Антитела, специфично связывающиеся с рецепторами эпидермального фактора роста

Антитела, специфично связывающиеся с рецепторами эпидермального фактора роста

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR).

Предшествующий уровень техники

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) представляет собой трансмембранный белок типа I массой 170 кДа, который известен сверхэкспрессией во многих человеческих опухолях, например, в карциноме легкого, молочной железы, ободочной кишки, желудка, мозга, мочевого пузыря, головы, шеи, яичников и предстательной железы. Его сверхэкспрессия часто сопровождается продукцией EGFR-лигандов, TGF-α (трансформирующего фактора роста α) и EGF (эпидермального фактора роста), и доказано, что связывание лигандов с EGFR индуцирует клеточную пролиферацию и рост опухоли. Поэтому блокировка взаимодействия между такими лигандами и EGFR путем использования антитела против EGFR может ингибировать рост опухоли, и эффективность такого применения была доказана в экспериментах с использованием моноклональных антител против EGFR.

Антитело C225 (торговое название: Erbitux; ImClone, США), используемое в настоящее время в клинических применениях для лечения метастатических колоректальных раковых заболеваний, является химерным антителом, содержащим вариабельные области мышиного антитела, связанные с константными областями человеческого антитела IgG1 (в которое включено около 30% мышиных аминокислотных последовательностей). Показано, что C225 ингибирует рост опухолевых клеток, фосфорилирование EGFR in vitro и образование опухоли у голой мыши, а также полностью уничтожает ксенотрансплантаты человеческой опухоли у мышей в случае их использования вместе со специфичным химиотерапевтическим агентом. Вместе с тем применение указанного антитела связано с проблемой индуцирования иммунных реакций у пациентов, получавших лечение этим антителом (примерно у 10%). Таким образом, существует потребность в улучшенных терапевтических антителах против EGFR.

Терапевтические агенты для направленного лечения составляют около 50% противораковых лекарственных средств, одобренных за последнее время Управлением по контролю за продуктами и лекарственными США (FDA). Такие антитела обеспечивают направленную специфичность и способность эффективно вовлекать иммунную систему, что в комбинации с продолжительными периодами биологической полужизни этих антител привлекло внимание исследователей к их терапевтическому потенциалу. В результате в последнее время ряд антител для лечения рака были разрешены FDA для применения в США. Антитела имеют большое значение во многих терапевтических подходах к заболеваниям, и их применение становится еще более привлекательным с появлением современных технологий, позволяющих разрабатывать полностью человеческие антитела.

Авторы настоящего изобретения осуществили попытку разработать новые улучшенные антитела, имеющие новые участки, определяющие комплементарность (CDR), и обнаружили, что такие антитела можно применять при лечении рака путем блокировки EGFR-опосредованной передачи сигнала.

Сущность изобретения

Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение нового антитела, специфично связывающееся с рецептором эпидермального фактора роста.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение ДНК, которые соответственно кодируют вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи указанного антитела, и вектора экспрессии, содержащего указанные области.

Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение клеточной линии, трансформированной вектором экспрессии.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей указанное антитело.

Согласно одному аспекту, настоящее изобретение предоставляет антитело, специфично связывающееся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и содержащее: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участки, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно; b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно; c) константную область тяжелой цепи; и d) константную область легкой цепи.

Дополнительно, изобретение относится к антителу, специфично связывающемуся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и содержащему: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участки CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно; b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 5 и 6, соответственно; c) константную область тяжелой цепи; и d) константную область легкой цепи.

В соответствии с другим аспектом, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи антитела, и к вектору экспрессии, содержащему указанные области.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, оно относится к клеточной линии, трансформированной указанным вектором экспрессии.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения, оно относится к композиции для лечения рака, содержащей указанное антитело.

Краткое описание фигур

Вышеуказанные и другие задачи и признаки настоящего изобретения станут понятными из следующего описания изобретения, предоставленного в сочетании с сопроводительными фигурами, которые, соответственно, показывают:

Фиг.1: фотоснимок электрофореза (1% агарозный гель), показывающий синтезированные полимеразной цепной реакцией (ПЦР) ДНК, которые кодируют, соответственно, вариабельные области тяжелой цепи (VH) и вариабельные области легкой цепи (VL) настоящего изобретения;

Фиг.2: карту вектора фагового дисплея pKS4H, содержащего вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела по изобретению;

Фиг.3: диаграмму, показывающую способ селекции антител из библиотеки антител с помощью технологии биопэннинга;

Фиг.4: аминокислотные последовательности одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) антител по изобретению ER2 и ER79;

Фиг.5: карту вектора экспрессии для экспрессии тяжелых цепей ER2-Heavy-pRC13 или ER79-Heavy-pRC13 человеческого антитела настоящего изобретения;

Фиг.6 и 7: карты вектора экспрессии для экспрессии легких цепей ER2-Light-pKC12 и ER79-Light-pC12 человеческих антител настоящего изобретения;

Фиг.8: анализ SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) тяжелой цепи и легкой цепи, экспрессируемых трансформантом;

Фиг.9: относительную аффинность человеческих антител (ER2 и ER79), химерного антитела (C225, Erbitux) и другого антитела (ER414) в отношении рецептора эпидермального фактора роста;

Фиг.10: график проточной цитометрии, показывающей связывание антител по изобретению с рецептором эпидермального фактора роста, который сверхэкспрессируется в раковой клеточной линии (A431);

Фиг.11: ингибирующее действие антител по изобретению на фосфорилирование рецептора эпидермального фактора роста; и

Фиг.12: результаты измерения поверхностного плазмонного резонанса, раскрывающие сайты связывания с эпидермальным фактором роста антител по изобретению, и сайты связывания химерного антитела C225 (Erbitux).

Подробное описание изобретения

Далее приведено подробное описание настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к антителу, специфично связывающемуся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) и содержащему a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащей участки, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно; b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно; c) константную область тяжелой цепи; и d) константную область легкой цепи. Предпочтительно, антителом может быть антитело, содержащее: a) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7; b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8; c) константную область тяжелой цепи; и

d) константную область легкой цепи.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к антителу, специфично связывающемуся с эпидермальным рецептором фактора роста (EGFR) и содержащему: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно; b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 5 и 6, соответственно; c) константную область тяжелой цепь; и d) константную область легкой цепи. Предпочтительно, антителом может быть антитело, содержащее: a) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7; b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10; c) константную область тяжелой цепи; и d) константную область легкой цепи.

Антитела по изобретению предпочтительно могут представлять собой человеческие антитела и отличаться блокировкой передачи сигнала, которая индуцируется эпидермальным фактором роста (EGF).

Антитела, специфично связывающиеся с эпидермальным рецептором фактора роста, предпочтительно могут быть выбраны с помощью модифицированного способа фагового дисплея (Smith, Science, 228, 1315-1317, 1985; и Hoogenboom & Chames, Immunol Today, 21, 371-378, 2000). В способе фагового дисплея ген (ген III), кодирующий поверхностный белок нитевидного фага (например, М13, Fd или Fl), сплавляют с геном, кодирующим представляющее интерес антитело, и таким образом вирусные частицы с расположенным на поверхности сплавленным антителом продуцируются в виде формы антитело-фаг. Следовательно, представляющее интерес антитело может быть выбрано из фаговой библиотеки посредством технологии биопэннинга, используя высокую специфичность и аффинность данного антитела и свойства высокой инфективности данного фага (Burton & Barbas, Adv. Immunol., 57, 191-280, 1994; Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12, 433-455, 1994; и Hoogenboom et al., Immunotechnology, 4, 1-20, 1998). Вектором фагового дисплея может являться pKS4H (см. корейский патент № 0635370) или pCANTAB5E, предпочтительно, pKS4H.

В настоящем изобретении человеческое антитело ER414 выбирали из фаговой библиотеки и тестировали его свойства аффинности и способности к нейтрализации рецептора эпидермального фактора роста (фиг.9 и 11). Антитело ER414 обладает способностью к нейтрализации, но его аффинность была в 16 раз ниже, чем у коммерчески доступного антитела C225. Соответственно, осуществляли отбор улучшенных антител с показателями аффинности, подобными C225, используя способ созревания аффинности. Таким образом, создавали библиотеку предварительно отобранных антител посредством аминокислотной рандомизации областей, определяющих комплементарность, отбирали антитела со зрелой аффинностью, используя технологию биопэннинга, и, наконец, отбирали антитела (ER2 и ER79), имеющие сходные показатели аффинности с антителом C225.

Результаты анализа последовательностей антитела ER2 показали, что CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно. С другой стороны, CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела ER79 имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи имеют, соответственно, аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 5 и 6.

Константные области тяжелой цепи или константные области легкой цепи антител по изобретению могут быть идентичны соответствующим областям человеческого антитела, и, предпочтительно, могут представлять собой аминокислоты с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:43 и 44, соответственно.

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащей CDR1, CDR2 и CDR3, имеющим аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11, которая кодирует аминокислотную последовательности SEQ ID NO:1, полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:12, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи антитела, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:15, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:16, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:17, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:18, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

Дополнительно, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:9, 5 и 6, соответственно. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:19, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:16, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:17, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи антитела, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. Предпочтительно, ДНК может содержать полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:20, которая кодирует аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии для экспрессии вариабельной области тяжелой цепи антитела, которая специфично связывается с эпидермальным рецептором фактора роста (EGFR), содержащему ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела. Предпочтительно, вектор экспрессии может представлять собой "ER2-Heavy-pRC13" или "ER79-Heavy-pRC13", карта которых показана на фиг.5.

Более конкретно, данный вектор может быть получен путем вставки VH-фрагмента антитела, отобранного способами созревания аффинности (1-a: ER2Ab-H или 1-b: ER79Ab-H), в подходящий вектор, например, вектор pRC13 (депонированный под номером KCLRF-BP-00054; корейский патент № 523732).

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии для экспрессии вариабельной области легкой цепи антитела, которая специфично связывается с эпидермальным рецептором фактора роста (EGFR), содержащему ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела. Предпочтительно, вектор экспрессии может представлять собой "ER2-Light-pKC12", карта которого показана на фиг.6, или "ER79-Light-pKC12", карта которого показана на фиг.7.

Более конкретно, такие векторы могут быть получены путем вставки каждого VL-фрагмента антител (2-a: ER2Ab-L или 1-b: ER79Ab-L), отобранных способами созревания аффинности, в подходящий вектор, например, в вектор pKC12 (депонированный под номером KCLRF-BP-00054; корейский патент № 523732).

Настоящее изобретение предоставляет линии клеток животных, трансформированных вектором экспрессии, для экспрессии вариабельной области тяжелой цепи антитела по изобретению, и вектор экспрессии для экспрессии вариабельной области легкой цепи антитела по изобретению. Вектор экспрессии для экспрессии вариабельной области тяжелой цепи антитела по изобретению предпочтительно может представлять собой ER2-Heavy-pRC13 или ER79-Heavy-pRC13, и вектор экспрессии для экспрессии вариабельной области легкой цепи антитела по изобретению может предпочтительно представлять собой ER2-Light-pKC12 или ER79-Light-pKC12. Клеточная линия животных может представлять собой клеточную линию CHO (яичника китайского хомяка), клеточную линию HEK 293 или NSO, и предпочтительной является клеточная линия CHO (яичника китайского хомяка).

Могут быть получены антитела согласно настоящему изобретению, в которых вместе объединены вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи.

Аффинность антител по изобретению в отношении антигена может быть измерена, например, с использованием конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (Kim et al., Hybridoma, 20, 265-272, 2001). Как показано на фиг.9, аффинность антитела E2 настоящего изобретения аналогична аффинности антитела C225, тогда как аффинность антитела ER79 в два раза ниже, чем аффинность антитела C225. Дополнительно, с помощью проточной цитометрии было продемонстрировано связывание данных антител с рецептором эпидермального фактора роста, сверхэкспрессированного в линии раковых клеток (FACS) (фиг.10), и подтверждена его способность к нейтрализации в эксперименте ингибирования фосфорилирования рецептора эпидермального фактора роста в клетках опухоли молочной железы (фиг.11). Таким образом, антитела настоящего изобретения можно применять в качестве антител для лечения рака путем ингибирования передачи сигнала посредством рецептора эпидермального фактора роста.

В отношении результата настоящее изобретение предоставляет композицию, предпочтительно фармацевтическую композицию для лечения рака, содержащую данное антитело. Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере одно из веществ, выбранных из группы, состоящей из цисплатина, гемцитабина, доксорубицина, 5-фторурацила, ирринотекана и паклитаксела.

Композиция содержит антитело ER2 или ER79, или трансформанты, содержащие указанные антитела, в качестве активного компонента, и дополнительно содержит один или более эффективных компонентов, имеющих те же самые или аналогичные функции для указанного активного компонента. В дополнение к активному компоненту композиция настоящего изобретения может содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей, таких как солевой раствор, стерильная вода, раствор Рингера, забуференный солевой раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол, липосомы и смесь, содержащую один или более из указанных выше компонентов. В случае необходимости, могут быть дополнительно добавлены общепринятые добавки, такие как антиоксидант, буферный агент и бактериостатический агент. Композиции настоящего изобретения могут быть составлены в различных формах, включающих водные растворы, суспензии и эмульсии для инъекции, пилюли, капсулы, гранулы или таблетки, путем смешивания с разбавителями, диспергирующими агентами, поверхностно-активными веществами, связующими агентами и лубрикантами. Специфичное к клетке-мишени антитело или другие лиганды можно смешивать с одним из указанных выше носителей для доставки к клетке-мишени. Дополнительно, композиция может быть получена в подходящей форме в соответствии с ингредиентами, следуя способу, представленного в издании Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить парентерально (например, путем внутривенной, подкожной, перитонеальной или местной инъекции), и предпочтительной является внутривенная инъекция. В некоторых случаях, при солидных опухолях более предпочтительным является местное введение, которое способствует быстрой и простой доставке антитела. Эффективная доза композиции может быть определена в соответствии с массой, возрастом, полом, состоянием здоровья, питания, частотой введения, способом введения, выведением и степенью тяжести болезни. Однократная доза композиции, содержащей человеческое антитело или трансформант, составляет примерно от 5 до 500 мг/м², и указанную дозу можно вводить ежедневно или еженедельно. Эффективная доза может быть подобрана врачом, осуществляющим лечение больных со злокачественными опухолями.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить для лечения злокачественных опухолей как таковые или в сочетании с хирургическим вмешательством, гормональной терапией, химиотерапией и биологическими регуляторами.

Следующие примеры приведены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1: Выделение РНК

Для отбора антител, специфично связывающихся с рецептором эпидермального фактора роста, конструировали библиотеку человеческих антител. Использовали смесь общей РНК человеческого костного мозга, общей РНК человеческой вилочковой железы, общей РНК человеческой селезенки и РНК человеческих

В-клеток. Все РНК, за исключением РНК человеческих В-клеток, были закуплены в компании Clontech (США), и РНК человеческих В-клеток выделяли следующим образом:

50 мл крови, взятой у здорового взрослого человека, разводили путем смешивания с 50 мл HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса; Sigma, США). В пробирку объемом 50 мл помещали 10 мл препарата Histoprep (Sigma) и добавляли к нему 20 мл разведенной крови. Для выделения лейкоцитов смесь центрифугировали со скоростью 3000 оборотов в минуту. Затем 2 мл выделенных лейкоцитов смешивали с 6 мл HBSS и центрифугировали при 1000 оборотов в минуту. Для выделения РНК 100 мкл лейкоцитов смешивали с 1 мл триазола (Life Technology, США).

В это время выделенную РНК разводили дистиллированной водой и измеряли спектральную поглощательную способность при 260 нм для количественного расчета (1,8 мкг/мкл; спектрофотометр Ultraspec 2000 UV-VIS, GE, США). Подробное описание методики:

1 мл триазола добавляли к 100 мкл лейкоцитов, тщательно взбалтывали и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Затем добавляли 200 мкл хлороформа, энергично взбалтывали в течение 15 секунд и оставляли на 3 мин. Затем смесь центрифугировали в условиях температуры 2~8°C в течение 15 минут со скоростью 15000 оборотов в минуту, затем супернатант переносили в новую пробирку. Добавляли 500 мкл изопропилового спирта и тщательно перемешивали, затем оставляли при комнатной температуре на 10 мин. После этого смесь центрифугировали при температуре 2~8°C со скоростью 15000 оборотов в минуту в течение 5 минут для удаления супернатанта. К смеси добавляли 1 мл 75% этанола, затем смесь центрифугировали для удаления этанола в условиях температуры 2~8°C в течение 5 минут со скоростью 15000 оборотов в минуту, после этого осадок РНК сушили при комнатной температуре в течение 5 мин, добавляли 150 мкл дистиллированной воды для суспендирования осадка РНК, и измеряли спектральную поглощательную способность суспензии при 260 нм. Остаток сохраняли при -20°C.

Пример 2: Амплификация генов антитела

1 мкг РНК, выделенной в примере 1, и 1 мкл pd(T)_12-18 (0,5 мкг/мкл) смешивали с дистиллированной водой до получения конечного объема 12,5 мкл. Проводили реакцию смеси при 70°C в течение 2 минут и охлаждали на льду. Затем добавляли 5× буфер для реакции, смесь 10 мМ дезоксинуклеозидтрифосфата (дНТФ), рекомбинантный ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу MMLV (Clontech, США) до получения конечного объема 20 мкл, с последующей реакцией при 42°C в течение 1 часа и при 95°C в течение 5 минут для синтеза кДНК. Реакцию ПЦР проводили с использованием LiquiMix QM Premix, Magenta (Neurotics Inc, Korea), 4 мкл кДНК в качестве матрицы, 19 мкл дистиллированной воды и 1 мкл праймеров, сконструированных для связывания с вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи (каппа и лямбда), соответственно. Праймеры, использованные в ПЦР, и их нуклеотидные последовательности показаны в таблице 1.

Таблица 1 Праймеры, использованные для ПСР
Праймеры	Нуклеотидная последовательность	SEQ ID NO:
scFv-Прямой		21
scFv-Обратный		22
scFv-Обратный		23
VH1-Прямой		24
VH3-Прямой		25
VH4-Прямой		26
VH-Обратный		27
VK1/3A-Прямой		28
VK1/3B-Прямой		29
VK2-Прямой		30
JK_A-Обратный		31
JK_B-Обратный		32

JK_C-Обратный		33
VL_A-Прямой		34
VL_B-Прямой		35
JL_A-Обратный		36
JL_B-Обратный		37

Реакцию ПЦР проводили при 95°C в течение 5 минут, при 55°C в течение 2 минут, при 72°C в течение 2 минут в 30 циклов, наконец, при 72°C в течение 15 мин.

Амплифицированные ДНК антитела идентифицировали путем электрофореза в 1,2% агарозном геле (фиг.1). Как показано на фиг.1, были получены полосы ДНК в 350 п.о., соответствующие вариабельным областям тяжелых и легких цепей (каппа и лямбда). Согласно фиг.1, М обозначает размер, VH обозначает вариабельную область тяжелой цепи (полоса 1: вариабельная область тяжелой цепи I типа; полоса 2: вариабельная область тяжелой цепи типа III; и полоса 3: вариабельная область тяжелой цепи тип IV), VL обозначает вариабельную область легкой цепи (полоса 4: вариабельная область легкой цепи 1/3 κ; полоса 5: вариабельная область легкой цепи 2 κ; и полоса 6: вариабельная область легкой цепи λ).

Пример 3: Расщепление ДНК антитела ферментом рестрикции

VH и VL (каппа и лямбда), полученные в примере 2, подвергали расщеплению ферментами рестрикции SfiI/BspEI и BspEI/NotI, соответственно, затем расщепленные фрагменты выделяли из 1,2% агарозного геля и очищали с использованием комплекта Qiagen.

Пример 4: Лигирование ДНК антитела и получение библиотек

Вектор фагового дисплея pKS4H (Green cross Corp., Корея, см. корейский патент № 0635370) расщепляли, используя фермент рестрикции SfiI/BspEI, и подвергали сепарации, используя электрофорез в 1,2% агарозном геле, с последующей очисткой с использованием комплекта Qiagen. 30 мкг pKS4H смешивали с 3 мкг VH, полученных в примере 3, и к полученной смеси добавляли T4-лигазу ДНК (New England BioLabs, США) с последующей реакцией в течение ночи при 25°C. Лигированную смесь очищали с использованием комплекта Qiagen, и трансформировали в E. coli XL1-blue (Stratagene, США) путем электропорации. Трансформант культивировали в 100 мл среды в течение ночи, и выделяли плазмиду. Плазмида обозначена как "pKS4H-VH-ΔVL".

Плазмиду pKS4H-VH-ΔVL расщепляли ферментом рестрикции BspEI NotI и очищали, как описано выше. Затем 30 мкг плазмиды pKS4H-VH-ΔVL смешивали с 3 мкг VL ПЦР-ДНК, полученной в примере 3, и T4-лигазой ДНК (New England, BioLabs, США), затем проводили реакцию в течение ночи при 25°C. Лигированную смесь очищали с использованием комплекта Qiagen, и трансформировали в E. coli XL1-blue (Stratagene, США) путем электропорации. Трансформант культивировали при 37°C в течение 2 часов в 100 мл среды, содержащей карбенициллин и тетрациклин. Затем в среду инокулировали М13 хелперный фаг (Stratagene, США) и культивировали в течение 16 часов с получением фаговой библиотеки, как описано авторами Engberg et al. (Mol. Biotechnol., 6, 287-310, 1995). Тем временем из E. coli выделяли плазмиду, обозначенную как "pKS4H-VH-VL". Карта полученной плазмиды отображена на фиг.2.

Пример 5: Селекция антител, связывающихся с рецептором эпидермального фактора роста

Антитела, связывающиеся с EGFR, подвергали селекции путем модифицированной технологии пэннинга (Engberg et al., Mol. Biotechnol., 6, 287-310, 1996; и Kim et al., Gene, 241, 19-25, 2000). Более конкретно, EGFR (Sigma, США) разводили забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) и наносили на каждую иммунопробирку (NUNC, Дания). Затем фаговую библиотеку, полученную в примере 4, добавляли в иммунопробирку с нанесением и инкубировали течение 2 часов при 37°C. Связывание фагов с EGFR элюировали, используя 0,1M глициновый буфер (pH 2,0). Затем

E. coli XL1-blue инфицировали фагами, и добавляли фаг-хелпер. В течение ночи инкубировали E. coli при 37°C, и к смеси добавляли раствор, содержащий 20% ПЭГ 8000 и 15% NaCl. Затем собирали осажденные фаги (спасение фага), фаги снова реагировали в иммунопробирке с нанесенным EGFR, и процедуру пэннинга повторяли 4 раза. Посредством данной процедуры проводили селекцию человеческих антител, связывающихся с EGFR, ER2 и ER79. Процесс отбора человеческих антител с использованием библиотеки фаговых дисплеев показан на фиг.3.

Каждую колонию от 4-го пэннинга выращивали в 2 мл среды, следуя ранее описанному способу (Kim et al., Gene, 241, 19-25, 2000), затем индуцировали экспрессию антитела обработкой изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Индукцию антитела измеряли анализом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием покрытого EGFR 96-луночного планшета.

Пример 6: Анализ последовательностей выбранных антител

Колонии, секретирующие человеческие антитела ER2 и ER79, отобранные в примере 5, выращивали в течение ночи в 10 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина, затем из них выделяли плазмиды с использованием плазмидного мини-комплекта Qiagen (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США). Плазмиды расщепляли с SfiI/NotI, вставку фрагментов антител идентифицировали путем электрофореза в агарозном геле. Анализировали последовательность ДНК scFv, вставленную в плазмиду.

Нуклеотидные последовательности scFv анализировали с помощью секвенирующего праймера p033 SEQ ID NO:38 в Genotech (Daejeon, Корея). Последовательности ДНК scFv ER2, ER79 и M96 (мышиное антитело) транслировали в аминокислоты с использованием доступной в сети программы (www.expasy.org: инструмент трансляции ДНК в белок), и транслированные аминокислотные последовательности показаны на фиг.4. Обозначения на фиг.4 M96, ER2 и ER79 относятся к аминокислоте из scFv M96 (мышиное антитело) и ER2 и ER79 настоящего изобретения, соответственно. Как показано на фиг.4, человеческие антитела ER2 и ER79 имели разную аминокислотную последовательность.

Пример 7: Конструирование векторов экспрессии

Для превращения фрагментов антитела в интактные иммуноглобулины использовали векторы экспрессии антитела pRC13 и pKC12 (плазмиды для вставки вариабельной области человеческого антитела против поверхностного антигена вируса гепатита B; корейский патент № 523732; депонированный под номером KCLRF-BP-00054).

Каждый фрагмент VH был вставлен в сайт HindIII и ApaI вектора экспрессии тяжелой цепи pRC13. Как показано на фиг.5, проводили ПЦР-амплификацию ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей (VH) человеческих антител ER2 и ER79, с использованием соответствующего праймера SEQ ID NO:39 и 40, расщепленного HindIII/ApaI, и вставляли в pRC13, который расщепляли теми же ферментами рестрикции. Рекомбинантный вектор обозначали как "ER2-Heavy-pRC13" или "ER79-Heavy-pRC13". Использованные праймеры показаны в таблице 2.

Таблица 2 Праймеры, использованные для ПСР
Праймеры	Нуклеотидная последовательность	SEQ ID NO:
VH-Прямой		39
VH-Обратный		40

Тем временем, каждый VL-фрагмент вставляли в сайты NheI и ApaI вектора экспрессии легкой цепи pKC12. Как показано на фиг.6 и 7, каждую ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи (VL) человеческих антител ER2 и ER79, подвергали ПЦР-амплификации с использованием соответствующего праймера SEQ ID NO:41 и 42, расщепленного NheI/ApaI, и вставляли в pКС12, который расщепляли теми же ферментами рестрикции. Рекомбинантный вектор обозначали как "ER2-Light-pKC12" или "ER79-Light-pKC12". Использованные праймеры показаны в таблице 3.

Таблица 3 Праймеры, использованные для ПСР
Праймеры	Нуклеотидная последовательность	SEQ ID NO:
VL-Прямой		41
VL-Обратный		42

Пример 8: Конструкция линий животных клеток, секретирующих антитела

Перед трансфекцией клетки CHO (яичника китайского хомяка) в количестве 2×10⁵ выращивали в инкубаторе при 37°C в присутствии 5% CO₂ во флаконе T-25 (NUNC, Дания), заполненном средой МЕМ (Life Technologies, США), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки FBS (Life Technologies, США) в течение 24 часов до достижения 50% конфлюентности. Затем к 1,5 мл OPTI-МЕМ (Life Technologies Жизни, США) добавляли 30 мкг липофектина (Life Technologies, США) и оставляли без вмешательства в течение 90 минут при комнатной температуре. В то же самое время, смешивали 8 мкг ER2-Heavy-pRC13 и 7 мкг ER2-Light-pKC12, 8 мкг ER79-Heavy-pRC13 и 7 мкг ER79-Light-p C12 и доводили объем до 1,5 мл средой OPTI-МЕМ, затем инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. После 90 минут среду, содержащую липофектин, смешивали со средой, содержащей ER2-Heavy-pRC13, ER2-Light-pKC12 и ER79-Heavy-pRC13, и ER79-Light-pKC12, соответственно, и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Во время реакции из клеток удаляли среду, и клетки трижды промывали PBS для трансфекции. К промытым клеткам добавляли реакционную смесь и инкубировали в течение 6 часов. Через 6 часов реакционную смесь удаляли, добавляли среду МЕМ и инкубировали в течение 48 часов. Затем клетки обрабатывали трипсином (Life Technologies, США) для отделения их от флакона, разводили средой МЕМ, и пересевали в 96-луночный планшет (NUNC, Дания). При этом среда МЕМ не содержала рибонуклеозид и дезокирибонуклеозид, в то же время содержала 10% диализированную FBS (Life Technologies, США) и 550 мкг/мл G418 (Sigma, США). Замену среды свежей средой осуществляли каждые два дня. Супернатант культуры, образующей колонии, собирали для экспрессии антитела с использованием ELISA, и отобранные клетки переносили в 12-луночные планшеты. Клетки переносили в 6-луночный планшет и обрабатывали метотрексатом (MTX, Choongwae Pharma Corporation, Корея). Начальная концентрация MTX составляла 20 нМ, и ее повышали до 80 нМ, 320 нМ и 1 мкМ в соответствии с адаптируемостью клеток. Были отобраны клеточные линии, выжившие при концентрации 1 мкМ и показавшие высокий уровень секреции антитела. Культивирование массы проводили в инкубаторе в условиях 65 оборотов в минуту, 5% CO₂ и 37°C, используя флакон с мешалкой и среду без сыворотки. 10⁸ клеток культивировали во флаконе объемом 250 мл, заполненном 100 мл бессывороточной среды. Когда число клеток увеличивалось в два раза от исходной инокуляции, клетки собирали центрифугированием при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Собранные клетки снова культивировали во флаконе объемом 500 мл, заполненном 200 мл среды. Когда число клеток увеличивалось в два раза от исходной инокуляции, клетки собирали центрифугированием при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин, и переносили во флакон с мешалкой объемом 3 л, заполненный 1 л среды. К смеси добавляли бутират натрия (Aldrich, США) до конечной концентрации 2 мМ, клетки культивировали в течение 5 дней, и из среды собирали супернатант. Антитела очищали от супернатанта, собранного из флаконов с мешалкой, с испо