Антигенные tau-пептиды и их применения

Антигенные tau-пептиды и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящая группа изобретений относится к иммуногенам, иммуногенным композициям и фармацевтическим композициям, содержащим антигенный tau-пептид, который связан с иммуногенным носителем, таким как вирусоподобная частица (VLP), для лечения tau-ассоциированных неврологических расстройств или состояний, таких как болезнь Альцгеймера и умеренное когнитивное ухудшение. Изобретение также относится к способам получения этих иммуногенов, иммуногенных композиций и фармацевтических композиций и их применению в медицине.

Предшествующий уровень техники

Болезнь Альцгеймера, также называемая деменцией Альцгеймера или БА, представляет собой прогрессирующее нейродегенеративное расстройство или состояние, которое вызывает потерю памяти и серьезное психическое нарушение. БА представляет собой наиболее распространенную форму деменции, являясь причиной более половины всех деменций. По оценкам, более 26 миллионов человек по всему миру страдают от последствий БА, и ожидается, что это число увеличится в четыре раза к 2050 г. в результате старения населения (Brookmeyer et al., Alzheimer' s & Dementia 3:186-191 (2007)). Кроме потери людей и снижения качества жизни, экономические затраты общества являются огромными, учитывая, что средний пациент с БА живет от 8 до 10 лет после постановки диагноза и требует интенсивного ежедневного ухода. На ранней стадии пациенты, жалующиеся на легкую потерю памяти и спутанность сознания, характеризуются как страдающие от умеренного когнитивного ухудшения (MCI), которое в некоторых случаях прогрессирует до классических симптомов болезни Альцгеймера, приводящих к сильному ухудшению умственных и социальных способностей.

Болезнь Альцгеймера (БА) обычно характеризуется накоплением нейритных бляшек и нейрофибриллярных клубков в головном мозге, что приводит к гибели нервных клеток с последующим прогрессирующим снижением когнитивных способностей. Большинство доступных в настоящее время способов лечения БА направлены на лечение симптомов, но не обязательно останавливают развитие заболевания. Соответственно, ясно, что желательными являются новые подходы для выявления способов лечения, которые могут защитить нейроны от инвалидизирующих последствий БА.

Большинство современных терапевтических подходов в лечении БА основано на широко признанной "гипотезе амилоидного каскада". Эта концепция приписывает патофизиологическую роль амилоиду-β (Аβ) как нейро- и синаптотоксину в форме от мономерной до олигомерной, а также откладывающемуся в виде полимера в амилоидных бляшках, являющихся одним из характерных признаков патологии БА. Полагают, что моноклональные антитела против целого ряда форм Аβ являются эффективными, так как они сдвигают равновесие головной мозг-кровь в сторону крови, таким образом истощая запасы Аβ в головном мозге.

Патофизиология БА характеризуется не только отложением Аβ в сенильных бляшках, но также включает накопление нейрофибриллярных клубков (NFT). NFT представляют собой фибриллы, образованные спаренными спиральными филаментами, которые связаны вместе посредством гиперфосфорилированного тау-белка. Тау может быть случайным образом фосфорилирован различными киназами по более чем 30 различным остаткам серина и треонина (Hanger et al., J. Neurochem. 71:2465-2476 (1998)), а также нескольким остаткам тирозина (Lebouvier et al., JAD 18: 1-9 (2009)). Очевидно, при БА существует дисбаланс киназных и фосфатазных активностей, приводящий к гиперфосфорилированным формам тау-белка, которые агрегируют и накапливаются в виде NFT.

Умеренное когнитивное ухудшение (MCI) чаще всего определяют как наличие измеримого ухудшения памяти сверх обычно ожидаемого при старении, но еще не демонстрирование других симптомов деменции или БА. По-видимому, MCI представляет переходное состояние между когнитивными изменениями, связанными с нормальным старением, и ранними деменциями. Когда потеря памяти является преобладающим симптомом, тогда этот тип MCI дополнительно определяют как амнестическое MCI. Индивидуумы с этим подтипом MCI подвержены наибольшей вероятности прогрессирования до БА при скорости приблизительно 10-15% в год (Grundman M et al., Arch Neurol. 61, 59-66, 2004). Большое исследование, опубликованое в 2005 г., представляло собой первое клиническое испытание, продемонстрировавшее, что лечение пациентов с MCI может замедлить переход в БА в течение первого года испытания (Petersen RC et al., NEJM 352, 2379-2388, 2005), что означает, что эти пациенты также представляют популяцию, подходящую для терапевтического вмешательства в БА.

Недавнее исследование показало, что вакцинация против фосфорилированных тау-пептидов в модели клубков патологического тау у мышей приводила к уменьшению агрегированного тау в головном мозге и улучшениям при связанных с клубками поведенческих нарушениях (Asuni et al., J. Neurosci. 27:9115-9129 (2007)). Хотя влияние гиперфосфорилированных тау и NFT на потерю когнитивных способностей и прогрессирование БА не вполне понятно, современные представления сходятся в том, что нацеливание лишь на амилоид будет недостаточным для того, чтобы увидеть улучшение в течении заболевания, что делает необходимым поиск дополнительных или альтернативных мишеней (Oddo et al., J. Biol. Chem. 281:39413 (2006)). Поэтому для получения эффективной терапевтической вакцины против БА и MCI может быть необходим подход с активной вакциной, которая нацелена на связанные с заболеванием конформации тау-белка.

Кроме того, существует ряд заболеваний кроме БА и MCI, которые также связаны с тау-патологией или "таупатиями", которые потенциально могли бы выиграть от тау вакцины, специфически нацеленной на вовлеченные патологические формы. Эти заболевания включают в себя, например, лобно-височную деменцию, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, прогрессирующий супрануклеарный паралич и комплекс бокового амиотрофического склероза/паркинсонизма-деменции (см., например, Spires-Jones et al., TINS 32:150-9(2009)).

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложены новые иммуногены, иммуногенные композиции и фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере один антигенный тау-пептид, который способен индуцировать иммунный ответ, в частности антительные ответы, приводящие к титру антител против аутоантигена тау в его патологическом гиперфосфорилированном состоянии. Такие иммуногены, иммуногенные композиции и фармацевтические композиции демонстрируют многочисленные желательные свойства, такие как способность индуцировать иммунный ответ, в частности антительные ответы, с терапевтическим эффектом против возникновения и развития нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с гиперфосфорилированным тау, таких как болезнь Альцгеймера и МС1.

В одном аспекте в изобретении предложен иммуноген, содержащий по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с иммуногенным носителем, где указанный антигенный тау-пептид содержит фосфо-тау эпитоп, выбранный из pSer-396 фосфо-тау эпитопа, pThr-231/pSer-235 фосфо-тау эпитопа, pThr-231 фосфо-тау эпитопа, pSer-235 фосфо-тау эпитопа, pThr-212/pSer-214 фосфо-тау эпитопа, pSer-202/pThr-205 фосфо-тау эпитопа и эпитопа.

В одном примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pSer-396 фосфо-тау эпитоп. В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pThr-231/pSer-235 фосфо-тау эпитоп. В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pThr-231 фосфо-тау эпитоп. В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pSer-235 фосфо-тау эпитоп. В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pThr-212/pSer-214 фосфо-тау эпитоп. В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pSer-202/pThr-205 фосфо-тау эпитоп.В другом примере указанный фосфо-тау эпитоп представляет собой pTyr-18 фосфо-тау эпитоп.

В другом аспекте в изобретении предложен иммуноген, содержащий по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с иммуногенным носителем, где указанный антигенный тау-пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:4, 6-26, 105 и 108-112.

В одном примере указанный антигенный тау-пептид ковалентно связан с указанным иммуногенным носителем посредством линкера, представленного формулой (G)_nC, где указанный линкер находится либо на С-конце (пептид-(G)_nC), либо на М-конце (С(G)_n-пептид) указанного пептида, и где n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В другом примере указанный линкер находится на N-конце указанного тау-пептида, и n равно 1 или 2. В другом примере указанный линкер находится на С-конце указанного тау-пептида, и n равно 1 или 2. В другом примере указанный антигенный тау-пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:4 и 6-13. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4 и 6-13. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11.

В другом примере указанный антигенный тау-пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:14-19. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14-19. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16.

В другом примере указанный антигенный тау-пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:20-24. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:20-24. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:21.

В другом примере указанный антигенный тау-пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:105 и 108-112. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:105 и 108-112. В другом примере указанный антигенный тау-пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:105.

В одном аспекте в настоящем изобретении предложен любой из иммуногенов, описанных в данной заявке, где указанный иммуногенный носитель представляет собой гемоцианин (такой как KLH (гемоцианин лимфы улитки)), сывороточный альбумин, глобулин, белок, экстрагированный из аскарид, или инактивированный бактериальный токсин.

В одном аспекте в настоящем изобретении предложен любой из иммуногенов, описанных в данной заявке, где указанный иммуногенный носитель представляет собой вирусоподобную частицу, выбранную из группы, состоящей из HBcAg VLP, HBsAg VLP и Qbeta VLP. В одном примере в изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке. В другом примере композиция содержит по меньшей мере три иммуногена, как описано в данной заявке.

В одном примере в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4 и 6-13; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14-19.

В другом примере в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4 и 6-13; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:20-24.

В другом примере в изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14-19; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:20-24.

В другом примере в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4 и 6-13; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена, выбранный из SEQ ID NO:105 и 108-112.

В другом примере в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14-19; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена выбран из SEQ ID NO:105 и 108-112.

В другом примере в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере два иммуногена, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:20-24; и

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена, выбранный из SEQ ID NO:105 и 108-112.

В другом примере в изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере три из четырех иммуногенов, как описано в данной заявке, где:

а) антигенный тау-пептид первого иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4 и 6-13;

б) антигенный тау-пептид второго иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:14-19; и

в) антигенный тау-пептид третьего иммуногена состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:20-24.

г) антигенный тау-пептид четвертого иммуногена, выбранный из SEQ ID NO:105 и 108-112.

В другом примере в изобретении предложена любая из композиций, описанных в данной заявке, где каждый из указанных антигенных тау-пептидов независимо ковалентно связан с указанным иммуногенным носителем посредством линкера, представленного формулой (G)_nC, где каждый из указанных линкеров независимо находится либо на С-конце (пептид-(С)_nG), либо на N-конце (С(G)_n-пептид) указанного тау-пептида, и где каждое n независимо равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В другом примере в изобретении предложена любая из композиций, описанных в данной заявке, где каждый из указанных линкеров находится на N-конце тау-пептида, и где каждое n независимо равно 1 или 2.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере три из четырех иммуногенов, где:

а) первый иммуноген содержит по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с Qbeta VLP, где указанный антигенный тау-пептид состоит из SEQ ID NO:11, и где указанный пептид ковалентно связан с указанной VLP посредством линкера, представленного формулой (G)_nC, где указанный линкер находится либо на С-конце (пептид-(G)_nC), либо на N-конце (С(G)_n-пептид) указанного тау-пептида, и где n равно 1 или 2;

б) второй иммуноген содержит по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с Qbeta VLP, где указанный антигенный тау-пептид состоит из SEQ ID NO:16, и где указанный пептид ковалентно связан с указанной VLP посредством линкера, представленного формулой (G)_nC, где указанный линкер находится либо на С-конце (пептид-(G)_nC), либо на N-конце (С(G)_n-пептид) указанного тау-пептида, и где n равно 1 или 2; и

в) третий иммуноген содержит по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с Qbeta VLP, где указанный антигенный тау-пептид состоит из SEQ ID NO:21, и где указанный пептид ковалентно связан с указанной VLP посредством линкера, представленного формулой (G)nC, где указанный линкер находится либо на С-конце (пептид-(G)_nC), либо на N-конце (С(G)_n-пептид) указанного тау-пептида, и где n равно 1 или 2.

г) четвертый иммуноген содержит по меньшей мере один антигенный тау-пептид, связанный с Qbeta VLP, где указанный антигенный тау-пептид состоит из SEQ ID NO:105, и где указанный пептид ковалентно связан с указанной VLP посредством линкера, представленного формулой (G)_nC, где указанный линкер находится либо на С-конце (пептид-(G)_nC), либо на N-конце (G(С)_n-пептид) указанного тау-пептида, и где n равно 1 или 2.

В одном примере каждый из линкеров первого, второго и третьего иммуногенов находятся на N-конце каждого из антигенных тау-пептидов и где для каждого из указанных линкеров n равно 2.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая любые из иммуногенов или композиций, описанных в данной заявке, дополнительно содержащая по меньшей мере один адъювант, выбранный из квасцов, CpG-содержащих олигонуклеотидов и адъювантов на основе сапонина.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая любые из иммуногенов или композиций, описанных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном примере по меньшей мере один адъювант представляет собой CpG-содержащий олигонуклеотид, выбранный из CpG 7909 (SEQ ID NO:27), CpG 10103 (SEQ ID NO:28) и CpG 24555 (SEQ ID NO:29).

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая любые из иммуногенов или композиций, описанных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый эксципиент.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ иммунизации, включающий введение млекопитающему любого(й) из иммуногенов, композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке. Например, в одном аспекте такое введение осуществляют с использованием фармацевтически эффективной дозы любого(й) из иммуногенов, композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке.

В другом аспекте в изобретении предложен способ лечения тау-ассоциированного неврологического расстройства у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества любого(й) из иммуногенов, иммуногенных композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке.

В одном аспекте такое введение осуществляют с использованием фармацевтически эффективной дозы любого(й) из иммуногенов, композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке.

В другом аспекте в изобретении предложен способ лечения тау-ассоциированного неврологического расстройства у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему: а) фармацевтически эффективной дозы любого(й) из иммуногенов, иммуногенных композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке; и б) фармацевтически эффективной дозы по меньшей мере одного адъюванта. В одном примере по меньшей мере один адъювант выбран из квасцов, CpG-содержащих олигонуклеотидов и адъювантов на основе сапонина. В другом примере по меньшей мере один адъювант представляет собой CpG-содержащий олигонуклеотид, выбранный из CpG 7909 (SEQ ID NO:27), CpG 10103 (SEQ ID NO:28) и CpG 24555 (SEQ ID NO:29).

В другом примере указанное неврологическое расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера. В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как умеренное когнитивное ухудшение. В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как амнестическое MCI.

В другом примере в изобретении предложено применение любого(й) из иммуногенов, композиций или фармацевтических композиций, описанных в данной заявке, для изготовления лекарственного средства. Например, в одном аспекте такие лекарственные средства могут быть использованы для лечения тау-ассоциированного неврологического расстройства у млекопитающего. В одном примере указанное неврологическое расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера. В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как умеренное когнитивное ухудшение (MCI). В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как амнестическое MCI.

В другом аспекте в изобретении предложено выделенное антитело, которое продуцируется в ответ на любой из способов иммунизации, описанных в данной заявке, где указанное антитело специфически связывается с гиперфосфорилированной формой человеческого тау.

В другом аспекте в изобретении предложен способ лечения тау-ассоциированного неврологического расстройства у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему антитела, которое специфически связывается с гиперфосфорилированной формой человеческого тау, и где указанное антитело продуцируется в ответ на любой из способов иммунизации, описанных в данной заявке.

В другом аспекте в изобретении предложено применение любого из антител, описанных в данной заявке, для изготовления лекарственного средства для лечения тау-ассоциированного неврологического расстройства у млекопитающего. В одном примере указанное неврологическое расстройство представляет собой болезнь Альцгеймера. В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как умеренное когнитивное ухудшение (MCI). В другом примере указанное неврологическое расстройство диагностировано как амнестическое MCI.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен выделенный пептид, состоящий или по существу состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:4, 6-26, 31-76 и 105-122. В другом аспекте в настоящем изобретении предложена выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует любой из указанных выделенных пептидов. В другом аспекте в настоящем изобретении предложен экспрессирующий вектор, содержащий любую из указанных нуклеиновых кислот. В другом аспекте в настоящем изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая любой из указанных векторов экспрессии.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1А и 1Б представлено описание групп мышей Balb/c, которых иммунизировали подкожно, и результаты титров и селективности, как описано в Примере 5. Мышей Balb/c иммунизировали подкожно с использованием 300 мкг пептида, 100 мкг пептида-KLH или 100 мкг пептида-VLP. Где указано, 50 мкл TiterMax Gold (Alexis Biochemicals) использовали в качестве адъювантов. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:30 до 1:7290.

На Фиг.2 представлено описание групп мышей Balb/c, которых иммунизировали, и результаты титров, как описано в Примере 5. Мышей Balb/c иммунизировали подкожно. Где указано, 50 мкл TiterMax Gold использовали в качестве адъюванта. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:900 до 1:1968300.

На Фиг.3 представлено описание мышей Balb/c, которых иммунизировали подкожно, как описано далее в Примере 6. 100 мкг пептида использовали для первичной (prime) иммунизации и 100 мкг пептида-VLP использовали для вторичных (boosts) иммунизации (реиммунизаций). Где указано, 750 мкг квасцов (Al(ОН)₃) использовали в качестве адъювантов. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:800 до 1:1750000. н/о означает не определяли.

На Фиг.4А, 4Б и 4В показаны результаты на мышах TG4510++, которых иммунизировали внутримышечно, как описано в Примере 7. На Фиг.4А показана результаты титров для Групп 1-7, тогда как на Фиг.4Б показаны результаты титров для Групп 8-17. На Фиг.4В показаны результаты селективности для Групп 1-6. CPG представляет собой CpG-24555. Квасцы представляют собой Al(ОН)₃. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:5000 до 1:15800000. н/о означает не определяли.

На Фиг.5 представлено описание мышей, которых иммунизировали, как описано в Примере 8. Мышей Balb/c иммунизировали либо внутримышечным (в/м), либо подкожным (п/к) путем. Где указано, использовали 90 мкг пептида-VLP. Где указано, использовали 1,595 мкг квасцов (Al(ОН)₃), 20 мкг CpG-24555 и 12 мкг ABISCO-100. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:5000 до 1:15800000. Нижний предел определения стандартной кривой составлял 0,0025 мг/мл. NA означает не применимо.

На Фиг.6 представлено описание мышей, которых иммунизировали, как описано в Примере 11. Мышей Balb/c иммунизировали внутримышечно. Использовали 100 мкг пептида-VLP. Где указано, использовали 252 (750) мкг квасцов (Al(ОН)₃). Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:500 до 1:2720000. н/о означает не определяли.

На Фиг.7 представлено описание мышей, которых иммунизировали, как описано в Примере 11. Мышей Balb/c иммунизировали внутримышечно. 750 мкг квасцов (Al(ОН)₃) использовали в качестве адъюванта. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:500 до 1:15800000.

На Фиг.8 представлено описание мышей, которых иммунизировали, как описано в Примере 12. Мышей TG4510-/- (однопометные животные дикого типа) иммунизировали внутримышечно. 100 мкг каждого пептида-VLP использовали для 0-х суток (первичная иммунизация) и 14-х суток (реиммунизация), как указано. Использовали указанное количество квасцов (Al(ОН)₃). Сыворотки из группы 'Без обработки' объединяли. Разведения сыворотки, тестируемые в анализе определения антиген-специфического титра (см. Пример 13), варьировались от 1:5000 до 1:15800000.

На Фиг.9 представлено описание мышей, которых иммунизировали, как описано в Примере 12. Мышей TG4510-/- (однопометные животные дикого типа) иммунизировали внутримышечно. 100 мкг каждого пептида-VLP использовали для 0-х суток (первичная иммунизация) и 14-х суток (реиммунизация). Использовали без квасцов или с 504 мкг квасцов (Al(ОН)₃). Селезенки собирали на 21-е сутки. Показаны количества точек на 5×10⁵ клеток селезенки, как измерено посредством ELIspot анализа Т-клеток, секретирующих интерферон-гамма (см. Пример 14). Результаты получены из пула 3 селезенок. Пептид HBV-1 (SEQ ID NO:77) представлял собой неродственный пептид. БСА представлял собой неродственный белок, н/о означает не определяли. * означает р<0,05 против неродственного пептида или белка, в зависимости от ситуации.

На Фиг.10 показана аминокислотная последовательность тау-изоформы 2 человека, Genbank № доступа NP_005901 (SEQ ID NO:30).

Подробное описание

Определения и общие методы

Если не определено иное в данной заявке, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понятны средним специалистам в данной области. В общем, используемые номенклатура и методы клеточной и тканевой культуры, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот, гибридизации, аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данной заявке, представляют собой номенклатуру и методы, хорошо известные и обычно использующиеся в данной области.

Способы и методы по настоящему изобретению обычно осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области, и как описано в различных общих и более конкретных источниках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иное. См., например, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); и Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Ферментативные реакции и методы очистки проводят в соответствии с рекомендациями производителя, как обычно осуществляется в данной области или как описано в данной заявке.

Термин "умеренное когнитивное ухудшение (MCI)", как использовано в данной заявке, относится к категории ухудшения памяти и когнитивных способностей, которое обычно характеризуется клиническим рейтингом деменции (CDR) 0,5 (см., например, Hughes et al., Brit. J. Psychiat. 140: 566-572, 1982) и дополнительно характеризуется ухудшением памяти, но не ухудшением функции в других когнитивных областях. Ухудшение памяти предпочтительно измеряют с использованием тестов, таких как "тест способности понять основную мысль отрывка" ("paragraph test"). Пациент с диагностированным умеренным когнитивным ухудшением часто демонстрирует ухудшенную способность отсроченного припоминания. Умеренное когнитивное ухудшение в большинстве случаев связано со старением и обычно встречается у пациентов в возрасте 45 лет или старше.

Термин "деменция", как использовано в данной заявке, относится к психическому расстройству в его наиболее широком смысле, как определено в American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (Американская ассоциация психиатров: диагностическое и статистическое руководство по психическим болезням), Fourth Edition, Washington, D.С., 1994 ("DSM-IV"). DSM-IV определяет "деменцию" как характеризующуюся множественными когнитивными расстройствами, которые включают в себя ухудшения памяти, и перечисляет различные деменции согласно предполагаемой этиологии. DSM-IV излагает общепринятый стандарт для такой диагностики, категоризации и лечения деменции и ассоциированных психических расстройств.

Термины "Тау" или "тау-белок" относятся к тау-белку, который связан со стабилизацией микротрубочек в нервных клетках и представляет собой компонент широкого спектра тау-агрегатов, например нейрофибриллярных клубков. В частности, термин "тау-белок", как использовано в данной заявке, охватывает любой полипептид, содержащий или состоящий из человеческого тау с SEQ ID NO:30, или другие человеческие изоформы с модификациями или без модификаций, или соответствующие ортологи от любых других животных. Термин "тау-белок", как использовано в данной заявке, также охватывает посттрансляционные модификации, включая, но не ограничиваясь этим, гликозилирования, ацетилирования и фосфорилирования тау-белка, как определено выше.

Термин "таупатия" относится к тау-ассоциированным расстройствам или состояниям, например, болезни Альцгеймера, прогрессирующему супрануклеарному параличу (PSP), кортико-базальной дегенерации (CBD), болезни Пика, лобно-височной деменции и паркинсонизму, ассоциированному с хромосомой 17 (FTDP-17), болезни Паркинсона, инсульту, травматическому повреждению головного мозга, умеренному когнитивному ухудшению и тому подобному.

Термины "антиген" и "иммуноген", которые, как подразумевается в данной заявке, используются взаимозаменяемо, относятся к молекуле, способной связываться антителом, В-клеточным рецептором (BCR) или Т-клеточным рецептором (TCR), если он представлен молекулами МНС.Термины "антиген" и "иммуноген", как использовано в данной заявке, также охватывают Т-клеточные эпитопы. Кроме того, антиген может распознаваться иммунной системой и/или способен индуцировать гуморальный иммунный ответ и/или клеточный иммунный ответ, приводящий к активации В- и/или Т-лимфоцитов. Однако это может потребовать, по меньшей мере в некоторых случаях, чтобы антиген содержал или был связан с Т-хелперным клеточным эпитопом и обеспечивался адъювантом. Антиген может иметь один или более эпитопов (например, В- и Т-эпитопов). Предполагают, что специфическая реакция, рассмотренная выше, указывает, что антиген будет предпочтительно реагировать, обычно высокоселективным образом, с его соответствующим антителом или TCR, а не с множеством других антител или TCR, которые могут быть индуцированы другими антигенами. Антигены, как использовано в данной заявке, также могут представлять собой смеси нескольких индивидуальных антигенов. Оба термина "антиген" и "иммуноген" охватывают, но не ограничиваются этим, полипептиды.

Термины "антигенный сайт" и термин "антигенный эпитоп", которые используются в данной заявке взаимозаменяемо, относятся к непрерывным или прерывистым участкам полипептида, которые могут быть иммуноспецифически связаны антителом или Т-клеточным рецептором в контексте молекулы МНС. Иммуноспецифическое связывание исключает неспецифическое связывание, но не всегда исключает перекрестную реактивность. Антигенные сайты обычно содержат от 5 до 10 аминокислот в пространственной конформации, которая является уникальной для антигенного сайта.

Как использовано в данной заявке, термин "фосфорилированный" в отношении аминокислотного остатка относится к присутствию фосфатной группы на боковой цепи данного остатка, где иначе обычно присутствует гидроксильная группа. Такое фосфорилирование обычно осуществляется как замена атома водорода из гидроксильной группы на фосфатную группу (-РО₃Н₂). Как известно специалистам в данной области, в зависимости от рН локального окружения, эта фосфатная группа может существовать в виде незаряженной, нейтральной группы (-РО₃Н₂), или с одинарным (-РО₃Н^-) или двойным (-РО₃ ^2-) отрицательным зарядом. Аминокислотные остатки, которые могут быть обычно фосфорилированы, включают в себя боковые цепи серина, треонина и тирозина. В настоящем изобретении фосфорилированный аминокислотный остаток показан жирным шрифтом и подчеркнут.

Как использовано в данной заявке, ссылки на аминокислотные остатки обозначены однобуквенным или трехбуквенным кодом (см., например, Lehninger, Biochemistry, 2^nd edition, Worth Publishers, New York, 1975, p.72).

Единственное число используется в данной заявке со ссылкой на один или более чем один (т.е. по меньшей мере одним) грамматический объект. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более чем один элемент. Кроме того, если иное не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать множественность, а термины во множественном числе должны включать единственность, если контекст явно не требует иного.

Термин "пептид" или "полипептид" относится к полимеру из аминокислот независимо от длины полимера; таким образом, фрагменты белка, олигопептиды и белки включены в определение пептида или полипептида. Этот термин также не определяет или не исключает постэкспрессионные модификации полипептидов, например полипептидов, которые включают ковалентное присоединение гликозильных групп, ацетильных групп, фосфатных групп, липидных групп и тому подобного, однозначно охвачены термином "полипептид". В данное определение также включены полипептиды, которые содержат один или более аналогов аминокислоты (включая, например, не встречающиеся в природе аминокислоты, аминокислоты, которые встречаются в природе тольно в не неродственной биологической системе, модифицированные аминокислоты из систем млекопитающих и т.д.), полипептиды с замещенными связями, а также другие модификации, известные в данной области, как природные, так и не природные.

Термин "тау-фрагмент", как использовано в данной заявке, охватывает любой полипептид, содержащий, или состоящий из, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, или 30 последовательных аминокислот тау-белка, как определено в данной заявке.

Термин "pSer-396 фосфо-тау эпитоп", как использовано в данной заявке, относится к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность KSP (т.е. Lys-395 Ser-396 Pro-397 из человеческой тау-последовательности), где остаток серина является фосфорилированным, и где нумерация последовательности основана на человеческой тау-изоформе 2, которая предложена в виде SEQ ID NO:30. pSer-396 фосфо-тау эпитоп обычно имеет длину от примерно 3 до примерно 25 аминокислот.

Термин "pThr-231/pSer-235 фосфо-тау эпитоп", как использовано в данной заявке, относится к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность TPPKS (SEQ ID NO:1) (т.е. Thr-231 Pro-232 Pro-233 Lys-234 Ser-235 из человеческой тау-последовательности), где каждый из остатков треонина и серина является фосфорилированным, и где нумерация последовательности основана на человеческой тау-изоформе 2, которая предложена в виде SEQ ID NO:30. Такие эпитопы обычно имеют длину от примерно 5 до примерно 25 аминокислот. pThr-231/pSer-235 фосфо-тау эпитоп также может относиться к форме этого эпитопа, который содержит фосфорилированный остаток Thr-231, но не включает фосфорилированный остаток Ser-235, или содержит фосфорилированный остаток Ser-235, но не включают фосфорилированный эпитоп Thr-231. Такие варианты этого эпитопа обычно имеют длину от примерно 3 до примерно 20 аминокислот.

Термин "pThr-212/pSer-214 фосфо-тау эпитоп", как использовано в данной заявке, относится к пептиду, содержащему аминокислотную последовательность TPS (т.е. Thr-212 Pro-213 Ser-214 из человеческой тау-последовательности), где каждый из остатков треонина и серина является фосфорилированным, и где нумерация последовательности основана на человеческ