Il-1бета-связывающие антитела и их фрагменты

Il-1бета-связывающие антитела и их фрагменты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с регистрационным номером 60/692830, поданной 21 июня 2005 года, описание которой включено в описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к IL-1β-связывающим антителам, включая их фрагменты, и нуклеиновым кислотам, кодирующим такие антитела, а также к векторам, клеткам и композициям, содержащим антитела или нуклеиновые кислоты, и к их применениям.

Уровень техники

Полагают, что цитокиновое семейство интерлейкина-1 (IL-1) вовлечено в патологию таких заболеваний, как ревматоидный артрит (RA), остеоартрит, болезнь Крона, язвенный колит (UC), септический шок, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма, реакция трансплантат против хозяина, атеросклероз, Т-клеточный лейкоз взрослых, множественная миелома, рассеянный склероз, геморрагический инсульт и болезнь Aльцгеймера. Члены семейства IL-1 включают IL-1α, IL-1β и IL-1Ra. Хотя их связывает способность связываться с IL-1-рецепторами (IL-1R1 и IL-1R2), каждый из указанных цитокинов экспрессируется различными геномами и имеет отличающуюся первичную аминокислотную последовательность. Кроме того, физиологическая активность цитокинов может различаться.

Соединения, которые нарушают передачу сигнала рецептора IL-1, рассматривались как терапевтические средства для лечения IL-1-опосредованных заболеваний. Такие соединения включают рекомбинантный IL-1Ra (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) и “trap”-пептид IL-1-рецептора (Regeneron Inc., Tarrytown, NY). Также были исследованы моноклональные антитела животных, которые связывают цитокины IL-1. Однако их клиническое значение может быть ограничено вследствие их иммуногенности. Например, известно, что у пациентов, получавших моноклональные антитела мыши, продуцируются антимышиные антитела человека (НАМА). Сообщалось, что НАМА уменьшают эффективность терапии моноклональными антителами и вызывают побочные реакции, включая поражающие почки. Другие IL-1β-антитела могут быть ограничены аффинностью связывания и/или активностью. Таким образом, требуются дополнительные соединения, которые нарушают передачу сигнала IL-1-рецептора. Настоящее изобретение относится к таким соединениям, а также к способам их получения и применения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к IL-1β-связывающему антителу или его IL-1β-связывающему фрагменту, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или фрагмент антитела, а также к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, клетке, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор, и композиции, содержащей антитело, нуклеиновую кислоту или вектор.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения или профилактики заболевания у млекопитающего, включающему введение эффективного количества антитела или фрагмента антитела, нуклеиновой кислоты или вектора по настоящему изобретению млекопитающему, при необходимости, за счет чего происходит лечение или профилактика заболевания у млекопитающего.

Настоящее изобретение относится к способу получения аффинно-зрелого IL-1β-связывающего полипептида, включающему (а) получение первой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую IL-1β-связывающий полипептид, который содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:1-26, и второй нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, которая отличается от последовательности первой нуклеиновой кислоты по меньшей мере одним нуклеотидом, (b) осуществление перетасовки нуклеиновых кислот с получением двух или более мутированных нуклеиновых кислот, (с) отбор мутированной нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, который (i) связывается с IL-1β с более высокой аффинностью, чем полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, (ii) обладает селективностью в отношении IL-1β по сравнению с IL-1α, которая выше, чем селективность полипептида, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, (iii) имеет константу диссоциации равновесного связывания (K_D) в отношении IL-1β, которая ниже, чем константа полипептида, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, или (iv) ингибирует IL-1β-индуцированную экспрессию сывороточного IL-6 у животного в большей степени, чем полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, и (d) экспрессию отобранной мутированной нуклеиновой кислоты, за счет чего получают аффинно-зрелый IL-1β-связывающий полипептид.

Настоящее изобретение относится к новым IL-1β-связывающим антителам или к их IL-1β-связывающим фрагментам, которые связываются с IL-1β человека с константной диссоциации менее чем 3 пМ, альтернативно, приблизительно 2 пМ или менее, предпочтительно, приблизительно 1 пМ или менее. Полагают, что такие высокоаффинные антитела могут использоваться в различных способах лечения или профилактики связанных с IL-1 заболеваний или состояний. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты связываются с эпитопом IL-1β таким образом, что связанное антитело или связанный фрагмент по существу не препятствуют связыванию IL-1β с IL-1-рецептором типа I. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты связываются по существу с таким же эпитопом, что и антитело или несколько антител, приведенных в настоящем описании в качестве примера, например антитело, обозначенное как АВ7, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты конкурируют за связывание с антителом, имеющим вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:11 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:15. Альтернативно или дополнительно, настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, которые связываются с эпитопом, находящимся в последовательности ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIE (SEQ ID NO:36). IL-1β-связывающие антитела, приведенные в качестве примеров, включают антитела, обозначенные в настоящем описании как АВ5 и АВ7.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, имеющим константу диссоциации менее чем 3 пМ, альтернативно, приблизительно 1 пМ или менее, альтернативно, любую из других, описанных в настоящем описании констант диссоциации, и содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:12, 13, 21, 23 или 24, или, альтернативно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, 13 или 21, или, альтернативно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 или 21, или, альтернативно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, 14 или 15 или, альтернативно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или 15. IL-1β-связывающее антитело или его IL-1β-связывающий фрагмент может содержать также вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11.

В качестве другого варианта осуществления настоящее изобретение относится к новым IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, которые связываются с IL-1β с константной диссоциации приблизительно в диапазоне от 6 пМ до приблизительно 50 пМ, альтернативно, в диапазоне приблизительно от 13 пМ до приблизительно 25 пМ, альтернативно, приблизительно от 19 пМ, причем IC₅₀ антитела или его фрагмента составляет менее 0,5 нМ (500 пМ), альтернативно, приблизительно в диапазоне от 5 пМ до приблизительно 200 пМ, альтернативно, приблизительно в диапазоне от 10 пМ до приблизительно 100 пМ, альтернативно, приблизительно 30 пМ, для ингибирования IL-1β-стимулированного высвобождения IL-6 из фибробластов человека. IC₅₀ для ингибирования IL-1β-стимулируемого высвобождения IL-6 из фибробластов человека является концентрацией, необходимой для ингибирования 50% IL-6, высвобождаемого IL-1β-стимуляцией фибробластов человека. Примеры антител включают антитело, обозначенное в настоящем описании как АВ1.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, имеющим константу диссоциации приблизительно от 6 до приблизительно 50 пМ и содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:4, 5 или 6, альтернативно, одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:4 или 5, альтернативно, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. Полагают, что в некоторых обстоятельствах могут быть желательными IL-1β-связывающее антитело или его IL-1β-связывающий фрагмент, имеющие относительно более высокую константу диссоциации, например, для некоторых способов лечения или профилактики IL-1-связанных заболеваний или состояний, где желательной является относительно меньшая степень аффинности.

Примеры антител включают антитела, обозначенные АВ1, АВ2, АВ3, АВ4, АВ5, АВ6, АВ7, АВ8 и АВ9. АВ1 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. АВ2 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. АВ3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. АВ4 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. АВ5 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. АВ6 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. АВ7 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11. АВ8 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. АВ9 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.

Настоящее изобретение относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, имеющим вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:2, 4-8, 12-15, 23-26, 28-35 или 42-57, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:21, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:26.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, имеющим вариабельную область легкой цепи, которая содержит любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, 9-11 или 27, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:9, альтернативно, любую из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, содержащим одну из вариабельных областей тяжелой цепи последовательностей, представленных в SEQ ID NO:2, 4-8, 12-15, 21, 23-26, 28-35 или 42-57, и одну из вариабельных областей легкой цепи последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, 9-11 или 27.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, содержащим части, которые не связывают IL-1β, но, вместо этого, ответственны за другие функции, такие как полупериод циркуляции, прямое цитотоксическое действие, детектируемое мечение или активация каскада реакций эндогенного комплемента реципиента или эндогенной клеточной цитотоксичности. Антитела настоящего изобретения могут содержать всю или часть константной области антитела. Константная область может быть выбрана из любого изотипа, включая IgА (например, IgА1 или IgА2), IgD, IgЕ, IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или IgМ. Например, антитело может содержать область IgG2. Кроме того или вместо этого, содержащие константную область антитела и фрагменты настоящего изобретения могут содержать эпитопную метку, эпитоп рецептора реутилизации, метку для диагностических целей или для целей очистки или цитотоксическую метку, такую как радионуклид или токсин.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим любое из IL-1β-связывающих антител или любой из их IL-1β-связывающих фрагментов и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Предпочтительно, антитела и соединения настоящего изобретения могут вводиться в терапевтически эффективном количестве, которое является количеством, достаточным для уменьшения клинического показателя или симптома состояния или заболевания, ассоциированного с экспрессией белка-мишени, субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В связанном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит второй активный агент. В еще одном варианте осуществления предоставлена фармацевтическая композиция, где вторым активным агентом является антитело против фактора роста или цитокина или антагонист фактора роста или цитокина. В другом варианте осуществления вторым активным агентом является другое антитело.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается применение IL-1β-связывающих антител или их IL-1β-связывающих фрагментов в производстве лекарственного средства для профилактики или ослабления состояния или нарушения, ассоциированного с IL-1. В любом из указанных применений лекарственное средство может быть координировано с лечением при использовании второго активного агента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается применение синергической комбинации антитела настоящего изобретения для получения лекарственного средства для лечения пациента, проявляющего симптомы связанного с IL-1 состояния или нарушения, описанного в настоящем описании, где лекарственное средство координировано с лечением при использовании второго активного агента. В связанном варианте осуществления вторым активным агентом является антитело против цитокина или фактора роста или антагонист цитокина или фактора роста. Рассматриваются варианты любого из вышеуказанных применений, где количество IL-1β-связывающего антитела или их IL-1β-связывающего фрагмента в лекарственном средстве находятся в дозе, эффективной для уменьшения дозы второго активного агента, требуемой для достижения терапевтического эффекта.

Настоящее изобретение также относится к наборам. В одном варианте осуществления набор содержит терапевтически или профилактически эффективное количество соединения или композиции настоящего изобретения (например, антитела, фрагмента, нуклеиновой кислоты, вектора или клетки), упакованное в контейнер, например, флакон или склянку, и дополнительно содержащее ярлык, прикрепленный к контейнеру или упакованный с контейнером и описывающий содержимое контейнера и предоставляющий указания и/или инструкции по применению содержимого данного контейнера для профилактики или ослабления состояния или заболевания, ассоциированного с экспрессией белка-мишени.

Краткое описание рисунков

На фиг.1 представлена пара аминокислотных последовательностей, соответствующих легким цепям и тяжелым цепям вариабельной области некоторых из описанных в настоящем описании антител. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.2 представлен набор аминокислотных последовательностей, соответствующих вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи антител АВ1, АВ2, АВ3 и АВ4. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.3 представлен набор аминокислотных последовательностей, соответствующих вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи антител АВ5, АВ5.1 и АВ5.2. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.4 представлен набор аминокислотных последовательностей, соответствующих вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи антител АВ5.3 и АВ5.4. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.4А представлен набор аминокислотных последовательностей, соответствующих вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи антител АВ6 и АВ7. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.4В представлен набор аминокислотных последовательностей, соответствующих вариабельным областям легкой цепи и тяжелой цепи антител АВ8 и АВ9. Подчеркнутые части аминокислотных последовательностей показывают определяющие комплементарность области (CDR).

На фиг.5 представлен график, показывающий результаты эксперимента in vitro стимуляции IL-1β.

На фиг.6. представлена гистограмма, показывающая результаты эксперимента in vitro стимуляции IL-1β.

На фиг.7 представлен график, показывающий результаты кинетического анализа исключения для антитела, обозначенного как АВ1.

На фиг.8 представлен график, показывающий результаты кинетического анализа исключения для антитела, обозначенного как АВ5.

На фиг.9 представлен график, показывающий результаты кинетического анализа исключения для антитела, обозначенного как АВ7.

На фиг.10 представлен график, показывающий результаты эксперимента in vitro стимуляции IL-1β для антител, обозначенных как АВ1, АВ2 и АВ3.

На фиг.11 представлен график, показывающий результаты эксперимента in vitro стимуляции IL-1β для антител, обозначенных как АВ1 и АВ7.

На фиг.12 представлен график, показывающий результаты эксперимента in vitro стимуляции IL-1β для антител, обозначенных как АВ5 и АВ7, а также для Kineret®.

На фиг.13 представлена гистограмма, показывающая результаты эксперимента in vivo стимуляции IL-1β для антител, обозначенных как АВ5 и АВ1.

На фиг.14 представлена гистограмма, показывающая результаты эксперимента in vivo стимуляции IL-1β для антител, обозначенных как АВ5 и АВ7.

На фиг.15 представлен Вестерн-блот, показывающий результаты экспериментов по перекрестной реактивности антитела, обозначенного как АВ7, в отношении IL-1β собакоподобной обезьяны и макаки резус.

На фиг.16 представлен Вестерн-блот, показывающий результаты экспериментов по перекрестной реактивности антитела, обозначенного как АВ7, в отношении IL-1β собаки, морской свинки, свиньи и кролика.

На фиг.17 представлен Вестерн-блот, показывающий результаты экспериментов по перекрестной реактивности для антитела, обозначенного как АВ7, в отношении рекомбинантного IL-1β человека, мыши и крысы.

На фиг.18 представлен график, показывающий результаты эксперимента in vitro для антитела, обозначенного как АВ7, и для Kineret, включающего IL-1-индуцированное продуцирование IL-8.

На фиг.19 представлен график, показывающий результаты анализа испытания, предотвращают ли данные антитела связывание IL-1β в отношении IL-1-рецептора типа I.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к новым IL-1β-связывающим антителам или их IL-1β-связывающим фрагментам, обладающим желаемой аффинностью и активностью. В качестве одного аспекта настоящего изобретения предоставлены IL-1β-связывающие антитела, которые обладают неожиданно высокой аффинностью и низкими константами диссоциации (например, менее чем 3 пМ, альтернативно, приблизительно 1 пМ или менее) по сравнению с известными IL-1β-связывающими антителами. Примеры антител включают антитела, обозначенные в настоящем описании как АВ5 и АВ7. В качестве другого аспекта настоящего изобретения предоставлены IL-1β-связывающие антитела, имеющие желаемую константу диссоциации (например, в диапазоне приблизительно от 6 пМ до приблизительно 50 пМ) и желаемую IC₅₀ (например, менее чем 500 пМ) для ингибирования IL-1β-стимулируемого высвобождения IL-6 из фибробластов человека. Примеры антител включают антитело, обозначенное в настоящем описании как АВ1.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающим антителам или IL-1β-связывающим фрагментам, которые связываются селективно с IL-1β, причем они связываются с IL-1β с большей аффинностью, чем с другими антигенами. IL-1β-связывающие антитела или IL-1β-связывающие фрагменты могут селективно связываться с IL-1β человека, а также детектируемо связываются с IL-1β не человека. Альтернативно или дополнительно, антитела или их фрагменты могут связываться с IL-1β человека и с IL-1β одного другого млекопитающего (первого млекопитающего) и не связываться с IL-1β по меньшей мере одного другого млекопитающего (второго млекопитающего). Например, антитела или их фрагменты могут связываться с одним или несколькими IL-1β грызуна, IL-1β примата, IL-1β собаки и IL-1β кролика и/или не связываться с IL-1β морской свинки. Альтернативно или дополнительно, антитела или их фрагменты могут связываться с IL-1β мыши с более высокой аффинностью, чем с IL-1β крысы. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты могут обладать одной и той же или по существу одной и той же активностью против IL-1β человека и IL-1β примата. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты могут обладать одной и той же или по существу одной и той же активностью против рекомбинантного IL-1β человека и эндогенного IL-1β человека. Альтернативно или дополнительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты могут нейтрализовать IL-1β мыши.

Как использовано в настоящем описании, антителом или фрагментом, которые специфически связываются с антигеном-мишенью, называют антитело, которое связывает антиген-мишень с большей аффинностью, чем другие сходные антигены. Например, антитело или его фрагмент является специфическим в отношении его когнатного антигена, когда вариабельные области данного антитела или фрагмента распознают и связывают когнатный антиген с детектируемым предпочтением (отличая антиген от других известных полипептидов того же самого семейства измеримыми различиями в аффинности связывания, несмотря на возможное существование локализованной идентичности, гомологии или локализованного сходства между членами семейства). Следует понимать, что специфические антитела и фрагменты могут также взаимодействовать с другими белками (например, белком А S. aureus или другими антителами в способах ELISA) посредством взаимодействия с последовательностями вне вариабельной области данных антител и, в частности, в константной области антитела или фрагмента. Скрининг-анализы для определения специфичности связывания антитела хорошо известны, см. Harlow et al. “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6.

Один аспект настоящего изобретения относится к IL-1β-связывающим антителам и их IL-1β-связывающим фрагментам, имеющим неожиданно низкие константы диссоциации (K_D), например, менее чем 3 пМ, альтернативно, 2 пМ или менее, альтернативно, 1 пМ или менее, альтернативно, 0,8 пМ или менее, альтернативно, 0,74 пМ или менее, альтернативно, 0,72 пМ или менее, альтернативно, 0,7 пМ или менее, альтернативно, 0,6 пМ или менее, альтернативно, 0,56 пМ или менее, альтернативно, 0,5 пМ или менее, альтернативно, 0,3 пМ или менее, альтернативно, 0,26 пМ или менее, альтернативно, 0,24 пМ или менее, альтернативно, 0,2 пМ или менее. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения IL-1β-связывающие антитела и фрагменты могут быть описаны со ссылкой на верхнюю границу диапазона констант диссоциации. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения IL-1β-связывающие антитела и фрагменты могут быть описаны со ссылкой на нижнюю границу диапазона констант диссоциации, например антитело или фрагмент, имеющий константу диссоциации 0,07 пМ или более, альтернативно, 0,1 пМ или более, альтернативно, 0,11 пМ или более, альтернативно, 0,15 пМ или более, альтернативно, 0,2 пМ или более, альтернативно, 0,24 пМ или более, альтернативно, 0,26 пМ или более, альтернативно, 0,3 пМ или более, альтернативно, 0,5 пМ или более, альтернативно, 0,7 пМ или более. Любая более высокая константа диссоциации и более низкая константа диссоциации, как указано выше, могут быть комбинированы для определения диапазона констант диссоциации, при условии, что нижняя выбранная величина равна верхней выбранной величине или меньше, чем верхняя выбранная величина.

В другом аспекте настоящего изобретения предоставлены новые IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты, которые связываются с IL-1β с константной диссоциации, больше, чем 6 пМ и меньше, чем 50 пМ, или равной 50 пМ, альтернативно, в диапазоне приблизительно от 13 пМ до приблизительно 25 пМ, и где IC₅₀ антитела или фрагмента для ингибирования IL-1β-стимулированного высвобождения IL-6 из фибробластов человека составляет менее чем 0,5 нМ (500 пМ), альтернативно, приблизительно от 5 пМ до приблизительно 200 пМ, альтернативно, приблизительно от 10 пМ до приблизительно 100 пМ, альтернативно, приблизительно 30 пМ. Полагают, что может быть желательно получение IL-1β-связывающего антитела или фрагмента, обладающего вышеуказанной аффинностью связывания и активностью, для некоторых способов лечения или профилактики IL-1β-опосредованных состояний или заболеваний. Примеры антител включают антитело, обозначенное в настоящем описании как АВ1.

Настоящие антитела и фрагменты связываются с IL-1β с высокой аффинностью, как показано константами диссоциации, представленными в настоящем описании. Константы аффинности, характеризующие аффинность антител в отношении антигенов, могут быть константами ассоциации, измеряемыми по кинетике образования комплекса антиген-антитело. Альтернативно, аффинность связывания может быть охарактеризована константой диссоциации, которая является обратной величиной константы ассоциации. Полагают, что термин K_D, в настоящем описании, означает константу диссоциации взаимодействия антитело-антиген.

Настоящее изобретение также относится к нейтрализующим антителам или их нейтрализующим фрагментам, которые связываются с IL-1β таким образом, что они нейтрализуют биологическую активность IL-1β. Нейтрализация биологической активности IL-1β может быть оценена анализами на один или несколько индикаторов биологической активности IL-1β, таких как IL-1β-стимулируемое высвобождение IL-6 из фибробластов или других клеток человека, IL-1β-индуцируемое высвобождение IL-8 из клеток крови или IL-1β-индуцируемая пролиферация Т-хелперных клеток. Предпочтительно, IL-1β-связывающие антитела и фрагменты настоящего изобретения нейтрализуют биологическую активность IL-1β, связанную с функцией передачи сигнала IL-1-рецептора типа I (IL-1-1RI), связанного IL-1β.

Как правило, нейтрализующие антитела и фрагменты настоящего изобретения могут нейтрализовать биологическую активность IL-1β, независимо от того, является ли связывание IL-1β с рецептором IL-1 типа I блокированным. Более предпочтительно, IL-1β-связывающие антитела или их IL-1β-связывающие фрагменты нейтрализуют биологическую активность IL-1β связыванием с IL-1β, по существу без предотвращения связывания, связанного IL-1β с IL-1-рецептором типа I. Потенциальным преимуществом таких антител и фрагментов является то, что они могут связывать и нейтрализовать IL-1β, все еще давая возможность IL-1β связываться с IL-1RI. Это может приводить к эффективному снижению биологической активности IL-1α, а также биологической активности IL-1β, поскольку имеется меньше несвязанных сайтов IL-1RI в отношении IL-1α для связывания с ним. Таким образом, IL-1β-связывающие антитела и фрагменты настоящего изобретения можно использовать в способах, в которых желательна нейтрализация биологической активности IL-1 in vitro и in vivo.

Данные антитела или фрагменты могут быть нейтрализующими антителами или фрагментами, которые специфически связываются с эпитопом IL-1β, который влияет на биологическую активность IL-1β. Антитела или их фрагменты могут связываться с чувствительным к нейтрализации эпитопом IL-1β. При связывании чувствительного к нейтрализации эпитопа IL-1β одним из настоящих антител или фрагментов результатом является потеря биологической активности IL-1β, содержащего данный эпитоп.

В некоторых вариантах осуществления IL-1β-связывающие антитела или IL-1β-связывающие фрагменты могут иметь IC₅₀ для ингибирования IL-1β-стимулированного высвобождения IL-1β из клеток крови менее чем 50 пМ, альтернативно, приблизительно 25 пМ или менее, альтернативно, приблизительно 10 пМ или менее, альтернативно, приблизительно 25 пМ или менее, альтернативно, приблизительно 10 пМ или менее, альтернативно, приблизительно 2 пМ или менее. IC₅₀ для ингибирования IL-1β-стимулированного высвобождения IL-1β из клеток крови является концентрацией, необходимой для ингибирования 50% IL-8, высвобождаемого IL-1β-стимуляцией клеток крови. Примеры антител включают антитело, обозначенное в настоящем описании как АВ7.

Настоящее изобретение также относится к IL-1β-связывающему антителу или его IL-1β-связывающему фрагменту, содержащему измененную аминокислотную последовательность, где измененная аминокислотная последовательность имеет одну или по меньшей мере одну замену, одно добавление или одну делецию из исходной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:27 или 28 (или любой из других описанных в настоящем описании последовательностей), причем измененное антитело или измененный фрагмент обладает такой же или по существу такой же аффинностью и специфичностью связывания эпитопа, что и исходная аминокислотная последовательность. Предполагают, что одна или несколько замен, делеций или одно или несколько добавлений могут быть произведены в отношении IL-1β-связывающих антител или IL-1β-связывающих фрагментов, предоставленных в настоящем описании, таких как антитела или фрагменты, содержащие SEQ ID NO:28 и/или SEQ ID NO:27, при сохранении той же самой аффинности и специфичности связывания эпитопа исходного антитела или фрагмента. Например, настоящее изобретение относится к IL-1β-связывающему антителу или его IL-1β-связывающему фрагменту, содержащему измененную аминокислотную последовательность, где измененная аминокислотная последовательность имеет одну или по меньшей мере одну замену, добавление или делецию из исходной аминокислотной последовательности, содержащей SEQ ID NO:8 (или любая из других, описанных в настоящем описании последовательностей, может быть использована в качестве исходной последовательности), где измененное антитело или измененный фрагмент обладает такой же или по существу такой же аффинностью и специфичностью связывания эпитопа, что и исходная аминокислотная последовательность SEQ ID NO:8 (или конкретная последовательность, которая используется в качестве исходной аминокислотной последовательности). Под фразой «по существу такая же» аффинность имеется в виду, что аффинность или константа диссоциации, определенные, как описано в настоящем описании, не увеличивается или не уменьшается более чем свойственная анализу вариация в анализе на антитело или фрагмент, содержащие SEQ ID NO:28 или 27, такой как вариация, наблюдаемая при проведении данного анализа три или более раз в независимых временных точках. Под фразой «по существу такая же» специфичность эпитопа имеется в виду, что связывание аминокислотной последовательности, содержащей эпитоп, как определено в настоящем описании, находится в пределах присущей анализу вариации в анализе на антитело или фрагмент, содержащие SEQ ID NO:28 или 27, такой как вариация, наблюдаемая при проведении анализа три или более раз в независимых временных точках. При сравнении с антителом или фрагментом, содержащим SEQ ID NO:28 или 27, имеется в виду, что такое сравнение должно проводиться между измененной аминокислотной последовательностью и исходной аминокислотной последовательностью, из которой произведена одна или несколько замен, делеций или добавлений, причем такая исходная последовательность идентична во всех других аминокислотах.

Антитела, гуманизированные антитела и сконструированные антитела человека

IL-1β-связывающие антитела настоящего изобретения могут быть предоставлены в виде поликлональных антител, моноклональных антител (mAb), рекомбинантных антител, химерных антител, CDR-привитых антител, полностью человеческих антител, одноцепочечных антител и/или биспецифических антител, а также фрагментов, включая их варианты и производные, полученные известными способами, включающими, но не ограничивающимися ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные способы.

Антитела обычно содержат два полипептида тяжелой цепи и два полипептида легкой цепи, хотя рассматриваются также однодоменные антитела, имеющие одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, и антитела с тяжелыми цепями, лишенные легких цепей. Имеется пять типов тяжелых цепей, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, на основе аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Такие различные типы тяжелых цепей образуют пять классов антител IgА (включая IgА₁ и IgА₂), IgD, IgЕ, IgG и IgМ, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄. Существует также два типа легких цепей, называемых каппа (κ) или лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константных доменов. Полноразмерное антитело включает в себя константный домен и вариабельный домен. Константный домен не должен присутствовать в антигенсвязывающем фрагменте антитела. Антигенсвязывающие фрагменты антитела, описанного в настоящем описании, могут включать в себя фрагменты антител Fab, F(ab')₂ и F(v). Как обсуждается более подробно ниже, IL-1β-связывающие фрагменты включают фрагменты антител и антигенсвязывающие полипептиды, которые будут связываться с IL-1β.

Каждая из последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включает в себя вариабельную область с тремя определяющими комплементарность областями (CDR), а также не-CDR каркасными областями (FR). Термины «тяжелая цепь» и «легкая цепь» в настоящем описании означают вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, соответственно, если не указано иное. CDR тяжелой цепи обозначены в настоящем описании как CDR-Н1, CDR-Н2 и CDR-Н3. CDR легкой цепи обозначены в настоящем описании как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3. Вариабельные области и CDR в последовательности антитела могут быть идентифицированы (i) в соответствии с общими правилами, которые были разработаны в данной области, или (b) сопоставлением таких последовательностей с базой данных известных вариабельных областей. Способы идентификации указанных областей описаны Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001 и Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc., Hoboken, NJ, 2000. Базы данных последовательностей антител описаны и могут быть доступны через базу данных “The Kabatman” в (поддерживаемую А.С. Martin в Depаrtment of Biochemistry & Molecular Biology University College London, England) и VBASE2 в http://www.vbase2.org, как описано Retter et al., Nucl. Acids Res., 33(Database issue): D671-D674 (2005). Веб-сайт базы данных “Kabatman” также включает общие правила thumb для идентификации CDR. Термин “CDR” в настоящем описании имеет значение, определенное Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5^th ed., U.S. Department of Health and Human Services, 1991, если не указано иное.

Настоящее изобретение относится к IL-1β-связывающим антителам, которые содержат две полноразмерные тяжелые цепи и две полно