Антидотная композиция биологического происхождения для использования в растениеводстве

Антидотная композиция биологического происхождения для использования в растениеводстве

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой предложенную впервые антидотную композицию, состоящую из биомассы Bacillus megaterium, Pseudomonas aureofaciens либо других непатогенных бактерий, содержащих поли-бета-гидроксимасляную кислоту, гидролизованной с помощью микромицетов рода Cephaliophora при повышенной температуре, а также определенного набора макро- и микроэлементов. Изобретение включает также способы эффективного использования данной композиции в практике растениеводства в качестве антидота для защиты сельскохозяйственных растений от стрессового воздействия гербицидов и других химических пестицидов.

Уровень техники

Большинство химических пестицидов является веществами, токсичными для живых организмов. Поэтому они, помимо своей основной функции (защиты растений от болезней, сорняков и вредителей), зачастую оказывают побочное стрессовое действие на защищаемую культуру. У растений стрессовый эффект может проявляться в виде замедления роста и других физиологических процессов, в понижении устойчивости к болезням, снижении всхожести, в появлении некротических симптомов (пятна, ожоги, скручивание листьев и др.), что в конечном итоге приводит к значительному недобору урожая. В особенности стрессовое действие на сельскохозяйственные растения характерно для гербицидов. О важности этой проблемы свидетельствует тот факт, что если потери урожая из-за засоренности полей оцениваются в 10-15% (1), то урожайность культурных растений при использовании гербицидов за счет стресса может сокращаться более чем на 50% (2, 3).

В настоящее время основным путем повышения безопасности применения гербицидов, снижения их отрицательного действия на защищаемые культуры является их совместное использование с антидотами - специальными добавками, снижающими фитотоксичность гербицидов.

Без антидотов сейчас уже невозможно представить гербициды ведущих фирм-производителей. Показательным является следующий случай. В 2007 г. на складе в г. Омске был обнаружен контрафактный гербицид «Пума супер 100» якобы производства фирмы «Байер». Как потом выяснилось, он был ввезен по поддельным документам из Венгрии. По полиграфическому исполнению упаковки контрафактный гербицид практически не отличался от настоящего. Более того, он содержал необходимое количество действующего вещества (феноксапроп-П-этила). Однако в гербициде отсутствовал антидот (мефенпир-диэтил) и другие добавки, в результате чего при использовании препарат демонстрировал отрицательные результаты, вызывая сильные ожоги злаков. Отсутствие антидота позволило по этому признаку даже без детального химического анализа выявить подделку (4).

Термин «антидот» заимствован из медицины и относится к «химическим соединениям, способным обезвреживать попавшие в организм яды или отравляющие вещества» (5). В применении к гербицидному стрессу данный термин ввел американский исследователь Хоффман, который в 1947 г. отметил, что 2,4,6-Т (малоактивный аналог гербицида 2,4-Д) способен снимать токсическое действие 2,4-Д на растения томатов. Поскольку 2,4,6-Т сам по себе являлся токсичным соединением, Хоффман продолжил поиск аналогичных веществ с меньшей токсичностью, что привело к открытию в 1962 г. препарата S-449, в 1969 г. - препарата NA (Протект, ангидрид нафталин-1,8-дикарбоновой кислоты), который стал первым коммерческим антидотом в истории земледелия (6).

Антидот NA (аналог) обеспечивает защиту зерновых злаков от повреждающего действия гербицидов класса тиолкарбаматов (5). Помимо NA, в качестве антидотов используются такие аналоги, как N,N-диаллил-2,2-дихлорацетамид (R-25788), α-(цианометоксимино)-α-фенилацетонитрил, α-[(1,3-диоксолан-2-илметокси)имино]-α-фенилацетонитрил, бензиновый эфир 2-хлор-4-трифторметил-5-тиазолкарбоновой кислоты, N-дихлорацетил-1-окса-4-азаспиро[4,5]декан либо их производные (6, 7).

В нашей стране учеными Кубанского государственного аграрного университета (г. Краснодар) предложен антидот для защиты проростков подсолнечника от фитотоксического действия гербицида 2,4-дихлор-фенокси-уксусной кислоты (2,4-Д) (8). Результатом обработки семян предложенным антидотом 2-диэтиламино-6-метокси-4-[(4'-этоксикарбонил-5'-метил-1',2',3'-триазол)-1'-ил]-1,3,5-триазином (аналог) является более эффективное увеличение длины корней и гипокотиля проростков подсолнечника на фоне стрессового действия 2,4-Д.

Недостатком вышеперечисленных антидотов является то, что они должны применяться исключительно методом предпосевной обработки семян, что является дорогим приемом и заметно ограничивает их защитное действие против послевсходовых гербицидов.

Более современные антидоты могут применяться как для обработки семян, так и в баковых смесях с послевсходовыми гербицидами. К ним относится, в частности, группа антидотов-аналогов, разработанных фирмой «БАСФ» на основе производных нафталина (9). Фирмой «Байер» в 2007 г. запатентована принципиальная формула смеси выпускаемых фирмой гербицидов с антидотами. В качестве антидотов в патентную формулу включены клоквинтосет-мексил, изоксадифен-этил, мефенпир-диэтил, 4-дихлорацетил-1-окси-4-азо-спиро-(4,5)-декан, 1-дихлор-ацетил-гексагидро-3,3,8-альфа-триметил-пиррол-[1,2-альфа]-пиримидин-6(2Н)-ол, беноксакор, дихлорамид, фуриазол и 3-дихлорацетил-2,2,5-три-метил-оксизолидин (10).

Аналогично фирмой «Сиба-Гейги АГ» (ныне «Сингента») разработаны антидоты для защиты культурных растений от фитотоксического действия гербицидов ряда сульфонилмочевин, хлорацетанилидов, эфиров арилокси-феноксипропионовых кислот. В качестве активного вещества они содержат производное мочевины с формулой R₁-R₂-NCONH-C₆-H₂(R_b)-SO₂NHCOA, где А - замещенный фенил или нафтил, R_b - водород, галоген или С₄-алкадиенильный мостик (11).

Общими недостатками всех вышеперечисленных аналогов являются следующие:

1. Низкая экологичность. Указанные антидоты являются такими же продуктами сложного химического синтеза, как и сами гербициды. Из этого следуют аналогичные гербицидам проблемы острой и хронической токсичности, медленного разложения в окружающей среде.

2. Высокие нормы расхода. Для достижения эффекта требуются достаточно высокие нормы расхода антидотов (порядка нескольких килограмм на тонну семян или гектар). В результате, при обработке антидотами семян успешно защищаются лишь крупносемянные культуры (кукуруза, соя, сорго, бобы). При использовании в баковых смесях эффективные дозировки антидотов часто превышают нормы расхода самих гербицидов.

3. Узкая специфичность. Большинство современных антидотов отличает высокая избирательность по отношению к конкретному гербициду, растению, срокам и условиям применения, композиции гербицидов конкретного производителя. Нет антидотов широкого спектра действия, которые можно было бы использовать с гербицидами различных производителей. Антидотное действие препаратов проявляется только по отношению к гербицидам, но не к другим группам пестицидов (инсектициды, фунгициды).

В ООО НПФ «Альбит» ранее был разработан препарат «Альбит» для повышения урожая растений и защиты их от болезней (прототип). Препарат представляет собой композицию из солей макро- и микроэлементов, хвойного экстракта, хлорофилло-каротиновой пасты, гидролизата бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В 1973Д и гидролизата бактерий Bacillus megaterium (12). Настоящий препарат применяется в качестве регулятора роста растений, однако у него обнаружены и антидотные свойства (13). Прототип не обладает недостатками химических антидотов-аналогов, он может применяться как для обработки семян, так и в баковых смесях с гербицидами, его отличает высокая экологичность, низкие нормы расхода, низкая специфичность к виду сельскохозяйственных растений.

Вместе с тем, серьезным недостатком прототипа является его низкая антидотная активность. Антидотный эффект оценивается как прибавка урожайности (в %) в варианте с использованием антидота и гербицида, по сравнению с вариантом, где использовался только гербицид. По своему физиологическому смыслу - это доля урожая, сохраненная от пестицидного стресса. Антидотный эффект препарата Альбит составляет в среднем 16,6%, в то время как перечисленные выше химические антидоты-аналоги обеспечивают эффект не ниже 50%.

Раскрытие изобретения

Задачей (техническим результатом) данной заявки является создание эффективного антидота - средства защиты широкого спектра сельскохозяйственных растений от пестицидного стресса, отличающегося высокой экологичностью, низкими нормами расхода, низкой специфичностью при сочетании с различными видами сельскохозяйственных культур и пестицидов, а также высоким антидотным эффектом (свыше 50%).

Поставленная задача достигается путем усовершенствования прототипа (препарат «Альбит») с помощью использования в его составе биомассы грибов рода Cephaliophora, а также определенного набора макро- и микроэлементов, отличающегося от прототипа. Полученная композиция (далее именуемая «антидотная композиция» или «Альбит усовершенствованный») содержит гидролизат бактерий Pseudomonas и Bacillus (или других непатогенных бактерий), полученный с использованием микромицетов рода Cephaliophora, а также смесь водорастворимых соединений макро- и микроэлементов: азот (валовый N) 3,6-15,4 мас.%, фосфор (валовое содержание в пересчете на P₂O₅) 6,0-10,2 мас.%, калий (валовое содержание в пересчете на K₂O) 2,1-8,0 мас.%, магний (валовое содержание в пересчете на MgO) 0,5-4,8 мас.%, серу (валовое содержание в пересчете на S O 4 − 2 ) 2,5-6,7 мас.%. Изобретение включает также способы эффективного использования данной композиции в практике растениеводства в качестве антидота.

Активность прототипа (препарат Альбит) обусловлена естественным биополимером поли-бета-гидроксимасляной кислотой (полиоксибутират, поли-бета-гидрокси-бутират, ПГБ), входящим в состав биомассы бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium. Для перевода ПГБ в физиологически активную форму необходим гидролиз клеток бактерий, который в прототипе осуществляют гидролитические ферменты проростков сои. В результате наших собственных экспериментов было неожиданно установлено, что ферменты, содержащиеся в вакуолях микромицетного штамма Cephaliophora tropica D3, при температуре 50-60°С способны с не меньшей эффективностью гидролизовать клетки бактерий; при этом значительно усиливаются антидотные свойства продукта. В частности, при тестировании усовершенствованного препарата в модельной системе (стрессовое воздействие бетанального гербицида на базе десмедифама и фенмедифама на сахарную свеклу в стадии смыкания рядков) антидотный эффект препарата Альбит составил 5,5%, в то время как при использовании модифицированного продукта, в котором как агент гидролиза использовалась вместо проростков сои биомасса С.tropica-21,7%.

Гриб Cephaliophora tropica не патогенен, сапротроф, выделяется из корней растений, подстилки, навоза и гниющих растительных остатков. Данный микромицет не вирулентен, не токсичен, не токсигенен и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

В состав прототипа (препарат «Альбит») входит раствор макро- и микроэлементов, который готовится таким образом, чтобы он при разведении 1:20000 не угнетал рост проростков ячменя. В составе данного раствора нормируется содержание следующих макро- и микроэлементов: магний сернокислый (29,8 г/кг в расчете на конечный препарат), калий фосфорнокислый двузамещенный (91,1 г/кг), калий азотнокислый (91,2 г/кг), карбамид (181,5 г/кг) (14). В пересчете на элементы питания это составляет: азот (N) 9,6%, фосфор (P₂O₅) 3,7%, калий (K₂O) 9,2%, магний (MgO) 1,0%, сера (SO₄) 2,4%. С помощью тестирования разных концентраций нами было установлено, что если при изготовлении продукта использовать несколько иные дозировки элементов питания, а именно: N от 3,6 до 15,4% по массе, P₂O₅ 6,0-10,2%, K₂O 2,1-8,0%, MgO 0,5-4,8%, SO₄ 2,5-6,7%, то антидотные свойства продукта значительно возрастают. В частности, содержание калия по сравнению с прототипом должно быть снижено, фосфора и серы - увеличено (см. Таблицу 1).

Сочетание двух указанных подходов (использование биомассы гриба Cephaliophora и модифицированного набора макро- и микроэлементов) обеспечивает качественное повышение антидотной активности (свыше 50%). При этом полностью сохраняются положительные свойства прототипа (ростстимулирующая и иммунизирующая активность, экологичность, низкая специфичность, дешевизна, длительный срок хранения). Таким образом, новый антидот «Альбит усовершенствованный» соответствует критерию «изобретательский уровень».

Таблица 1
Антидотный эффект исходного и модифицированного препарата «Альбит» в зависимости от содержания фосфора (сочетание 30 мл/га препарата с гербицидом на основе этофумезата + десмедифама + фенмедифама в деляночном опыте на сахарной свекле)
P2O5,%	Антидотный эффект, %
3,7 (исходный препарат)	5,5
4,0	5,4
5,0	5,6
5,5	5,7
6,0	18,4
7,0	18,7
8,0	18,9
9,0	18,4
10,0	18,0
10,2	18,0
10,5	7,6
11,0	5,1

Антидоты, для получения которых необходимо использование микромицетов рода Cephaliophora, а также содержащие указанный набор макро- и микроэлементов, до настоящего времени в мировой науке и практике не разрабатывались, и сведения о таких препаратах отсутствуют в научно-технической, патентной и иной литературе, что доказывает новизну настоящего изобретения.

Антидотная композиция «Альбит усовершенствованный» приготовляется путем смешивания до равномерного состояния следующих составных частей: гидролизат бактерий Pseudomonas aureofaciens, гидролизат бактерий Bacillus megaterium, смесь нетоксичных солей или других низкомолекулярных водорастворимых соединений макро- и микроэлементов, с тем расчетом, чтобы содержание макро- и микроэлементов в композиции составляло: азота (валовый N) 3,6-15,4 мас.%, фосфора (валовое содержание в пересчете на P₂O₅) 6,0-10,2 мас.%, калия (валовое содержание в пересчете на K₂O) 2,1-8,0 мас.%, магния (валовое содержание в пересчете на MgO) 0,5-4,8 мас.%, серы (валовое содержание в пересчете на SO₄) 2,5-6,7 мас.%, а содержание ПГБ - не менее 0,4 мас.%.

Для приготовления антидотной композиции были протестированы различные штаммы бактерий Pseudomonas aureofaciens (ВКМ В 1973Д, H16, В-1249, В-560) и Bacillus megaterium (КМЗ-1, КМЗ-2, КМЗ-3, КМЗ-5, РС2, РС22, В-44, В-112) из Всероссийской коллекции микроорганизмов и Коллекции микроорганизмов ООО НПФ «Альбит», и результаты их использования статистически достоверно не различались.

Для приготовления гидролизатов проводят культивирование бактерий Bacillus megaterium и Pseudomonas aureofaciens в условиях биореактора согласно методикам, общепринятым для аэробных мезофильных бактерий (15). Бактерии выращивают в периодической культуре, в условиях интенсивной аэрации с подпиткой до стационарной фазы роста и титра примерно 10¹⁰ клеток/мл. Контролируются показатели pH и pO₂ в среде роста. Процесс длится 20-35 часов. Гидролизат биомассы Pseudomonas aureofaciens. Bacillus megaterium либо других бактерий получают путем использования автолизата грибной культуры Cephaliophora tropica для подпитки среды при культивировании бактерий с последующим гидролизом бактериальной биомассы в течение 5-10 часов при температуре 50-60°С. Как было установлено в наших опытах, ферменты С. tropica способны к гидролизу бактериальных клеток только в указанном диапазоне повышенных температур. Грибной автолизат для подпитки получают путем культивирования С. tropica в биореакторе на жидких питательных средах на основе стандартных источников углерода и энергии, например соевой муки, сухого молока, сахарозы и необходимых микроэлементов, обеспечивающей выход биомассы гриба 10-20 г/л (по сухому весу), и для получения автолизата суспензию гриба выдерживают 5-10 часов при температуре 50-60°С. При культивировании бактерий используется столько грибного автолизата, сколько необходимо для подпитки согласно стандартным методикам культивирования микроорганизмов.

Возможен и альтернативный способ получения бактериального гидролизата, при котором суспензия бактерий Р. aureofaciens и В. megaterium смешивается с суспензией гриба С. tropica с последующим выдерживанием объединенной биомассы в биореакторе при перемешивании 5-10 часов при температуре 50-60°С. В этом случае под действием повышенной температуры образуется автолизат С. tropica, который, в свою очередь, гидролизует бактериальные культуры. В обоих случаях (как для подпитки, так и для добавления) гриб С. tropica используется из стационарной фазы роста при периодическом культивировании в биореакторе. Опытным путем было установлено, что при добавлении биомассы С. tropica после культивирования бактерий количество суспензии гриба для эффективного гидролиза не должно быть меньше трети суммарного объема суспензий бактерий.

В наших исследованиях было также установлено, что при получении гидролизата бактерий альтернативным способом (смешивание с грибом после культивирования), вместо бактерий Pseudomonas aureofaciens и Bacillus megaterium (как в прототипе) для приготовления композиции «Альбит усовершенствованный» могут быть использованы иные бактериальные штаммы родов Bacillus, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Lactobacillus, Methylobacterium, Klebsiella, Ralstonia, Rhizobium, Rhodospirillum, Rhodococcus и других, причем можно использовать как чистые бактериальные культуры, так и совместно выращенные ассоциации. Непременным условием при этом является непатогенность используемых штаммов, а также их способность содержать ПГБ в количестве не ниже 0,4% по массе финальной композиции. ПГБ может при этом включать остатки сополимеров других полигидроксиалканатов (гамма-гидроксибутират, гидроксивалерианат, гидроксигексанат, гидроксиоктанат и другие сополимеры). Для получения антидотной композиции в этом случае требуется использовать биомассу бактерий, как правило, из стационарной фазы роста в условиях, стандартных для культивирования данного конкретного штамма при периодическом культивировании в биореакторе. Состав питательной среды используется исходя из потребностей каждого конкретного штамма и не имеет принципиального значения для эффективности композиции. В наших опытах было также установлено, что для получения гидролизата можно использовать суспензию не только грибов вида Cephaliophora tropica, но и любых непатогенных штаммов рода Cephaliphora (например, Cephaliophora irregularis, С. longispora). Максимально возможное содержание ПГБ в композиции определяется имеющимся в настоящее время уровнем биотехнологий получения данного биополимера и составляет около 3%.

В качестве источника необходимых количеств макро- и микроэлементов в антидотной композиции могут использоваться любые приемлемые с сельскохозяйственной точки зрения водорастворимые соли и другие низкомолекулярные соединения. В частности, источником азота может служить мочевина, нитрат калия, нитрат аммония, хлорид аммония, нитрат кальция, сульфат аммония, ацетат аммония и т.д., источником фосфора - одно- или двузамещенные фосфаты калия либо натрия, источника калия - сульфат, хлорид, ацетат калия и т.д.

В композицию можно добавлять приемлемые с сельскохозяйственной точки зрения наполнители, служащие для усиления и стабилизации эффекта, лучшего прилипания к растениям, устранения расслоения композиции и т.д. Ими в частности могут выступать такие вещества как вода, крахмал, пектин, силикатный клей, каолин, гуматы, пестициды, консерванты, агрохимикаты и другие. В частности для устранения неприятного запаха, которым, как правило, обладает микробная биомасса, в композицию можно добавить экстракт хвойный натуральный по ТУ 81-05-97-70 либо пасту хвойную хлорофилло-каротиновую. Существенным условием при использовании наполнителей является сохранение содержания ПГБ, а также макро- и микроэлементов на указанном выше допустимом уровне.

После объединения всех компонентов производится перемешивание и диспергирование антидотной композиции на жерновах, диспергаторе, гомогенизаторе либо другом приспособленном устройстве. Диспергированная готовая антидотная композиция фасуется в потребительскую тару.

После розлива в укупоренную тару из нержавеющей стали, поливинилхлорида, полиэтилена высокого давления, полиэтилен-терефталата или других полимерных материалов антидотная композиция может храниться без потери активности в течение 3 лет при температуре от минус 20°С до +25°С. Как и в прототипе, в композиции «Альбит усовершенствованный» насыщенный раствор макро- и микроэлементов выступает в качестве консерванта.

Благодаря использованию биологической ферментации в процессе производства, антидотная композиция «Альбит усовершенствованный» обладает экологичностью и дешевизной (по данным показателям не уступает прототипу - препарату Альбит и в несколько раз превосходит антидоты, получаемые с помощью химического синтеза). В отличие от химических аналогов, антидотная композиция характеризуется низкой специфичностью и может применяться для защиты широкого спектра сельскохозяйственных растений (кукуруза, лен, овощные, подсолнечник, просо, пшеница озимая и яровая, рапс озимый и яровой, свекла сахарная, ячмень озимый и яровой и другие) от повреждающего действия широкого спектра гербицидов. В частности, как было показано в наших опытах, с композицией могут быть использованы гербициды на основе таких действующих веществ как 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота), дикамба, клопиралид, метсульфурон-метил, триасульфурон, трибенурон-метил, флорасулам, тралкоксидим, десмедифам, фенмедифам, трифлусульфурон-метил, этофумезат, хлорсульфурон, амидосульфурон, йодосульфурон-метил, трибенурон-метил, трифлуралин, квизалофоп-П-тефурил, феноксапроп-П-этил, галоксифоп-Р-метил, хизалофоп-П-этил, флуазифоп-П-бутил и других. Эффективность антидотной композиции значительно выше, чем у прототипа (антидотный эффект >50%). Антидотная композиция не снижает эффективность гербицидов против сорняков.

В изобретение также входят способы эффективного применения предложенной композиции.

Для защиты сельскохозяйственных растений (полевых, садовых, овощных, декоративных культур открытого и защищенного грунта) от стрессового воздействия листовых гербицидов (за исключением гербицидов сплошного действия) в баковую смесь с гербицидами добавляют антидотную композицию из расчета 10-1000 мл композиции на гектар посевов (что соответствует 0,01-10 мл композиции на литр рабочей жидкости гербицида).

Эти рекомендации основаны на проведенных нами модельных экспериментах (таблица 2).

Таблица 2
Эффективность антидотной композиции в зависимости от дозировки в деляночных опытах на сахарной свекле (при сочетание с гербицидом на основе этофумезата + десмедифама + фенмедифама)
Дозировка веществ, мл/га	Антидотный эффект, %
30 (прототип - препарат «Альбит»)	5,5
1 (антидотная композиция «Альбит усовершенствованный»)	2,9
5 (-//-)	20,7
10 (-//-)	50,1
20 (-//-)	55,6
30 (-//-)	66,9
70 (-//-)	79,7
100 (-//-)	57,4
200 (-//-)	56,8
500 (-//-)	54,3
1000 (-//-)	54,0
1100 (-//-)	25,4

Перед посевом антидотной композицией можно обрабатывать семена, всходы которых планируется опрыскивать гербицидом. В этом случае расход композиции должен составлять от 0,01 до 3 литров композиции на тонну семян, причем более высокая дозировка выбирается исходя из экономической целесообразности для более крупносемянных культур (кукуруза, подсолнечник). Для зерновых колосовых культур предпочтительным является использование композиции в дозировке 0,04 л/т семян. При гербицидной обработке культурные растения, выросшие из семян, обработанных антидотом, получают преимущества перед сорняками.

Гербицидный стресс зачастую связан с глубокими физиолого-биохимическими изменениями в клетках растений, наблюдаемыми на протяжении достаточно длительного периода (нарушения синтеза антиоксидантных ферментов, аминокислот, липидов клеточной стенки). Поэтому использование антидотной композиции «Альбит усовершенствованный» дает результаты также и после применения гербицидов. При этом, как показали проведенные нами опыты, защитного эффекта можно ожидать при использовании композиции в течение 1-10 суток после гербицидов. В этом случае антидотную композицию следует применять для опрыскивания растений в ходе самостоятельной обработки в таких же дозировках, как и при сочетании в баковой смеси с гербицидами (Таблица 3).

Таблица 3
Эффективность антидотной композиции «Альбит усовершенствованный» при сочетании с пестицидами и агрохимикатами различных классов в полевых опытах
Класс пестицида (агрохимиката)	Пестицид (действующее вещество)	Культура	Способ использования антидотной композиции	Антидотный эффект, %
Гербицид	Дикамба кислота + 2,4-Д	пшеница яровая	опрыскивание гербицидом в смеси с композицией	128,1
Гербицид	Дикамба кислота + 2,4-Д	пшеница яровая	опрыскивание гербицидом, затем - композицией (через 5 дней)	77,6
Гербицид	Дикамба кислота + 2,4-Д	пшеница яровая	опрыскивание гербицидом, затем - композицией (через 10 дней)	52,4
Фунгицид	Дифеноконазол + ципроконазол	ячмень яровой	совместное протравливание семян фунгицидом и композицией	56,1
Инсектицид	Бета-циперметрин	рапс яровой	опрыскивание инсектицидом в смеси с композицией	109,7
Акарицид	Лямбда-цигалотрин	пшеница озимая	опрыскивание акарицидом в смеси с композицией	54,9
Нематицид	Аверсектин С	огурцы	внесение в почву в смеси с композицией	52,7
Удобрение	Мочевина	пшеница яровая	совместное опрыскивание с композицией	57,1

Химические антидоты, применяемые в настоящее время, способны защищать растения только от стресса, вызываемого гербицидами. В то же время, пестициды других классов, а также листовые подкормки удобрениями также могут оказывать стрессовое воздействие на растения, что приводит к потере урожая. В частности, инсектициды и фунгициды оказывают на растения ретардантный эффект (в том числе снижение всхожести семян), листовые подкормки удобрениями могут вызвать ожоги листьев. Предложенная антидотная композиция способна эффективно бороться и с такими стрессами (таблица 3).

В отношении других классов пестицидов (родентициды, моллюскоциды, репелленты, феромоны, авициды, альгициды, регуляторы роста растений) антидотное действие композиции «Альбит усовершенствованный» на хозяйственно значимом уровне не отмечено.

Увеличение дозировки пестицидов по сравнению с рекомендованной ведет к увеличению и их стрессового действия на растения. Между тем, зачастую такое повышение настоятельно необходимо в условиях эпифитотийного распространения вредных объектов. Совместное использование пестицида с антидотной композицией в этом случае способно минимизировать стресс. Как было установлено в наших специальных опытах, для всех испытанных пестицидов сочетание с «Альбитом усовершенствованным» позволяет повышать дозировки минимум на 1/3 без угнетения растений. Аналогично, нами было установлено, что при снижении расхода пестицидов на величину до 1/3 от рекомендуемой нормы их стрессовое воздействие сохраняется. При этом, антидотная композиция способна компенсировать снижение хозяйственной эффективности пестицидов, сохраняя урожайность на уровне не ниже исходного (полная норма внесения пестицида). Эти результаты иллюстрируются данными таблицы 4.

Как видно из таблицы, антидотный эффект композиции при увеличении дозировки пестицида растет, благодаря чему урожайность маслосемян рапса в вариантах с композицией остается на уровне варианта с применением 100% дозировки инсектицида (20,0 ц/га), несмотря на ретардантный эффект повышенных дозировок. После повышения дозы препарата свыше 130% от нормы, несмотря на рост антидотного эффекта композиции, уровень урожайности варианта со 100% дозой пестицида не достигается. При снижении дозировки пестицида в пределах 1/3 нормы расхода антидотный эффект композиции практически не снижается и также компенсирует уменьшение урожайности.

Поскольку дозировки пестицидов часто на практике завышаются или занижаются, данная способность композиции повышает возможности практического использования изобретения.

Таблица 4
Влияние совместного применения с антидотной композицией «Альбит усовершенствованный» на хозяйственную эффективность инсектицида на основе дельтаметрина на яровом рапсе сорта Таврион (полевой опыт)
Норма расхода инсектицида, г/га	Норма расхода инсектицида, % от рекомендованной	Урожайность семян в варианте с обработкой чистым инсектицидом, ц/га	Урожайность семян в варианте с обработкой инсектицидом + антидотная композиция, ц/га	Антидотный эффект, %
3	10	5,1	6,7	31,4
9	30	5,9	7,9	33,9
15	50	9,9	14,0	41,4
21	70	13,6	20,1	47,8
27	90	19,3	29,6	53,4
30	100	20,0	31,1	55,5
33	110	18,2	29,3	61,0
36	120	14,3	23,1	61,5
39	130	12,3	20,0	62,6
45	150	9,4	17,1	81,9
54	180	7,2	16,2	125,0

Проведенные специальные токсикологические исследования по острой и хронической токсичности установили, что изменения, внесенные в «Альбит усовершенствованный» по сравнению с прототипом (препарат «Альбит») не привели к повышению токсичности композиции, которая так же как и прототип, принадлежит к 4 классу опасности. В опытах установлена высокая эффективность композиции на широком круге сельскохозяйственных растений при сочетании с различными гербицидами и другими пестицидами, причем антидотный эффект композиции проявляется уже при сверхнизких (в сравнении с аналогами) дозировках 10 мл/га.

Таким образом, предложенная антидотная композиция отличается от аналогов экологичностью, низкими нормами расхода, низкой специфичностью при сочетании с различными видами сельскохозяйственных культур и пестицидов, а также высоким антидотным эффектом.

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Для получения основной антидотной композиции проводят культивирование микробных культур Bacillus megaterium PC22, Pseudomonas aureofaciens BKM В 1973Д, Cephaliophora tropica D1 в биореакторе.

Посевными культурами указанных микроорганизмов инокулируют ферментеры рабочим объемом 500 л. Микробные культуры выращивают при 28°С в периодической культуре, с контролем pH и pO₂, в условиях интенсивной аэрации с подпиткой согласно общепринятым методикам для аэробных микроорганизмов (16). Гриб Cephaliophora tropica D1 выращивают на среде следующего состава: соевая мука 50 г/л, сухое молоко 10 г/л, сахароза 40 г/л, раствор микроэлементов (полный набор) - 1 мл/л, до середины стационарной фазы роста (накопление сухой биомассы 10-20 г/л). Выросшую биомассу гриба выдерживают в течение 10 часов при температуре 60°С. Полученный автолизат грибной биомассы используют для подпитки при культивировании бактерий. При культивировании бактерий используется столько грибного автолизата, сколько необходимо для подпитки исходя из стандартных методик (16).

Бактерии Bacillus megaterium PC22 выращивают на среде следующего состава: (NH₄)₂Cl₂ 15,0 г/л, K₂HPO₄ 4,0 г/л, соевая мука 20 г/л, 1 М раствор MgSO₄ 1 мл/л, раствор микроэлементов 1 мл/л, сахароза 60 г/л. Подтитровку осуществляют 0,1 н раствором аммиака. Осуществляют подпитку автолизатом гриба С. tropica D1 в автоматическом режиме. Культивируют в течение 20 часов, до начала стационарной фазы роста культуры (титр примерно 10¹⁰ клеток/мл, содержание ПГБ 1,50 мас.%). Количество ПГБ здесь и далее определяют гравиметрическим методом (17), который учитывает поли-бета-гидроксимасляную кислоту вместе с сополимерами поли-гидроксиалканатами.

Бактерии Pseudomonas aureofaciens BKM В 1973Д выращивают на среде следующего состава: K₂HPO₄ 1,0 г/л, KH₂PO₄ 0,3 г/л, NH₄Cl 0,5 г/л, молоко сухое 20 г/л, соевая мука 20 г/л, раствор микроэлементов 1 мл, сахароза 10 г/л. Осуществляют подпитку автолизатом С. tropica D1 в автоматическом режиме. Культивируют в течение 20 часов до начала стационарной фазы роста культуры (титр примерно 10¹⁰ клеток/мл, содержание ПГБ 0,4 мас.%).

После окончания культивирования суспензии Pseudomonas aureofaciens BKM В 1973Д и Bacillus megaterium PC22 выдерживают в биореакторах в течение 10 часов при температуре 60°С и получают по 367,8 кг гидролизата каждой из бактерий. О факте гидролиза судят по лизису клеточных стенок микроорганизмов при микроскопировании.

Гидролизаты (всего 735,6 кг) тщательно смешивают до образования равномерной суспензии. Добавляют источники макро- и микроэлементов: карбамид 78,4 кг, NaH₂PO₄ 101,4 кг, KCl 33,2 кг, MgCl₂ 11,8 кг, FeSO₄ 39,5 кг. Общее количество данных химикатов на партию составляет 264,4 кг, после смешивания с гидролизатами получают 1000 кг композиции.

В финальной композиции содержится азота (валовый N) 3,6 мас.%, фосфора (валовое содержание в пересчете на P₂O₅) 6,0 мас.%, калия (валовое содержание в пересчете на K₂O) 2,1 мас.%, магния (валовое содержание в пересчете на MgO) 0,5 мас.%, серы (валовое содержание в пересчете на SO₄) 2,5 мас.%. Биополимер поли-бета-гидроксимасляная кислота содержится в финальной композиции в количестве 0,70 мас.%.

Аналогичным образом готовятся дополнительные композиции с использованием только гидролизата Bacillus megaterium PC22 (735,6 кг на композицию) и только Pseudomonas aureofaciens BKM В 1973Д (735,6 кг на композицию). Содержание ПГБ в полученных гидролизатах составляет 1,1% и 0,3% соответственно.

После объединения всех компонентов производится перемешивание и диспергирование антидотной композиции на гомогенизаторе. Разные варианты антидотных композиций хранятся при температуре от минус 20°С до +25°С. Рабочий раствор композиций используется для защиты сельскохозяйственных растений от пестицидного стресса.

Пример 2

Антидотная композиция готовится как в примере 1 (основная) с тем отличием, что бактерии Bacillus megaterium и Pseudomonas aureofaciens культивируются совместно в составе ассоциации, что обеспечивает более высокий выход ПГБ.

Для получения антидотной композиции проводят культивирование микробных культур Bacillus megaterium PC2, Pseudomonas aureofaciens H16, Cephaliophora irregularis AGR-1 в биореакторе.

Посевными культурами указанных микроорганизмов инокулируют ферментеры рабочим объемом 500 л. Микробные культуры выращивают при 28°С в периодической культуре, с контролем рН и pO₂, в условиях интенсивной аэрации с подпиткой согласно общепринятым методикам для аэробных микроорганизмов (16).

Гриб Cephaliophora irregularis AGR-1 выращивают на среде следующего состава: соевая мука 50 г/л, сухое молоко 10 г/л, сахароза 40 г/л, раствор микроэлементов (полный набор) - 1 мл/л, до середины стационарной фазы роста (накопление сухой биомассы 10-20 г/л). Выросшую биомассу гриба выдерживают в течение 5 часов при температуре 50°С. Полученный автолизат грибной биомассы используют для подпитки при культивировании бактерий. Используется столько грибного автолизата, сколько необходимо в качестве источника углерода и энергии согласно стандартным методикам (16).

Ассоциацию бактерий Bacillus megaterium PC2 и Pseudomonas aureofaciens H16 выращивают на среде следующего состава: (NH₄)₂Cl₂ 15,0 г/л, K₂HPO₄ 4,0 г/л, соевая мука 20 г/л, 1 М раствор MgSO₄ 1 мл/л, раствор микроэлементов (полный набор) 1 мл/л, сахароза 60 г/л. Подтитровку осуществляют 0,1 н. раствором аммиака. Осуществляют подпитку автолизатом гриба Cephaliophora irregularis AGR-1 в автоматическом режиме. Культивируют в течение 25 часов, до середины стационарной фазы роста культуры (титр каждой из бактерий примерно 10¹¹ клеток/мл, содержание ПГБ в суспензии 3,08 мас.%).

После окончания культивирования суспензию бактерий выдерживают в биореакторе в течение 5 часов при температуре 50°С и получа