Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты)

Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 60/845158, поданной 13 сентября 2006 года, и предварительной заявки США № 60/876374, поданной 21 декабря 2006 года. Содержания каждого из вышеуказанных приоритетных документов включены посредством ссылки.

Уровень техники

Технология рекомбинантных ДНК обеспечила средства для получения белков в количествах, которые позволяют применять их в некотором спектре применений, включающих в себя терапевтические, диагностические, сельскохозяйственные и исследовательские цели.

Одной задачей получения рекомбинантных белков является оптимизация сред и условий культур клеток для получения наибольшего количества белка и наиболее эффективных способов продуктивности. Любое усовершенствование, в том числе постепенные усовершенствования, могут иметь огромные экономические выгоды. В фармацевтической промышленности, оптимизация получения белков для биологических веществ, используемых в терапии для лечения заболевания, является выгодной, так как любое усовершенствование может оказывать существенное влияние при производстве этого биологического вещества в большом масштабе. Вследствие этого остается потребность в максимизации получения белков из культур клеток, экспрессирующих биологические белки, для применения в медицине.

Обычно, культура клеток млекопитающих основывается на коммерчески доступных композициях сред, в том числе, например, DMEM или HAM F12. Часто композиции сред являются недостаточно обогащенными для поддержания как роста клеток, так и экспрессии биологических белков. Остается потребность в усовершенствованных культуральных средах, добавках и способах культивирования клеток для усовершенствованного получения белков.

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы и композиции для усовершенствования экспрессии белка в культуре клеток, в частности в культуре клеток млекопитающих. Это изобретение относится к усовершенствованным средам культуры клеток, оптимизированным для экспрессии белков.

Это изобретение включает в себя также оптимизированные способы и композиции сред для высокой экспрессии белков в культуре клеток млекопитающих. В частности, среду культуры клеток оптимизируют для экспрессии антител в культуре клеток млекопитающих, например, клеток СНО. Обеспечены также усовершенствованные способы с подпиткой и композиции для усиления продуцирования белков добавлением растворов-добавок, например, содержащих гидролизат растворов и концентрированных растворов базальных (минимальных) сред.

Данное изобретение обеспечивает усовершенствованные бессолевые базальные среды для выращивания для применения в культуре клеток млекопитающих. Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую Часть А, Часть В и Часть С, где Часть А состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; Часть В состоит по существу из неорганического источника железа; и Часть С содержит рекомбинантный фактор роста; буфер; регулятор осмолярности; источник энергии и по меньшей мере два различных гидролизата из сырья не животного происхождения.

В одном варианте осуществления, Часть А дополнительно содержит ионы цветных металлов, витамины или их комбинации. В одном варианте осуществления, неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, например, цитрат трехвалентного железа с конечной концентрацией раствора приблизительно 100-150 мг/л или 0,1-1 мМ. В другом варианте осуществления, неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, например цитрат трехвалентного железа с конечной концентрацией раствора приблизительно 122,5 мг/л или 0,5 мМ.

В одном варианте осуществления, рекомбинантный фактор роста Части C выбран из группы, состоящей из инсулина или рекомбинантного аналога, IGF-1, и комбинации инсулина и IGF-1, например, приблизительно 4 мг/л - 13 мг/л инсулина или его рекомбинантного аналога.

В одном варианте осуществления, буфером, который исключен из модифицированной базальной среды, является буфер HEPES.

В одном варианте осуществления, буфер Части С содержит фосфатный буфер, HEPES и бикарбонат натрия, например, приблизительно 0,1-3 г/л бикарбоната натрия, приблизительно 0,1-3 г/л HEPES. В одном варианте осуществления, буфер Части С содержит 1,6 г/л бикарбоната натрия и/или приблизительно 1,8 г/л HEPES. В одном варианте осуществления, фосфатный буфер содержит приблизительно 0,01-0,5 г/л одно- и двухосновных фосфатов натрия.

В дополнительном варианте осуществления, Часть С дополнительно содержит аспарагин, глутамин или глутамин и аспарагин.

В одном варианте осуществления, регулятором осмолярности Части С является NaCl, например, приблизительно 1,0-6,4 г/л NaCl.

В одном варианте осуществления, источником энергии Части С является моносахарид, например, глюкоза (например, D-глюкоза), мальтоза, манноза, галактоза и фруктоза. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения содержит не более приблизительно 7,0 г/л глюкозы.

В другом варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения содержит по меньшей мере два разных гидролизата продуктов, не относящихся к продуктам животного происхождения, Части С, которые являются гидролизатом продуктов растительного происхождения и гидролизатом, который не является ни гидролизатом продуктов животного происхождения, ни гидролизатом продуктов растительного происхождения. Примером гидролизата продуктов растительного происхождения, который может быть использован в этом изобретении, является гидролизат сои. Примером гидролизата, который не является ни гидролизатом продукта животного происхождения, ни гидролизатом продуктов растительного происхождения, является гидролизат дрожжей.

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения дополнительно содержит метотрексат. Еще в одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит приблизительно 100 нМ-5000 нМ метотрексат.

Еще в одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит протектор клетки или поверхностно-активное вещество. Примером поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано в среде культуры клеток этого изобретения, является метилцеллюлоза или плюроник-полиол, например Плюроник F-68. В одном варианте осуществления, эта культуральная среда содержит приблизительно 0,1-5 г/л Плюроника F-68. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток содержит приблизительно 1,0 г/л Плюроника F-68.

В еще одном варианте осуществления этого изобретения, среда культуры клеток дополнительно содержит L-глутамин.

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток имеет рН в диапазоне 7,1-7,3.

В другом варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения имеет осмолярность в диапазоне от приблизительно 320 до 450 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую: базальную среду; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток содержит базальную среду; приблизительно 10,0 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4,0 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 3,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,03 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; и приблизительно 2,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток состоит по существу из базальной среды; приблизительно 10,0 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного металла; приблизительно 4,0 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 3,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,03 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 2,0 г/кг гидролизата дрожжей.

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную среду культуры клеток, состоящую по существу из базальной среды; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, эта культура клеток состоит по существу из базальной среды; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей.

В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток дополнительно содержит приблизительно 2,50 мл/кг метотрексата.

Это изобретение включает в себя также способ получения белка, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, в культуральной среде этого изобретения; и перенос этой культуры в продукционную среду культуры клеток, так что продуцируется этот белок.

В одном варианте осуществления, белком является антитело, например, D2E7 (адалимумаб).

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную продукционную среду культуры клеток, содержащую: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-0,7 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей; и приблизительно 60-70 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-0,7 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей; и приблизительно 60-70 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта продукционная среда культуры клеток содержит базальную среду, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,4-2,5 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную среду культуры клеток, содержащую: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 6-8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-2 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 6-8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-2 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/кг цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,6-2,7 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение также включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,3-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1,0 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-10 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,3-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1,0 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,87-0,88 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата аспарагина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,67-2,68 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 150-250 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 5-15 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из базальной среды для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 150-250 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 5-15 г/кг гидролизата дрожжей. В следующем варианте осуществления среда для культуры клеток содержит базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 200 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29-0,30 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 11 г/кг гидролизата дрожжей. В дополнительном варианте осуществления, этот белок является антителом, в том числе, например, полностью человеческим анти-IL-12-антителом, например ABT-874.

Это изобретение включает в себя также бессывороточную среду культуры клеток, содержащую базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1-3 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 1-4 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток состоит по существу из базальной среды для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1-3 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 1-4 г/кг гидролизата дрожжей. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29-0,30 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 2 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, pH этой среды культуры клеток равен приблизительно 7,10-7,30 и осмолярность находится в диапазоне приблизительно 300-340 мОсм/кг. Еще в одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит по меньшей мере 8 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, белок, который продуцируется в клетке млекопитающего, например в клетке СНО, с использованием этой среды культуры клеток, является антителом, например анти-IL-12-антителом, или анти-ЕРО-R-антителом, например ABT-874.

Это изобретение обеспечивает дополнительно среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2,5-4,5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,1-1 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-4 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂0; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2,5-4,5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,1-1 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-4 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂0; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного натрия; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,87-0,88 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,67 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение включает в себя также продукционную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, которая модифицирована для удаления следующих компонентов: бикарбоната натрия, буфера HEPES, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток этого изобретения состоит по существу из модифицированной базальной среды, которая модифицирована для удаления следующих компонентов: бикарбоната натрия, буфера HEPES, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, продукционная среда содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Другим аспектом этого изобретения является продукционная среда культуры клеток, содержащая модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 12-16 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 8-10 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрат трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 12-16 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 8-10 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток этого изобретения содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 14,2-14,3 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 9,2-9,3 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет pH приблизительно 6-8. В другом варианте осуществления, среда культуры клеток имеет pH приблизительно 7,10-7,20.

В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет осмоляльность приблизительно 350-450 мОсм/кг. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет осмоляльность приблизительно 373-403 мОсм/кг.

Среда культуры клеток этого изобретения может дополнительно содержать метотрексат. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит метотрексат, например, приблизительно 1-10 мл/кг. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток дополнительно содержит метотрексат, например, приблизительно 2,50 мл/кг.

В одном варианте осуществления, белком, который экспрессируется в этой культуре клеток, является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления, антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является анти-TNFα-антитело или анти-EPO-R-антитело. В другом варианте осуществления, анти-TNFα-антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является полностью человеческое анти-TNFα-антитело, в том числе, например, полностью человеческое анти-TNFα-антитело D2E7 (адалимумаб). Еще в одном варианте осуществления, антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является анти-IL-12- или анти-IL-18-антитело, в том числе полностью человеческое анти-IL-12- или анти-IL-18-антитело.

Это изобретение включает в себя также способ получения белка, например антитела или его антигенсвязывающей части, предусматривающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, например антитело, в представленной здесь среде культуры клеток. В одном варианте осуществления, этой средой культуры клеток является продукционная среда культуры клеток. Примеры антител, или их антигенсвязывающих фрагментов, которые могут быть получены с использованием способов и композиций этого изобретения, включают в себя анти-IL-18-антитело, анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело и анти-EPO-рецептор-(EPO-R)-антитело.

В одном варианте осуществления, это изобретение дополнительно предусматривает выделение этого белка из среды культуры клеток, например продукционной среды культуры клеток, описанной здесь.

В одном варианте осуществления, среды культуры клеток и способы этого изобретения предназначены для культивирования клеток млекопитающих, в том числе клеток яичника китайского хомячка (СНО).

Это изобретение включает в себя также клетку яичника китайского хомячка (СНО) в любой из описанных здесь сред культуры клеток.

Это изобретение обеспечивает также усовершенствованный способ культуры с подпиткой и соответствующие среды культуры клеток для получения белков в культуре клеток млекопитающего, например клеток СНО. Один аспект этого изобретения является способом с подпиткой получения белка, предусматривающий культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и фидинг (подпитку) этих клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к этой культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется этот белок.

В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды содержит концентрированную базальную среду. В другом варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу. Еще в одном варианте осуществления, базальной средой является среда PF CHO.

В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, гидролизатом, который получен из продуктов не растительного происхождения или не животного происхождения, является гидролизат дрожжей. В одном варианте осуществления, гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.

В одном варианте осуществления, белком, который продуцируется, является антитело, или его антигенсвязывающая часть. Примеры антител, или их антигенсвязывающих частей, которые могут быть использованы в способах культуры с подпиткой этого изобретения, включают в себя анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело, анти-IL-18-антитело и анти-EPO-рецептор (EPO-R)-антитело.

Это изобретение включает в себя способ с подпиткой получения анти-TNFα-антитела, в том числе, например, полностью человеческого анти-TNFα-антитела, такого как адалимумаб, предусматривающий культивирование клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и фидинг (подпитку) этих клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется анти-TNFα-антитело. Это изобретение описывает также способ с подпиткой получения анти-TNFα-антитела, предусматривающий культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток, содержащую по меньшей мере 1-5 г/л, например, 2,0 г/л глюкозы, причем концентрация глюкозы регулируется добавлением глюкозы к продукционной среде по мере необходимости для поддержания концентрации по меньшей мере 1-5 г/л, например, 2,0 г/л глюкозы; и фидинг (подпитку) клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется анти-TNFα-антитело.

В одном варианте осуществления, это изобретение включает в себя дополнительно извлечение анти-TNFα-антитела.

Еще в одном варианте осуществления, культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°С, например при 35°С.

В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток поддерживается при диапазоне 20-65% растворенного кислорода, например при приблизительно 30% растворенного кислорода.

В одном варианте осуществления, осмолярность продукционной среды культуры клеток поддерживается на протяжении всего культивирования не выше 500 мОсм.

В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор сод