res. - 1971. - V.32. - №12. - P.1899-1905).

Касаясь спектра патогенности аденовирусов КРС в естественных условиях, следует заметить, что аденовирусная инфекция у телят от 2-недельного до 2-4-месячного возраста характеризуется острым течением, развиваются бронхопневмония, энтериты и конъюнктивиты, вследствие воспалительных процессов слизистых оболочек дыхательных путей и пищеварительного тракта. У взрослого поголовья КРС инфекция протекает латентно, сопровождаясь длительным вирусоносительством. Выделение аденовируса из плодов свидетельствует о возможности транспланцентарной передачи возбудителя.

Аденовирусы КРС представлены шестью серотипами, проявляющими различия в антигенной структуре: аденовирусы 1, 2 и 3-го серотипов реагируют перекрестие между собой, но не взаимодействуют с сыворотками 4, 5 и 6-го серотипов, что явилось причиной их деления на две антигенной подгруппы (Bartha A. Proposal for sub grouping of bovine adenoviruses // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1969. - 19. - №3. - P.313-321; Rondhuis P.R. Bovine Adenoviruses. A Comparative Serological and Experimental Study // Drukkerij-Uitgeverij G. van Dijk N.V. Breukelen. - 1970. - P.218).

Аденовирусная инфекция КРС была впервые установлена в США в 1959 году (Klein H., Maitzman W., Levine A.J. Structure function relationships of the adenovirus DNA-binding protein // J. Biol. Chem. - 1979. - V.254. - P.11051-11060) затем в Англии (Darbyshire J.H. Bovine Adenoviruses // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1968. - V.152. - P.786-792), Венгрии (Aldasy P., Csontos L., Bartha A. Pneumoenteritis in Caives Caused by Adenoviruses //Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1965. - 15. - P.175-176), Голландии (Rondhuis P.R. Anew Bovine Adenovirus // Arch. ges. Virusforsch. - 1968. - 25. - P.235-236), Японии (Inaba Y., Tanaka Y., Sato Y., Ito K., Ito H., Matumoto M. Bovine adenovirus. II A.Serotype. Fukuroi, Recoverend from Japanene Cattle // Jap.J. MicrobioL - 1968. - 12. - P.219-229). Несколько позже это заболевание было зарегистрировано в Италии, Польше, ФРГ, Канаде, Австралии, Болгарии и в других странах.

О широком распространении аденовирусной инфекции свидетельствуют частые случаи выделения при инфекционных респираторных заболеваниях телят, а также высокий процент серопозитивности у взрослого скота. Так, в реакции нейтрализации (РН) аденовирусные антитела обнаружены у 66,8% (Sawhney D.S. Vadehre D.V, Baker R.C. // Poultry Sci. - 1973. - 52. - №2. - P.465-473), 60% (Adamesteanu L., Adamesteanu C. // Rev. zootehn. si med. vet. - 1973. - V.23. - №9.- P.51-56) от всего обследованного поголовья и у 73,41% животных в тех группах, в которых в период исследования наблюдались клинические симптомы респираторно-кишечных заболеваний.

В большинстве случаев в этиологии респираторных заболеваний телят удавалось установить участие не только аденовирусов, но и других, таких как вирусов ПГ-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи и хламидий (Sawhney D.S. et al., 1973). Однако Mocsari, E. et al. считает, что аденовирусы играют более важную роль в этиологии респираторных и кишечных заболеваний телят, чем вирус инфекционного ринотрахеита и хламидий.

Экспериментальное заражение телят в возрасте 20-25 дней (Аугустинавичус Б.В. / в кн. Науч.-тех. информация. - Литов. науч. - иссл. вет. институт. - 1966. - С.3-5), 8 недель (Pons W.A., Cucullu A.F., Franz A.O., Lee Louise S., Goldblatt Leo A. // J. Assoc. Offic. Anal. Chem. - 1973. - 56. - №4. - P.803-807), 6-12 недель и даже 8-месячных животных аденовирусом КРС вызывало клинически выраженное заболевание. Более того, вирусы 3-го и 4-го серотипов вызывают более тяжелое заболевание у телят, чем вирусы 1-го и 2-го серотипов, которые вызывают легкую реакцию или вовсе ее не вызывают у телят, лишенных молозива или выкормленных на обычном рационе (Gillespie J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - 163. -№7. - Р.901).

Первые сообщения о неблагополучии хозяйств в отношении аденовирусной инфекции в СССР появилось в конце 60-х годов (Алиева Н.А., Ганиев М.К., Дрейзин Р.С., Алиева Р.А., Сарыев Г.А. Аденовирусная инфекция телят // Труды АзНИВИ. - 1967. - Т. XXI; Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Вирусные и хламидиозные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота // Животноводство и ветеринария. Проблемы ветеринарии, серия «Итоги науки и техники». - Москва, 1975. - Т.8. - С.87-95).

В период 1998-2003 гг. был регистрирован самый высокий уровень заболеваемости телят аденовирусной инфекцией в хозяйствах Московской области. Из 108 обследованных хозяйств во всех случаях установлена циркуляция вирусов ПГ-3 (100%), ИРТ (63,8%), вируса ВД-БС (38,8%), аденовируса (36,2%) и респираторно-синцитиального вируса (4,6%). Полученные данные указывают на значительную роль аденовирусной инфекции в этиологической структуре респираторно-кишечной патологии крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации (Лобова Т.П. Усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота // Автореф. дис. … канд. биол. наук. - ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - Москва. - 2006. - 19 с.).

С целью выяснения этиологии смешанных респираторных заболеваний в различных регионах Среднего Поволжья и Урала, в 2001-2004 годы было исследовано 1665 проб сывороток крови различных половозрастных групп крупного рогатого скота из 76 неблагополучных хозяйств на наличие антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и аденовирусной инфекции. Результаты исследований показали, что наибольший процент положительных проб выявлено к вирусу ПГ-3 - 76,6% и к вирусу ИРТ - 35%, а к аденовирусу - 18,4%, ВД-БС - 17,9% (Ахметсафин Р.Г. Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики смешанных респираторных инфекций телят // Автореф. дис. … канд. вет. наук. - Казань. - 2005. - 19 с.).

Меры профилактики и борьбы с аденовирусной инфекцией в Российской Федерации (РФ), традиционно используемые в настоящее время, не решают проблему вследствие недостаточно полного раскрытия этиологии данного симптомокомплекса в каждом отдельном случае, неизученности принципиальных особенностей ее проявления в современных крупных комплексах, отсутствия в них системного сероиммунологического мониторинга в отношении основных возбудителей респираторно-кишечной патологии, создающего трудности определения ведущей роли того или иного инфекционного агента при смешанных инфекциях, и, наконец, ветеринарная служба страны в настоящее время реально не располагает высокоэффективными методами и средствами ее диагностики и какими-либо биопрепаратами для ее специфической профилактики.

Обращает на себя внимание высказывание ряда ученых о том, что достижения в иммунопрофилактике аденовирусной инфекции более скромны, чем при других вирусных заболеваниях телят респираторно-кишечного комплекса (Edwards G.S., Wogan G.N. // Biochim. biophys. acta. - 1970. - V.224. - 597 p.; Darbyshire J.H. Bovine Adenoviruses // J. Amer.Vet. Med. Assoc. - 1968. - V.152. - P.786-792). Это обусловлено рядом трудностей, очевидно, в первую очередь, связано с множеством типов возбудителя и латентным течением у взрослых животных (Сюрин Н.В., Самуйленко А.Я. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота // Вирусные болезни животных. - Москва. - ВНИТИБП, 1998. - С.795-801).

В нашей стране в 70-80-е годы изыскания эффективных методов иммунопрофилактики данной инфекции проводились в двух направлениях: путем создания пассивной защиты с помощью поливалентных гипериммунных сывороток и формирования активного иммунитета с помощью вакцин.

Для специфической профилактики вирусных респираторно-кишечных инфекций молодняка и маточного поголовья крупного рогатого скота в РФ применяют живые и инактивированные вакцины.

Известна вирусвакцина «ТКА-ВИЭВ» против инфекционного ринотрахеита КРС, которая используется в случаях возникновения этой инфекции, иммунизируют всех животных, находящихся в эпизоотическом очаге, а также в хозяйствах мясного направления при стационарном неблагополучии - всех животных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении.

Известна «Вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота», которая была разработана на основе полевых штаммов «КЛБ» и «Русь 18/81», относящихся к I и II подгруппам соответственно (Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Коленкова Л.М., Литвинов Т.И., Лобова Т.П. Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / Авт. свидетельство №4486434/30-13/138050 от 29.08.89). Вакцина была изготовлена Покровским заводом биологических препаратов в количестве 125 литров. Биопрепарат был применен в хозяйствах Краснодарского края, Киргизской ССР и Белорусской ССР. Испытанная вакцина была признана безвредной и иммуногенной для глубокостельных коров и телят в возрасте 10-15 дней.

Однако смешанный характер проявления вирусных респираторно-кишечных инфекций и особенности циркуляции этих вирусов предполагает большую эффективность ассоциированных вакцин и применение моновакцин не обеспечивает положительной динамики заболеваний (Вазир Я., Белоусова Р.В., Устинова Г.И. Испытания бивалентной вакцины против аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота на кроликах с использованием иммуномодуляторов // Ветеринарная патология. - 2007. - №3(22). - С.199-202; Матвеева И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных // Автореф. дис. … док. биол. наук. - Щелково. - 2008. - 53 с.).

Известна вакцина против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сухая, культуральная ассоциированная, содержащая лиофилизированный вакцинный вирус ПГ-3 (штамм «ПТК-45/86») и вакцинный вирус инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2»), выращенные в культуре клеток почки теленка и защитную среду высушивания. Вакцину вводят подкожно телятам в возрасте 1-6 месяцев двукратно, 7 месяцев и старше - однократно.

Известна вакцина, ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная. В состав вакцины входят инактивированные антигены ПГ-3 (штамм «ПТК-45/86»), инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2») и возбудителя хламидийного аборта коров (штамм «250»), эмульгированные в масляном адъюванте. Телят иммунизируют с 10-20-дневного возраста двукратно, в дозе 1 см³, вакцину вводят внутримышечно; телятам старше 6 месяцев, коровам и быкам-производителям в дозе 2 см³.

Известна вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (Комбовак - К), представляющая собой комплексный препарат для профилактики 3-х вирусных и бактериальных болезней крупного рогатого скота, характеризующихся желудочно-кишечным синдромом. Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий: соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К80, К30; адгезивных антигенов К99, F-41; термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов.

Известна вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (Комбовак-Р). Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и двух видов пастерелл: Pasteurella multocida (серовары A, В и D) Pasteurella haemolitica.

Известна вакцина комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней телят (Комбовак), представляющая собой композицию из 6 штаммов вирусов, инактивированных формалином и сорбированных на 6%-ном геле гидроокиси алюминия (ГОА) и сапонина, предназначенная для иммунизации телят, нетелей и коров, в хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным и респираторным болезням.

Известна вакцина «Тривак» (ВИЭВ) для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (Юров К.П., Вечеркин А.С., Шуляк А.Ф., Жидков С.А. / Заявка на патент 96123539/13 от 11.12.1996). Вакцина содержит антиген из аттенуированного вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2»), антиген из аттенуированного вируса ВД-БС (штамм «ВК-1), аттенуированного вируса парагриппа-3 (штамм «ПТК-45/86») и защитную среду на основе желатина и сахарозы. Вакцину вводят внутрикожно, двукратно, телятам в дозе 0,2 см³, взрослым животным по 0,4 см³.

Общим недостатком вышеперечисленных известных вакцин является отсутствие в их составе антигена аденовирусов КРС 1-ой и 11-ой подгрупп, что значительно снижает их эффективность.

Из приведенной информации следует, что в настоящее время отечественных аналогов вакцин, предназначенных для специфической профилактики вирусных респираторных инфекций телят и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, изготовленных на основе антигенов аденовирусов крупного рогатого скота I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, не существует.

Литературные данные свидетельствуют о том, что во многих странах производятся моно-, би- и поливалентные вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, отличающихся как по набору аденовирусных компонентов, сочетанию их с другими вирусами, а также по методам их изготовления, так их применения (Gole J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - №7. - Р.836-839; Phillipp J.I.H., Sands J.H. The Isolation of Bovine Adenovirus Serotypes 4 and 7 in Britain // Res. Vet. ScL - 1972. - 13. - P.386-387; Tribe G.W., Kerry J.B. Combined bovine parainfluenza and adenovirus vaccine // Vet. Rec. - 1969. - V.84. - P.299-303). В работах ряда авторов была показана перспективность и целесообразность создания ассоциированных вакцин с обязательным включением в их состав двух подгрупп аденовирусов: как 1, 3-го, так и 4 и 5-го серотипов. Причем была установлена более высокая иммуногенность ее с адъювантом из эмульсии твин-арлацель-байол, чем с адъювантом из 10-20% гидроокиси алюминия (Bürki F., 1973; Schipper E., Nicolet J., König H., Steck F. Virus bedingte Respirations-Krankheiten in Kälber und Ridermastbetreiben // Schweiz. Arch. Tierheilkunde. - 1972. - H.114. - S.334-361). Активную иммунизацию телят осуществляли по различным программам в зависимости от эпизоотической ситуации. Причем вакцинируют как молочное стадо, так и молодняк различного возраста.

1. В Венгрии впервые применили живую аденовирусную вакцину, приготовленную из штамма ТНТ/62 4-го типа, прошедшего 72 пассажа в культуре клеток тестикул бычка (Bartha A. Immunization experiments on calves with type 4 bovine adenovirus // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1967. - V.-17. - P.209-216).

2. В Болгарии была сконструирована инактивированная вакцина с адъювантом на основе антигенов вируса инфекционного ринотрахеита, вируса ПГ-3, аденовируса типа 1 (штамм «Bovine-10») и аденовируса типа 3 (штамм «WBR-1»). Было изготовлено 16 серий вакцины и испытание их проводилось на 170 телятах в возрасте 45-180 дней. Животные вакцинировались подкожно, двукратно с 23-дневным интервалом в дозе 7 мл на теленка, а также 54 стельные коровы. У телят специфические антитела впервые были выявлены на 14-й день после вакцинации, а максимальные титры антител достигали через 28 дней после ревакцинации (Haralambiev H., Draganov, M., Zwetkov P. Hyperimmunserum Against Myxovirus Parainfluenza-3 and Bovine Adenovirus in Prophylaxis of Respiratory Disease in Calves // Arch. Exptl. Vet. Med. - 1972. - V.26. - P.273-276).

3. В Великобритании для специфической профилактики респираторных вирусных инфекций использована вакцина «Pneumovac Plus (C-Vet)». В состав вакцины входят антигены парагриппа-3 (штамм SF-4), аденовируса 3 серотипа (штамм «WBR-1»), реовируса 1 типа (штамм «Lang strain»), вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек (штамм «Nadi»), вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и гель гидроокиси алюминия. Препарат вводится внутримышечно молодняку крупного рогатого скота, начиная с 14-дневного возраста, повторно вакцинируют в 5- и 10-недельном возрасте (Morzaria S.P., Richards M.S., Harkness J.W., Maund B.A. A field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine // The Veterinary Record. - 1979. - V.11. - №3. - P.410-414).

Известна «Вакцина против энзоотической бронхопневмонии для крупного рогатого скота инактивированная», содержащая инактивированная антигены вируса парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса крупного рогатого скота 1-го (штамм «Bovine 10»), 3-го (штамм «WBR-1») серотипов первой подгруппы и 5-го (штамм «Munich 293/3») серотипа второй подгруппы, реовируса 1-го (штамм «Lang») и 3-го (штамм «Dearing») серотипов, репродуцированные в соответствующих чувствительных биологических системах и подвергнутые инактивации формалином и ГОА-адъювант в эффективном соотношении (Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia, inactivated, for cattle («Bovigrip») Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH. - 1992. - P.37-39)

Следовательно, вакцина содержит в своем составе антигены аденовирусов 1-ой и 2-ой подгрупп, реовирусов I и III серогрупп, а также вируса парагриппа-3. Вакцину вводят подкожно в дозе 5 см³, телят иммунизируют двукратно с интервалом от 4-недельного до 6-недельного возраста их жизни.

Известна «Вакцина против энзоотической бронхопневмонии и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инактивированная для крупного рогатого скота», содержащая инактивированные антигены парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса КРС 1-го (штамм « Bovine 10») и 3-го (штамм «WBR-1») серотипов, вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «Calw»), реовируса 1-го (штамм «Lang») и 3-го (штамм «Dearing») серотипов, репродуцированных в чувствительных биологических системах и подвергнутые инактивации формалином и ГОА-адъювант в эффективном соотношении. Вакцину под названием «Bovigrip plus» производит крупнейшая в мире немецкая компания «Hoecht Veterinar GmbH», успешно используется во многих странах Западной Европы (Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia and infectious bovine rhinotracheitis (IBR), inactivated, for cattle. Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH, 1992. - P.41-43).

1. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является «Инактивированная концентрированная поливалентная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота» (Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Тиганова Н.В., Киш Л.К., Кузнецов Д.П. / Заявка на изобретение №2010152945/10 от 24.12.2010), включающая раздельное культивирование вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, сбор культуральной жидкости и получение антигенов, отличающаяся тем, что дополнительно вводят штамм «Bovine-10» аденовируса 1-ой подгруппы, который культивируют в культуре клеток «ПТ-80», получают вирус с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД₅₀ /мл, затем полученные вирусы инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 ч при рН 7,2-7,4 и концентрируют в 5 раз ПЭГ-6000 в конечной концентрации 9-11% в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия, далее полученные антигены смешивают в равных объемах 1:1:1, добавляют официнальный адъювант - гидроокись алюминия до 2-3% конечной концентрации и получают вакцину.

Анализ приведенной информации показывает, что проблема специфической профилактики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота до настоящего времени не решена. Создание ассоциированных вакцин против аденовирусной инфекции КРС с учетом превалирующих этиологических вирусных агентов, выявляемых проведением сероиммунологического мониторинга, могло быть перспективным и экономически целесообразным.

Прототипом - исходным образцом при создании новой вакцины, предлагаемого изобретения являлась «Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота» (Белоусова Р.В., Лобова Т.П., Третьякова И.В., Вазир Я. / Заявка на изобретение №2008103716/13 от 06.02.2008). Из описания изобретения к патенту следует, что вакцина включает в себя антигены аденовируса первого серотипа (штамм «Bovine-10»), штамма «Орегон» вируса вирусной диареи, инактивированных формалином, концентрированных в 5 раз полиэтиленглюколем-6000 (ПЭГ-6000) и депонированных на гидроокиси алюминия в эффективном соотношении. Предложенную вакцину вводят животным внутримышечно с интервалом 13-16 дней в дозе 1 см³.

Вакцина-прототип имеет существенные недостатки:

- она не обеспечивает защиту животных от герпесвирусной инфекции типа I и парагриппа-3;

- она не обеспечивает защиту животных от аденовирусной инфекции, вызываемой аденовирусами второй подгруппы, которые в антигенном отношении отличаются между собой и могут вызывать различные патологические процессы в организме животных, несмотря на применение вакцин содержащих антигены аденовирусов иных подгрупп;

- пятикратная концентрация антигенных вирусных компонентов вакцины-прототипа может быть не достаточной для создания напряженного иммунитета у вакцинированных животных;

- гидроокись алюминия - это относительно слабый адъювант, не способный обеспечить длительное освобождение антигена из места введения вакцины, использованный нами масляный адъювант дает эмульсию типа «вода-масло», которая освобождает антигены в течение более длительного времени, чем гидроокись алюминия и аналогичные адсорбенты, это объясняет более мощную иммунную стимуляцию после первой иммунизации животных масляными вакцинами.

В связи с этим проблема создания вакцины ассоциированной, инактивированной, концентрированной и эмульсионной против аденовирусной инфекции, включая антигены I и II подгрупп, герпесвирусной инфекции типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, обладающей высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по ее совершенствованию.

Необходимость разработки и производства этой ассоциированной вакцины обусловлена многообразием форм клинического проявления аденовирусной инфекции у телят различных возрастных групп, широкой распространенностью ее в животноводческих комплексах РФ, течением болезни преимущественно по типу смешанных инфекций, формируемых чаще всего с участием герпесвируса типа I, вирусов парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек.

Результаты исследований, проведенные нами, показали, что установлена серопозитивность 65,0% исследованных проб к вирусу ПГ-3, к аденовирусу 48,3%, к герпесвирусу типа I 41,0%, к ВД-БС 39,4%. Полученные результаты указывают на факт циркуляции этих возбудителей среди различных возрастных групп крупного рогатого скота (табл.1).

Известно положение о том, что в естественных условиях одновременное или последовательное воздействие на организм животных нескольких возбудителей, взаимообуславливая действие друг друга, усугубляет и ухудшает течение инфекционного процесса. Это подтверждено результатами исследований как зарубежных, так и отечественных ученых.

Задачей настоящего изобретения является получение высокоиммуногенной ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против аденовирусной, герпесвирусной типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на основе производственных штаммов, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригодных для изготовления ассоциированного эмульсионного препарата, создающего эффективную защиту плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, а также стельных коров и телок от указанных выше респираторно-кишечных вирусных инфекций и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, широко распространенных и постоянно циркулирующих в скотоводческих предприятиях Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала эффективных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью, существенно отличающейся по комплексу вирусных антигенных компонентов от имеющихся средств профилактики, производимыми в настоящее время в РФ, и широким спектром специфической защиты плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, стельных коров и телок, от инфицирования эпизоотическими (полевыми) штаммами аденовирусов I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, парагриппа-3 и вируса ВД-БС, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Предлагаемая вакцина содержит активное биологическое вещество в виде авирулентных очищенных и концентрированных антигенов штаммов «Adeno III WBR-1» 3-го серотипа первой подгруппы и «Adeno IV Wey bridge СТ2» 4-го серотипа второй подгруппы, штамма «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I, штамма «SF-4» вируса парагриппа-3, штамма «ВК-1» вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, полученных в культурах клеток млекопитающих и целевых добавок в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении. Первые два штамма аденовирусов получены из Центральной ветеринарной лаборатории МСХ Великобритании, изучены их иммунобиологические свойства. Штаммы аденовирусов «Adeno III WBR-1», «Adeno IV Weybridge CT2» и вируса парагриппа-3 «SF-4» депонированы в лаборатории по хранению и изучению штаммов особо опасных болезней животных (музей штаммов), используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности животных (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I и «ВК-1»вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек КРС депонированы в коллекции ФГБУ «ВГНКИ».

Сущность изобретения заключается в следующем: «Ассоциированная вакцина против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» содержит концентрированные антигены аденовирусов КРС I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, вируса ВД-БС крупного рогатого скота, эмульгированных в масляном адъюванте, при следующем соотношении компонентов, об.% 1:1:1:1:1 (инактивированных формалином до конечной концентрации 0,2-0,3%).

Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы штамм «Adeno III WBR1-ДЕП»), полученная в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK) с инфекционным титром не менее 6,25 lg ТЦД₅₀/мл	10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/мл	10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия герпесвируса типа I крупного рогатого скота штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 7,5 lg ТЦД₅₀/мл	10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, полученная в перевиваемой культуре клеток легких эмбриона коровы (ЛЭК) штамм «SF-4-ДЕП» с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/мл и активностью в РГА не менее 6 lg₂ (1:64)	10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия вируса ВД-БС крупного рогатого скота штамм «ВК-1-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/мл	10,0-11,0
Целевая добавка - адъювант	до 100,0

Штаммы вирусов, используемых в качестве производственных, характеризуются следующими признаками и свойствами:

- штамм «Adeno III WBRl-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы и штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы являются представителями рода Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Вирусные частицы правильной многранной (икосаэдры) формы. Геном вирусов представлен двухспиральной, нефрагментированной линейной молекулой ДНК. Вирионы имеют диаметр 70-80 нм, вирусы устойчивы к эфиру, хлороформу, сапонину, дезоксихолату натрия, трипсину. Обработка хлороформом повышает инфекционный титр вирусов на 0,5 lg. Аденовирусы устойчивы к изменению рН среды от 3,0 до 9,0 в течение 3 ч при комнатной температуре. При 4° хранятся более 6 месяцев, при комнатной температуре 1-4 месяца, длительно сохраняют инфекционную активность при -30°С. Вирусы устойчивы к повторному замораживанию и оттаиванию, сохраняются при рН 6,0-9,0 и хорошо переносят лиофильную сушку. Штаммы не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Штамм аденовируса «Adeno III WBR-1-ДЕП» в культуре клеток линии МДВК и штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» в культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) вызывают ЦПД через 48-72 часов после заражения. Видимые цитопатические изменения, индуцируемые вирусом, характеризуются укрупнением и округлением клеток. В последующем клетки постепенно группируются в конгломераты в виде комков, гроздьев, образуя пустоты в монослое, напоминающие соты.

- Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I крупного рогатого скота герпесвируса типа I рода Herpesvirus семейства Herpesviridae представляет собой однородную популяцию ДНК-содержащего вируса, полученный путем воздействия ультрафиолетовыми лучами на исходный вирулентный вирус ИРТ в дозе, близкой к пороговой. Капсид гексогональной формы, диаметр 100-110 нм, состоит из 162 капсомеров. Вакцинный штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» обладает высокими иммуногенными свойствами и определен нами в качестве производственного для изготовления ассоциированной вакцины.

Герпесвирус типа I репродуцируется в монослое клеток почки эмбриона коровы и его цитопатогенное действие наступает через 48-96 часов. Вирус, выращенный в монослое перевиваемых линий МДВК, обладает стабильной активностью и достигает 6,75-7,25 lg ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса сопровождается подавлением митотической активности клеток и образованием внутриядерных включений. Вирус легко концентрируется и очищается центрифугированием в градиенте коллоидной окиси кремния - полиэтиленгликоля. Осадить его можно метанолом, ацетоном, сернокислым магнием и сернокислым аммонием. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют вирус немедленно. При температуре -60-70°С вирус выживает 7-9 месяцев, температура 56° инактивирует его через 20 мин, 37° - через 4-10 суток, 22° - через 50 суток. При 4° активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1 lg. Лиофилизация почти не снижает его активность.

- штамм «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота является представителем рода Paramyxovirus семейства Paramyxoviridae. Вирионы округло-овальной формы, состоящие из оболочки и внутреннего компонента. Диаметр вирионов 150-250 нм, геном вируса представлен несегментированной однонитевой линейной РНК. При 4° без консерванта через 3-4 месяца полностью утрачивает инфекционную активность, при -60° вирус сохраняется инфекционным в течение нескольких месяцев. При многократном замораживании и оттаивании вирусной суспензии инфекционная активность быстро утрачивается. Штамм «SF-4-ДЕП» не агглютинирует эритроциты кур, лошади, хорошо агглютинирует эритроциты морской свинки и в более низком титре эритроциты кролика, свиньи, коровы, обезьяны, мыши, человека (0 группы). Штамм чувствителен к эфиру и дезоксихилату, к кислому рН (3,0).

Штамм «SF-4-ДЕП» вируса ПГ-3 в культуре клеток ЛЭК вызывает ЦПД через 72 ч после заражения. Видимые цитопатические изменения, индуцируемые вирусом, характеризовались образованием гранулированных и вакуолизированных округлых клеток или многоядерных симпластов, возникших в результате слияния нескольких клеток. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3, вызывают диффузную адсорбцию эритроцитов морской свинки.

- штамм «ВК-1-ДЕП» вируса ВД-БС крупного рогатого скота является представителем рода Pestivirus семейства Flaviviridae, геном вируса представлен однонитевой РНК. Величина вирионов 40-100 нм, плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы 1,5-1,19 г/см³.

Чувствителен к эфиру, хлороформу и трипсину. Прогревание при 50°С в течение 10 мин приводит к инактивации аттенуированного вируса. Замораживание при -20°С и оттаивание снижает титр инфекционной активности в культуре клеток. В отличие от исходного эпизоотического штамма вируса аттенуированный штамм приобрел большую устойчивость к воздействию рН 3,0.

Не агглютинирует эритроциты морской свинки, барана, крупного рогатого скота и птиц. Размножается с развитием цитопатического действия в культурах клеток ПЭК, почки теленка (ПТ), почки эмбриона свиньи (ПЭС). По мере развития ЦПД клетки постепенно отторгаются от поверхности стекла, образуя островки. Вирус достигает инфекционного титра 10^6,0-6,5 ТЦД₅₀/мл.

В организме морских свинок и крупного рогатого скота вызывает образование вируснейтрализующих антител. У вакцинированного крупного рогатого скота стимулирует образование местного и гуморального иммунитета. Вызывает слабую реакцию у некоторых вакцинированных телят при подкожном, внутримышечном и интраназальном введениях пятикратной иммунизирующей дозы: 1-2-дневное повышение температурной реакции тела на 0,3-0,5°С, незначительное снижение количества лейкоцитов, без других отклонений от клинической и физиологической нормы (Жидков С.А., Крюков Н.Н. Штамм вируса Bovine viral Diarrhea-mucosal disease virus для изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота // Авт. свидетельство SU 1322673 от 09.09.85). В лиофилизированном состоянии при 4-10°С хранится в течение года, практически не снижая инфекционной активности.

Штаммы вирусов, принятые заявителем в качестве производственных, обладают высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, отличаются высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Они свободны от контаминации бактериями, грибковой микрофлорой, микоплазмами и сопутствующими вирусами. Экспериментально в лабораторных условиях и производственных опытах подтверждена возможность их использования для изготовления ассоциированной вакцины, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.

2. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа (ассоциированные вакцины «Bovigrip», «Bovigrip plus», в состав которых включены инактивированные антигены парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса КРС 1-го (штамм «Bovine 10») и 3-го (штамм «WBR-1») серотипов, вируса инфекционного ринотрахеит

Патент 2517733