Стабильный жидкий препарат антитела

Стабильный жидкий препарат антитела

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов антитела. Конкретно, настоящее изобретение относится к стабильному жидкому препарату антитела и его фармацевтическому получению и применению.

Предшествующий уровень техники

Препараты антитела, предназначенные для терапевтического или профилактического применения, требуют присутствия стабилизаторов для предотвращения потери активности или структурной целостности белка из-за эффектов денатурации, окисления или агрегации на протяжении периода хранения и транспортировки перед использованием. Эти проблемы усугубляются при высоких концентрациях антитела, часто желательных для терапевтического введения.

Главной задачей при разработке препаратов антитела является сохранение растворимости антитела, стабильности и эффективности связывания его антигена. Особенно желательно избегать агрегатов и частиц в растворе, которые потребовали бы стерилизации фильтрованием перед использованием для внутривенной или подкожной инъекции и ограничили бы путь введения. Агрегаты антител могут вызвать боль и анафилактоидные побочные эффекты при внутривенной инъекции содержащего их препарата.

Лиофилизация и сублимационная сушка являются альтернативами жидкому препарату антитела. Оба процесса имеют тенденцию индуцировать денатурацию антитела и снижать его антигенсвязывающую активность, особенно при разбавлении.

Соли, поверхностно-активные вещества, агенты, регулирующие рН и тоничность, такие как сахара, могут способствовать преодолению проблем агрегации. Приготовление препаратов антитела требует тщательного отбора этих факторов среди других, для того чтобы избежать денатурации белка и потери антигенсвязывающей активности. Относительно интервала рН препарата антитела, если препарат антитела, имеющий низкое значение рН, инъецировать внутривенно, часто возникает боль при инъекции. Когда препарат антитела используют в виде инъекции, желательно иметь значение рН приблизительно в нейтральном интервале, также полезно минимизировать уровни поверхностно-активных веществ для того, чтобы избежать пузырьков в данном препарате, которые являются вредными для инъекции субъектам.

Жидкий препарат моноклонального антитела против антигена-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4) известен из WO2006/096491 (Pharmacia and Upjohn Company), и он содержит 20 мг/мл антитела, 20 мМ гистидиновый буфер, 84 мг/мл трегалозы, 0,2 мг/мл поверхностно-активного вещества полисорбат 80 (PS80), 0,05 мг/мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), рН 5,5.

Существует потребность в стабильном жидком препарате антитела, который стабильно поддерживает высокие концентрации биоактивного антитела в растворе и является подходящим для парентерального введения, включая внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную или подкожную инъекцию. Кроме того, желательно, чтобы данный препарат имел пониженный риск образования пузырьков и возникновения анафилактоидных побочных эффектов.

Кроме того, существует потребность в предложении такого стабильного жидкого препарата антитела против фактора роста нервной ткани (NGF). Известно, что NGF играет центральную роль в развитии и поддержании как периферических, так и центральных нейронов. Помимо его эффектов в нервной системе, повышенные уровни NGF связывали с целым рядом воспалительных состояний, включая системную красную волчанку, рассеянный склероз, псориаз, артрит, интерстициальный цистит и астму. NGF также имеет продемонстрированную активность при целом ряде болевых состояний. Было показано, что антитело E3 против NGF является полезным в лечении острых и хронических болевых состояний, включая боль при раковом заболевании, боль при ревматоидном артрите, боль при остеоартрите и также послеоперационную боль (см., например, WO2004/058184). Существует потребность в стабильном жидком препарате антитела против NGF для удовлетворения медицинской потребности пациентов, старадающих воспалительными и болевыми состояниями, опосредованными NGF.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена жидкая композиция, содержащая: по меньшей мере одно антитело, по меньшей мере один агент, регулирующий тоничность, по меньшей мере один буфер, по меньшей мере один хелатообразующий агент, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где рН указанной композиции составляет от 5,0 до 7,5.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена жидкая композиция, содержащая: по меньшей мере одно антитело, по меньшей мере один агент, регулирующий тоничность, по меньшей мере один буфер, по меньшей мере один хелатообразующий агент, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, где рН указанной композиции составляет от 5,8 до 6,8.

Согласно настоящему изобретению также предложена жидкая композиция, состоящая из или по существу состоящая из: по меньшей мере одного антитела, по меньшей мере одного агента, регулирующего тоничность, по меньшей мере одного буфера, по меньшей мере одного хелатообразующего агента, по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, где рН указанной композиции составляет от 5,8 до 6,8.

Жидкая композиция согласно настоящему изобретению дает преимущества в том, что она стабильно поддерживает высокие концентрации биоактивного антитела в растворе и является подходящей для парентерального введения, включая внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную или подкожную инъекцию. Также она имеет пониженный риск образования пузырьков и анафилактоидных побочных эффектов.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения данная жидкая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело. В некоторых воплощениях может присутствовать более чем одно антитело. Может присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более разных антител. Обычно два или более чем два разных антитела имеют комплементарные активности, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Данное антитело или каждое из антител также можно использовать в сочетании с другими агентами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности данных антител.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения рН может находиться в интервале от 5,0 до 7,5, более предпочтительно от примерно 7,5 до любого значения из примерно рН 5,1; 5,2; 5,3; 5,4 или 5,5. Кроме того, предпочтительно рН находится в интервале, выбранном из любого значения из рН 5,6; 5,7 или 5,8 до любого значения из примерно рН 7,5; 7,4; 7,3; 7,2; 7,1; 7,0; 6,9; 6,8; 6,7; 6,6; 6,5; 6,4; 6,3; 6,2; 6,1; 6,0; 5,9; 5,8 или 5,7.

В предпочтительном воплощении рН может находиться в интервале от примерно рН 5,5 до любого значения из примерно рН 6,0; 6,2; 6,5 или 6,8; альтернативно, рН может находиться в интервале от примерно рН 5,8 и до любого значения из примерно рН 6,0; 6,2; 6,5 или 6,8.

Более предпочтительно рН может быть выбран из любого значения рН из примерно 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4 или 7,5, наиболее предпочтительно рН составляет рН 6,0±0,2. Значения рН в этих интервалах дают жидкую композицию с повышенной защитой от агрегации и фрагментации антител, и они близки к физиологическому рН (примерно от рН 7,2 до 7,4) для пониженного риска возникновения боли или анафилактоидных побочных эффектов при инъекции.

Согласно дополнительному предпочтительному воплощению настоящего изобретения агент, регулирующий тоничность, предпочтительно содержит полиол, сахарид, углевод, соль, такую как хлорид натрия, или их смеси. Предпочтительно полиол имеет молекулярную массу, которая составляет менее чем примерно 600 кДа (например, в интервале от примерно 120 до примерно 400 кДа), предпочтительно он выбран из маннита, трегалозы, сорбита, эритрита, изомальта, лактита, мальтита, ксилита, глицерина, лактита, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, инозита или их смесей. Предпочтительно сахарид или углевод выбран из группы моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов или их смесей. Предпочтительно сахарид или углевод выбран из группы, состоящей из фруктозы, глюкозы, маннозы, сахарозы, сорбозы, ксилозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, декстрана, пуллулана, декстрина, циклодекстринов, растворимого крахмала, гидроксиэтилкрахмала, водорастворимых глюканов и их смесей. Предпочтительно агент, регулирующий тоничность, содержит сахарид, выбранный из группы восстанавливающего сахара или невосстанавливающего сахара или из их смесей. Более предпочтительно агент, регулирующий тоничность, содержит сахарид, который представляет собой невосстанавливающий сахар, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы и их смесей. Наиболее предпочтительно агент, регулирующий тоничность, содержит трегалозу, предпочтительно дигидрат трегалозы. Согласно настоящему изобретению агент, регулирующий тоничность, в частности трегалоза, предпочтительно дигидрат трегалозы, дает жидкую композицию с улучшенной стабильностью антитела и устойчивостью к агрегации, окислению и фрагментации во время холодильного хранения, например при температуре от 0 до 10°С, конкретно от 5 до 8°С, более конкретно 5°С, или хранения в замороженном состоянии и в циклах замораживания и оттаивания. Трегалоза является особенно полезной, так как образующийся препарат антитела не страдает от гликирования.

Концентрация агента, регулирующего тоничность, в данной жидкой композиции варьирует от примерно 1 мг/мл до примерно 300 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 200 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 100 мг/мл. Предпочтительно концентрация агента, регулирующего тоничность, в данной жидкой композиции составляет примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 81 мг/мл, примерно 82 мг/мл, примерно 83 мг/мл, примерно 84 мг/мл, примерно 85 мг/мл, примерно 86 мг/мл, примерно 87 мг/мл, примерно 88 мг/мл, примерно 89 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 91 мг/мл, примерно 92 мг/мл, примерно 93 мг/мл, примерно 94 мг/мл, примерно 95 мг/мл, примерно 96 мг/мл, примерно 97 мг/мл, примерно 98 мг/мл, примерно 99 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 105 мг/мл, примерно 110 мг/мл, примерно 120 мг/мл или примерно 130 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация агента, регулирующего тоничность, в данной жидкой композиции составляет примерно 84 мг/мл.

Когда агент, регулирующий тоничность, содержит соль, концентрация данной соли в данной жидкой композиции варьирует от примерно 1 мг/мл до примерно 20 мг/мл. Соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и подходят для этого изобретения, включают хлорид натрия, сукцинат натрия, сульфат натрия, хлорид калия, хлорид магния, сульфат магния и хлорид кальция. Предпочтительными солями для этого изобретения являются хлорид натрия и хлорид магния, хлорид магния также может улучшать стабильность антитела путем защиты белка от дезамидирования. Предпочтительно данная соль в жидкой композиции выбрана из ряда любых концентраций из примерно 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 17 мг/мл, 18 мг/мл, 19 мг/мл и 20 мг/мл.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения поверхностно-активное вещество предпочтительно выбрано из группы, состоящей из полисорбатов, полоксамеров, разных видов Triton, додецилсульфата натрия, лаурилсульфата натрия, октилгликозида натрия, лаурил-сульфобетаина, миристил-сульфобетаина, линолеил-сульфобетаина, стеарил-сульфобетаина, лаурил-саркозина, миристил-саркозина, линолеил-саркозина, стеарил-саркозина, линолеил-бетаина, миристил-бетаина, цетил-бетаина, лауроамидопропил-бетаина, кокамидопропил-бетаина, линоламидопропил-бетаина, миристамидопропил-бетаина, пальмидопропил-бетаина, изостеарамидопропил-бетаина, мирисгамидопропил-диметиламина, пальмидопропил-диметиламина, изостеарамидопропил-диметиламина, метилкокоил-таурата натрия, метилолеил-таурата динатрия, дигидроксипропил-PEG5-линоламмония хлорида (где PEG представляет собой полиэтиленгликоль), полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и их смесей. Кроме того, предпочтительно поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 21, полисорбата 40, полисорбата 60, полисорбата 61, полисорбата 65, полисорбата 80, полисорбата 81, полисорбата 85 и их смесей. Более предпочтительно поверхностно-активное вещество выбрано из полисорбата 20, полисорбата 80, PEG3350 или их смесей. Наиболее предпочтительно поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20. Согласно настоящему изобретению поверхностно-активное вещество, конкретно полисорбат 20, дает жидкую композицию с повышенной стабильностью антитела и устойчивостью к агрегации и фрагментации.

Концентрация поверхностно-активного вещества обычно варьирует от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 2,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1,5 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,4 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,3 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,15 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,1 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,05 мг/мл. Кроме того, предпочтительно концентрация поверхностно-активного вещества составляет примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл, примерно 0,06 мг/мл, примерно 0,07 мг/мл, примерно 0,08 мг/мл, примерно 0,09 мг/мл, примерно 0,1 мг/мл, примерно 0,11 мг/мл, примерно 0,12 мг/мл, примерно 0,13 мг/мл, примерно 0,14 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл, примерно 0,16 мг/мл, примерно 0,17 мг/мл, примерно 0,18 мг/мл, примерно 0,19 мг/мл, примерно 0,2 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация поверхностно-активного вещества составляет примерно 0,1 мг/мл. Воплощения с концентрацией поверхностно-активного вещества примерно 0,1 мг/мл являются весьма предпочтительными, так как эта концентрация обеспечивает поддержание стабильности антитела данного препарата в растворе, также снижая тенденцию к образованию пузырьков в препарате во время приготовления данного препарата, обращения с данным препаратом и приготовления для парентерального введения и особенно из-за нагрузки, связанной со встряхиванием и помешиванием во время получения и также во время транспортировки.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения буфер может быть выбран из группы, состоящей из ацетата, сукцината, глюконата, цитрата, гистидина, уксусной кислоты, фосфата, фосфорной кислоты, аскорбата, винной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, лактата, молочной кислоты, аскорбиновой кислоты, имидазола, бикарбоната и угольной кислоты, янтарной кислоты, бензоата натрия, бензойной кислоты, глюконата, эдетата, ацетата, малата, имидазола, гидроксиметиламинометана (Tris), фосфата и их смесей. Предпочтительно буфер представляет собой гистидин, где гистидин может представлять либо L-гистидин, либо D-гистидин, сольватированную форму гистидина, гидратированную форму (например, моногидрат) гистидина или безводную форму гистидина или их смесь.

Согласно настоящему изобретению буфер, конкретно предпочтительный гистидиновый буфер, дает жидкую композицию с рН, близким к физиологическому рН, для сниженного риска боли или анафилактоидных побочных эффектов при инъекции и также дает повышенную стабильность антитела и устойчивость к агрегации, окислению и фрагментации.

Концентрация буфера может варьировать от примерно 0,1 миллимолярной (мМ) до примерно 100 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет от примерно 0,5 мМ до примерно 50 мМ, кроме того, предпочтительно от примерно 1 мМ до примерно 30 мМ, более предпочтительно от примерно 1 мМ до примерно 18 мМ, еще более предпочтительно от примерно 1 мМ до примерно 15 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет примерно 1 мМ, примерно 2 мМ, примерно 3 мМ, примерно 4 мМ, примерно 5 мМ, примерно 6 мМ, примерно 7 мМ, примерно 8 мМ, примерно 9 мМ, примерно 10 мМ, примерно 11 мМ, примерно 12 мМ, примерно 13 мМ, примерно 14 мМ, примерно 15 мМ, примерно 16 мМ, примерно 17 мМ, примерно 18 мМ, примерно 19 мМ, примерно 20 мМ, примерно 21 мМ, примерно 22 мМ, примерно 23 мМ, примерно 24 мМ, примерно 25 мМ, примерно 30 мМ, примерно 35 мМ, примерно 40 мМ, примерно 45 мМ или примерно 50 мМ. Наиболее предпочтительно концентрация буфера составляет примерно 10 мМ,

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения хелатообразующий агент может быть выбран из группы, состоящей из аминополикарбоновых кислот, гидроксиаминокарбоновых кислот, N-замещенных глицинов, 2-(2-амино-2-оксоктил)-аминоэтан-сульфоновой кислоты (BES), дефероксамина (DEF), лимонной кислоты, ниацинамида и дезоксихолатов и их смесей. Кроме того, предпочтительно хелатообразующий агент выбран из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты 5 (DTPA), нитрилотриуксусной кислоты (NTA), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты (ADA), бис(аминоэтил)гликолевого эфира, N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), транс-диаминоциклогексантетрауксусной кислоты (DCTA), глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, N-гидроксиэтилиминодиуксусной кислоты (HIMDA), N,N-бис-гидроксиэтилглицина (бицина) и N-(трисгидроксиметилметил)-10-глицина (трицин), глицилглицина, дезоксихолата натрия, этилендиамина; пропилендиамина; диэтилентриамина; триэтилентетраамина (триен), этилендиаминтетраацетата (EDTA); двунатриевой соли EDTA; кальциевой соли EDTA и щавелевой кислоты, малата, лимонной кислоты, моногидрата лимонной кислоты и тринатриевого цитрата-дигидрата, 8-гидроксихинолята, аминокислот гистидина, цистеина, метионина, пептидов, полипептидов, белков и их смесей. Кроме того, предпочтительно хелатообразующий агент выбран из группы, состоящей из солей EDTA, включая двукалиевый эдетат, двунатриевый эдетат, кальциевый двунатриевый эдетат, натриевый эдетат, тринатриевый эдетат и калиевый эдетат; и подходящей солью дефероксамина (DEF) является мезилат дефероксамина (DFM) или их смеси. Хелатообразующие агенты, используемые в данном изобретении, могут присутствовать, когда это возможно, в форме свободной кислоты или свободного основания, или в солевой форме соединения, также в виде безводной, сольватированной или гидратированной формы соединения или соответствующей соли.

Наиболее предпочтительно хелатообразующий агент представляет собой либо двунатриевую соль EDTA, либо кальциевую соль EDTA, наиболее предпочтительно двунатриевую соль EDTA.

Особенно предпочтительной является двунатриевая соль EDTA, так как она дает жидкую композицию с улучшенной стабильностью антитела и/или устойчивостью к агрегации.

Концентрация хелатообразующего агента обычно варьирует от примерно 0,01 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл, от примерно 15 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл или от примерно 0,03 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл. Кроме того, предпочтительно концентрация хелатообразующего агента обычно варьирует от примерно 0,01 мМ до примерно 2,0 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 1,5 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,5 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,4 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,3 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,2 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,15 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,1 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,09 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,08 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,07 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,06 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,05 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,04 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,03 мМ, от примерно 0,01 мМ до примерно 0,02 мМ или от примерно 0,05 мМ до примерно 0,01 мМ. Предпочтительно концентрация хелатообразующего агента может составлять примерно 0,01 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,03 мг/мл, примерно 0,04 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл, примерно 0,06 мг/мл, примерно 0,07 мг/мл, примерно 0,10 мг/мл, примерно 0,20 мг/мл. Кроме того, предпочтительно концентрация хелатообразующего агента составляет примерно 0,045 мг/мл, примерно 0,046 мг/мл, примерно 0,047 мг/мл, примерно 0,048 мг/мл, примерно 0,049 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл, примерно 0,051 мг/мл, примерно 0,052 мг/мл, примерно 0,053 мг/мл, примерно 0,054 мг/мл, примерно 0,055 мг/мл или примерно 0,056 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация хелатообразующего агента составляет примерно 0,05 мг/мл.

Хелатообразующие агенты могут снижать образование восстановленных форм кислорода, снижать образование кислотных форм (например, дезаминирование), снижать агрегацию антитела и/или уменьшать фрагментацию антитела и/или уменьшать оксиление антитела в композициях по настоящему изобретению. Такие хелатообразующие агенты могут снижать или предотвращать деградацию антитела, которое приговлено в виде препарата, по сравнению с антителом без защиты хелатообразующим агентом.

Если не указано иное, перечисленные здесь концентрации представляют собой концентрации при условиях окружающей среды [то есть при 25° и атмосферном давлении].

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения данная жидкая композиция может дополнительно содержать антиоксидант. Предпочтительно антиоксидант выбран из группы, включающей метионин, тиосульфат натрия, каталазу и платину.

Концентрация антиоксиданта обычно варьирует от примерно 0,01 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 5,0 мг/мл, от примерно 0,01 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл или от примерно 0,01 мг/мл до примерно 0,02 мг/мл. Предпочтительно концентрация антиоксиданта может составлять примерно 0,01 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,03 мг/мл, примерно 0,04 мг/мл, примерно 0,05 мг/мл, примерно 0,06 мг/мл, примерно 0,07 мг/мл, 0,08 мг/мл, 0,09 мг/мл, примерно 0,10 мг/мл, 0,11 мг/мл, 0,12 мг/мл, 0,13 мг/мл, примерно 0,14 мг/мл, примерно 0,15 мг/мл, примерно 0,16 мг/мл, примерно 0,17 мг/мл, 0,18 мг/мл, 0,19 мг/мл, примерно 0,20 мг/мл, примерно 0,25 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл, 1,0 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация антиоксиданта составляет примерно 0,01 мг/мл.

Согласно дополнительному предпочтительному воплощению настоящего изобретения данная жидкая композиция может дополнительно содержать консервант. Предпочтительно консервант выбран из фенола, м-крезола, бензилового спирта, бензалкония хлорида, бензатония хлорида, феноксиэтанола и метилпарабена.

Концентрация консерванта обычно варьирует от примерно 0,001 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,005 мг/мл до примерно 15,0 мг/мл, от примерно 0,008 мг/мл до примерно 12,0 мг/мл или от примерно 0,01 мг/мл до примерно 10,0 мг/мл. Предпочтительно концентрация консерванта может сотавлять примерно 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, примерно 0,4 мг/мл, примерно 0,5 мг/мл, примерно 0,6 мг/мл, примерно 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл, примерно 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, примерно 4,0 мг/мл, примерно 5,0 мг/мл, примерно 6,0 мг/мл, примерно 7,0 мг/мл, 8,0 мг/мл, 9,0 мг/мл, примерно 9,1 мг/мл, примерно 9,2 мг/мл, 9,3 мг/мл, 9,4 мг/мл, 9,5 мг/мл, 9,6 мг/мл, 9,7 мг/мл, 9,8 мг/мл, 9,9 мг/мл, 10,0 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация консерванта составляет примерно 0,1 мг/мл или 9,0 мг/мл.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения данный жидкий препарат не содержит антиоксидант.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения данный жидкий препарат не содержит консервант.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения концентрация антитела может варьировать от примерно 0,1 до примерно 200 мг/мл. Предпочтительно концентрация антитела составляет примерно 0,5 мг/мл, примерно 1 мг/мл, примерно 2 мг/мл, примерно 2,5 мг/мл, примерно 3 мг/мл, примерно 3,5 мг/мл, примерно 4 мг/мл, примерно 4,5 мг/мл, примерно 5 мг/мл, примерно 5,5 мг/мл, примерно 6 мг/мл, примерно 6,5 мг/мл, примерно 7 мг/мл, примерно 7,5 мг/мл, примерно 8 мг/мл, примерно 8,5 мг/мл, примерно 9 мг/мл, примерно 9,5 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 11 мг/мл, примерно 12 мг/мл, примерно 13 мг/мл, примерно 14 мг/мл, примерно 15 мг/мл, примерно 16 мг/мл, примерно 17 мг/мл, примерно 18 мг/мл, примерно 19 мг/мл, примерно 20 мг/мл, примерно 21 мг/мл, примерно 22 мг/мл, примерно 23 мг/мл, примерно 24 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 26 мг/мл, примерно 27 мг/мл, примерно 28 мг/мл, примерно 29 мг/мл, примерно 30 мг/мл, примерно 31 мг/мл, примерно 32 мг/мл, примерно 33 мг/мл, примерно 34 мг/мл, примерно 35 мг/мл, примерно 36 мг/мл, примерно 37 мг/мл, примерно 38 мг/мл, примерно 39 мг/мл, примерно 40 мг/мл, примерно 41 мг/мл, примерно 42 мг/мл, примерно 43 мг/мл, примерно 44 мг/мл, примерно 45 мг/мл, примерно 46 мг/мл, примерно 47 мг/мл, примерно 48 мг/мл, примерно 49 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 51 мг/мл, примерно 52 мг/мл, примерно 53 мг/мл, примерно 54 мг/мл, примерно 55 мг/мл, примерно 56 мг/мл, примерно 57 мг/мл, примерно 58 мг/мл, примерно 59 мг/мл, примерно 60 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 100 мг/мл или примерно 110 мг/мл. Наиболее предпочтительно концентрация антитела составляет менее чем или равна примерно 50 мг/мл и может быть выбрана из группы, включающей примерно 2 мг/мл, примерно 2,5 мг/мл, примерно 5 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 19 мг/мл, примерно 20 мг/мл, 22 мг/мл и примерно 50 мг/мл.

Антитело предпочтительно выбрано из группы моноклональных антител, поликлональных антител, фрагментов антител (например Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv и так далее), химерных антител, биспецифических антител, антител в виде гетероконъюгата, одноцепочечных (ScFv), их мутантов, слитых белков, содержащих часть антитела (например, однодоменное антитело), гуманизированных антител, человеческих антител и любой другой модифицированной конфигурации молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая гликозилированные варианты антител, аминокислотные последовательности вариантов антител и ковалентно модифицированные антитела. Данное антитело может быть мышиным, крысиным, человеческим или любого другого происхождения (включая химерные и гуманизированные антитела). В некоторых воплощениях данное антитело может быть человеческим, но более предпочтительно является гуманизированным. Предпочтительно данное антитело является выделенным, кроме того, предпочтительно оно является по существу чистым. Когда антитело представляет собой фрагмент антитела, он предпочтительно сохраняет функциональные характеристики исходного антитела, то есть лигандсвязывающую и/или антагонистическую или агонистическую активность.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения константная область тяжелой цепи антитела может происходить из любого типа константной области, например IgG, IgM, IgD, IgA и IgE; и любых изотипов, таких как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Предпочтительно данное антитело представляет собой антитело IgG2.

Согласно настоящему изобретению данное антитело может содержать константную область тяжелой цепи человеческого IgG2a. В некоторых воплощениях данное антитело содержит константную область человеческой легкой цепи каппа. В некоторых воплощениях данное антитело содержит модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает опосредованный комплементом лизис или не стимулирует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). В других воплощениях константная область является модифицированной, как описано в Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; публикации РСТ заявки № WO099/58572; и/или заявке на патент Великобритании №9809951.8. В других воплощениях данное антитело содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG2a, содержащую следующие мутации: А330Р331 до S330S331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность IgG2a дикого типа), Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения данное антитело представляет собой антитело против NGF, которое связывает NGF (такой как человеческий NGF) с высокой аффинностью. В некоторых воплощениях высокая аффинность представляет собой (а) связывание с NGF с константой диссоциации (K_D) менее чем примерно 2 нМ (как, например, любое значение из примерно 1 нМ, 800 пМ, 600 пМ, 400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 пМ, 70 пМ, 60 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ или менее) и/или константой скорости диссоциации (k_off) медленнее чем примерно 6×10^-5 с^-1; и/или (б) ингибирование (уменьшение и/или блокирование) выживания нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 (в присутствии примерно 15 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ, 20 пМ, 10 пМ или менее; и/или (в) ингибирование (уменьшение и/или блокирование) выживания нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 (в присутствии примерно 1,5 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 10 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 2 пМ, 1 пМ или менее; и/или (г) ингибирование (уменьшение и/или блокирование) выживания нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от крысиного NGF, с IC50 (в присутствии примерно 15 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно150 пМ, 125 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ или менее; и/или (д) ингибирование (уменьшение и/или блокирование) выживания нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от крысиного NGF, с IC50 (в присутствии примерно 1,5 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно 30 пМ, 25 пМ, 20 пМ, 15 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 4 пМ, 3 пМ, 2 пМ, 1 пМ или менее; и/или (е) связывание NGF с более высокой аффинностью, чем это делает рецептор trkA.

В другом аспекте данные антитела (а) связывают NGF (такой как человеческий NGF) с K_D менее чем примерно 2 нМ (как, например, любое значение из примерно 1 нМ, 800 пМ, 600 пМ, 400 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 90 пМ, 80 пМ, 70 пМ, 60 пМ, 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ или менее) и/или k_off медленнее, чем примерно 6×10^-5 с^-1; и/или (б) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 (в присутствии примерно 15 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 80 пМ, 60 пМ, 40 пМ, 20 пМ, 10 пМ или менее; и/или (в) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 (в присутствии примерно 1,5 пМ NGF), выбранным из любого значения из примерно 50 пМ, 40 пМ, 30 пМ, 10 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 2 пМ, 1 пМ или менее; и/или связывают NGF с более высокой аффинностью, чем это делает рецептор trkA. В некоторых воплощениях данные антитела (а) связывают NGF с К_D менее чем примерно 2 нМ и/или (б) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 примерно 100 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии примерно 15 пМ NGF; и/или (в) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 примерно 10 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии примерно 1,5 пМ NGF. В некоторых воплощениях данные антитела (а) связывают NGF с К_D менее чем примерно 100 пМ; и/или (б) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 примерно 20 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии примерно 15 пМ NGF; и/или (в) ингибируют выживание нейронов тройничного нерва мыши Е13.5, зависимое от человеческого NGF, с IC50 примерно 2 пМ или менее, где IC50 измеряют в присутствии примерно 1,5 пМ NGF.

Эпитоп(ы), который(е) может(гут) связываться данным антителом, может(гут) быть непрерывными или прерывистыми. В одном воплощении данное антитело связывается по существу с теми же самыми эпитопами hNGF, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из MAb 911, MAb 912 и MAb 938, как описано в Hongo et al., Hybridoma, 19: 215-227 (2000), антитело, определенное здесь (такое как антитело Е3); и/или описанное в WO2005019266 (включая антитела 4D4, 14D10, 6G9, 7Н2, 14F11 и 4G6) или в WO2006131951 (включая антитело Hu-aD11), WO09023540 или US20090041717, полное содержание которых включено в данное описание ссылкой. В другом воплощении данное антитело связывается по существу с тем же самым эпитопом hNGF, что и MAb 911. В еще одном воплощении данное антитело связывается по существу с тем же самым эпитопом, что и MAb 909. Hongo et al., выше. Например, эпитоп может содержать один или более остатков К32, К34 и Е35 в пределах вариабельной области 1 (аминокислоты 23-35) hNGF; остатки F79 и Т81 в пределах вариабельной области 4 (аминокислоты 81-88) hNGF; остатки Н84 и К88 пределах вариабельной области 4; остаток R103 между вариабельной областью 5 (аминокислоты 94-98) hNGF и С-концом (аминокислоты 111-118) hNGF; остаток Е11 в пределах предвариабельной области 1 (аминокислоты 10-23) hNGF; Y52 между вариабельной областью 2 (аминокислоты 40-49) hNGF и вариабельной областью 3 (аминокислоты 59-66) hNGF; остатки L112 и S113 в пределах С-конца hNGF; остатки R59 и R69 в пределах вариабельной области 3 hNGF; или остатки V18, V20 и G23 в пределах предвариабельной области 1 hNGF. Кроме того, эпитоп может содержать одну или более чем одну вариабельную область 1, вариабельную область 3, вариабельную область 4, вариабельную область 5, область N-конца и/или С-конца hNGF. В еще одном воплощении данное антитело значительно снижает доступность растворителя к остатку R103 hNGF. Понятно, что хотя описанные выше эпитопы и относятся к человеческому NGF, специалист в данной области может осуществить выравнивание структуры человеческого NGF с NGF другого вида и идентифицировать вероятные аналоги этих эпитопов.

В одном аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:9, где 134 представляет собой S, L, V, А или I; и N35 заменен N, Т или S. Для удобства «заменен» или «представляет собой» в этом контексте или ссылке на аминокислоту относится здесь к выборам аминокислот(ы) для данного положения. Как очевидно, данная замена или выбор может представлять собой аминокислоту, показанную в SEQ ID или на фигуре. Номера остатков легко определить, исходя из ссылки на заявленный SEQ ID NO и следуя нумерации остатков антитела.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:10, где М50 представляет собой М, I, G, Q, S или L; A62 представляет собой А или S; и L63 представляет собой L или V.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой D, N или G; и где Y110 представляет собой Y, K, S, R или Т.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:11, где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO:11, где G98 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где G99 представляет собой G, S, А, С, V, N, D или Т; где Y100 представляет собой Y, L или R; где Y101 представляет собой Y или W; где G103 представляет собой G, А или S; где Т104 представляет собой Т или S; где S105 представляет собой S, А или Т; где Y106 представляет собой Y, R, Т или М; где Y107 представляет собой Y или F; где F108 представляет собой F или W; где D109 представляет собой S, А, С, G, D, N, Т или G; и где Y110 представляет собой любую аминокислоту.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:12, где S26 представляет собой S или F; D28 представляет собой D, S, А или Y; и Н32 представляет собой Н, N или Q.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:13, где 151 представляет собой I, Т, V или А; и S56 представляет собой S или Т.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие как антитело), которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO:14, где S91 представляет собой S или Е; К92 представляет собой K, Н, R или S; и где Y96 представляет собой Y или R.

В другом аспекте согласно данному изобретению предложены полипептиды (такие