Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с мср-1

Нуклеиновые кислоты, связывающиеся с мср-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, связывающимся с MCP-1, и к их применению для получения лекарственного препарата и диагностического средства соответственно.

Человеческий MCP-1 (моноцитарный хемоаттрактант, белок-1; альтернативные названия: MCAF [моноцитарный хемоаттрактант и активирующий фактор]; CCL2; SMC-CF [колониестимулирующий фактор гладких мышц]; HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; код доступа SwissProt, P13500) независимо подразделяется на три группы (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989). Этот белок состоит из 76 аминокислот и, подобно всем хемокинам, характеризуется тем, что он имеет гепарин-связывающий сайт. Две внутримолекулярные дисульфидные связи придают данной молекуле стабильную жесткую структуру. Кроме того, MCP-1 у своего амино-конца содержит пироглутамат. В положении Thr 71 находится потенциальный сайт O-связанного гликозилирования. Другие члены семейства MCP были также обнаружены у человека (MCP-2, -3, -4) и у мышей (MCP-2, -3, -5). Человеческие белки имеют приблизительно 70% гомологию с человеческим MCP-1.

Структура MCP-1 была выявлена с помощью ЯМР (Handel 1996) и рентгеноструктурного анализа (Lubkowski 1997). Мономер MCP-1 имеет укладку, типичную для хемокинов, у которых за амино-концевыми цистеинами расположена длинная петля, переходящая в три антипараллельных β-складчатых слоя в мотиве “греческий ключ” (Greek key). На своем конце этот белок имеет α-спираль, которая перекрывается тремя β-слоями (код доступа к базе данных PDB - 1DOK).

Хотя трехмерная структура MCP-1 у млекопитающих различных видов, в основном, сохраняется, однако эволюционно аминокислотная последовательность не является высококонсервативной. Результаты сопоставления последовательностей путем выравнивания продемонстрировали 55% общее сходство человеческой и мышиной последовательностей MCP-1 (также называемого JE) в первых 76 аминокислотах. Помимо аминокислотной последовательности, мышиный MCP-1 отличается от человеческого MCP-1 размером молекулы (125 аминокислот) и степенью гликозилирования. Мышиный MCP-1 содержит карбокси-концевой домен, состоящий из 49 аминокислот, который отсутствует в человеческом MCP-1 и который не является необходимым для биологической активности in vitro. Ниже представлены проценты идентичности аминокислотных последовательностей человеческого MCP-1 с последовательностями MCP-1 различных видов:

MCP-1 Macaca mulatta (макак резуса)	97%
MCP-1 Sus scrofa (свинья)	79%
Equus caballus (лошадь)	78%
MCP-1 Canis familiaris (собака)	76%
MCP-1 Oryctolagus cuniculus (кролик)	75%
Bos Taurus (корова)	72%
MCP-3 Homo sapiens	71%
Эотаксина Homo sapiens	64%
MCP-2 Homo sapiens	62%
MCP-1 Mus musculus (мышь)	55%
MCP-1 Rattus norvegicus (крыса)	55%

Принимая во внимание высокую степень дивергенции, следует отметить, что для успешного проведения фармакологических исследований на грызунах-моделях может оказаться необходимым получение антагонистов MCP-1 грызунов.

MCP-1 представляет собой сильный аттрактант моноцитов/макрофагов, базофилов, активированных Т-клеток и NK-клеток. Клетки различных типов широкого ряда, такие как эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, кератиноциты, синовиальные клетки, мезангиальные клетки, остеобласты, клетки гладких мышц, а также множество опухолевых клеток экспрессируют MCP-1 (Baggiolini 1994). Экспрессия этого белка стимулируется провоспалительными агентами нескольких типов, такими как IL-1β, TNF-α, IFN-γ, ЛПС (липополисахарид) и GM-CSF.

Свойством MCP-1, которое является довольно необычным для всей системы различных хемокинов, является его высокая степень специфичности к своему рецептору, а именно его высокая аффинность связывания только с хемокиновым рецептором CCR2. Подобно всем хемокиновым рецепторами, CCR2 представляет собой GPCR (рецептор, сопряженный с G-белком) (Dawson 2003). CCR2, очевидно, экспрессируется в двух несколько отличающихся формах, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК, кодирующей карбокси-концевую область, а именно: CCR2a и CCR2b (Charo 1994). Эти рецепторы экспрессируются в моноцитах, в миелоидных клетках-предшественниках и в активированных T-клетках (Myers 1995; Qin 1996). Константа диссоциации MCP-1, связанного с рецептором, трансфицированным в клетки HEK-293, составляет 260 пM, что соответствует величинам, измеренным на моноцитах (Myers 1995; Van Riper 1993). Активация рецептора CCR2b, присутствующего на трансфицированных клетках HEK-293, белком MCP-1 приводит к ингибированию аденилилциклазы при концентрации 90 пМ и к мобилизации внутриклеточного кальция при несколько более высоких концентрациях и, вероятно, не зависит от гидролиза фосфатидилинозита. Такое влияние на высвобождение аденилилциклазы и внутриклеточного кальция в значительной степени ингибируется коклюшным токсином, что указывает на участие гетеротримерных G-белков типа G_i в передаче сигнала (Myers 1995).

MCP-1 участвует в рекрутинге моноцитов в воспаленной ткани. Присутствующие в этой ткани макрофаги высвобождают хемокины, такие как MCP-1 и т.п., и цитокины, такие как TNF, IL-1β и т.п., которые активируют эндотелиальные клетки, экспрессирующие серию адгезивных молекул. Образовавшийся “липкий” эндотелий опосредует эффект “катящихся” моноцитов, перемещающихся вдоль поверхности сосудистого русла. При этом моноциты сталкиваются с присутствующим на эндотелиальной поверхности MCP-1, который связывается с CCR2 на моноцитах и активирует их. В конечном счете, это приводит к полному прекращению распространения моноцитов вдоль эндотелия и их транспорта в окружающие ткани, где указанные моноциты дифференцируются в макрофаги и мигрируют в область максимальной концентрации MCP-1.

MCP-1 является членом семейства хемокинов, которое представляет собой семейство небольших (примерно 8-14 кДа) гепарин-связывающих, главным образом, основных и структурно родственных молекул. Они образуются преимущественно в воспаленных тканях и регулируют рекрутинг, активацию и пролиферацию лейкоцитов (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). Хемокины селективно индуцируют хемотаксис нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, макрофагов, тучных клеток и Т- и В-клеток. Хемокины, помимо их хемотаксического действия, могут селективно вызывать и другие эффекты в отвечающих клетках, такие как изменение формы клеток, временное увеличение концентрации свободных внутриклеточных ионов кальция, дегрануляция, активация интегринов, образование биологических активных липидов, таких как лейкотриены, простагландины, тромбоксаны, или “дыхательный взрыв” (высвобождение молекул активного кислорода для деструкции патогенных микроорганизмов или опухолевых клеток). Таким образом, посредством индуцирования высвобождения других провоспалительных медиаторов, хемотаксиса и экстравазации лейкоцитов на участке инфицирования или воспаления, хемокины стимулируют усиление воспалительного ответа.

По расположению первых двух из четырех консервативных цистеиновых остатков хемокины подразделяются на четыре класса: CC или β-хемокины, в которых цистеины присутствуют в тандеме; CXC или α-хемокины, которые разделены одним дополнительным аминокислотным остатком; XC или γ-хемокины и лимфотактин, которые были обнаружены лишь недавно и которые имеют только один дисульфидный мостик; и CX3C-хемокины, которые отличаются тем, что они имеют три аминокислотных остатка между цистеинами, причем лишь одним известным до настоящего времени членом этого класса является мембраносвязанный фракталкин (Bazan 1997).

Хемокины CXC, в частности те хемокины CXC, которые имеют у своего амино-конца аминокислотную последовательность ELR, действуют, главным образом, на нейтрофилы. Примерами хемокинов CXC, активных по отношению к нейтрофилам, являются IL-8, GROα, -β и -γ, NAP-2, ENA-78 и GCP-2. Хемокины CC действуют на лейкоциты широкого ряда, такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, базофилы, а также Т- и В-лимфоциты (Oppenheim 1991; Baggiolini 1994; Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996). Примерами таких хемокинов являются I-309, MCP-1, -2, -3, -4, MIP-1α и -β, RANTES и эотаксин.

Хемокины действуют посредством рецепторов, которые принадлежат к суперсемейству из семи трансмембранных рецепторов, связанных с G-белком (GPCR; Murphy 2000). Обычно считается, что взаимодействие хемокина и хемокинового рецептора является неспецифическим, то есть один хемокин может связываться со многими хемокиновыми рецепторами, и наоборот, один хемокиновый рецептор может взаимодействовать с несколькми хемокинами. Некоторыми известными рецепторами для хемокинов CC являются: CCR1, который связывается с MIP-1α и RANTES (Neote 1993; Gao 1993); CCR2, который связывается с хемокинами, включая MCP-1, -2, -3 и -4 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); CCR3, который связывается с хемокинами, включая эотаксин, RANTES и MCP-3 (Ponath 1996b); CCR4, который, как было обнаружено, передает сигнал в ответ на действие MCP-1, MIP-1α и RANTES (Power 1995); и CCR5, который, как было показано, передает сигнал в ответ на действие MIP-1α и -β и RANTES (Boring 1996; Raport 1996; Samson 1996).

Как указывалось выше, все четыре члена семейства MCP (1-4) связываются с CCR2, тогда как MCP-2, MCP-3 и MCP-4 могут также взаимодействовать с CCR1 и CCR3 (Gong 1997; Heath 1997; Uguccioni 1997), а MCP-2 может взаимодействовать с CCR5 (Ruffing 1998). Другим хемокином СС, обнаруживающим высокую степень гомологии с хемокинами семейства MCP, является эотаксин, который был впервые выделен из жидкости бронхоальвеолярного лаважа, взятого у сенсибилизированных аллергеном морских свинок (Jose 1994). Было показано, что эотаксин также обладает способностью активировать CCR2 (Martinelli 2001).

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, заключается в необходимости разработки способов, в основе которых лежит специфическое взаимодействие с МСР-1. Более конкретно, проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена с применением способов, основанных на использовании нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с MCP-1.

Другая проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, заключается в необходимости разработки способа приготовления лекарственного средства для лечения заболеваний человека или животных, где указанное заболевание характеризуется прямым или опосредованным участием MCP-1 в механизме патогенеза этого заболевания.

Еще одна проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, заключается в необходимости разработки способа получения диагностического средства для лечения заболевания, которое характеризуется прямым или опосредованным участием MCP-1 в механизме патогенеза этого заболевания.

Эти и другие проблемы, рассматриваемые в настоящем изобретении, могут быть решены с применением объекта настоящего изобретения, заявленного в независимых пунктах прилагаемой формулы изобретения. Предпочтительные варианты могут быть взяты из зависимых пунктов прилагаемой формулы изобретения.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть также решена в соответствии с первым аспектом изобретения с использованием нуклеиновой кислоты, предпочтительно связывающейся с MCP-1 и выбранной из группы, включающей нуклеиновую кислоту типа 1A, нуклеиновую кислоту типа 1B, нуклеиновую кислоту типа 2, нуклеиновую кислоту типа 3, нуклеиновую кислоту типа 4 и нуклеиновую кислоту, имеющую любую нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NО:87-115.

В первом подаспекте первого аспекта изобретения нуклеиновая кислота типа 1A содержит, в направлении 5'→3', первый фрагмент “бокс В1А”, второй фрагмент “бокс В2”, третий фрагмент “бокс В3”, четвертый фрагмент “бокс В4”, пятый фрагмент “бокс В5”, шестой фрагмент “бокс В6” и седьмой фрагмент “бокс В1В”, где

первый фрагмент “бокс B1A” и седьмой фрагмент “B1B бокс” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

первый фрагмент “бокс B1A” содержит нуклеотидную последовательность AGCRUG,

второй фрагмент “бокс B2” содержит нуклеотидную последовательность CCCGGW,

третий фрагмент “бокс В3” содержит нуклеотидную последовательность GUR,

четвертый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность RYA,

пятый фрагмент “бокс В5” содержит нуклеотидную последовательность GGGGGRCGCGAYC,

шестой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность UGCAAUAAUG или URYAWUUG, а

седьмой фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность CRYGCU.

В предпочтительном варианте первого подаспекта изобретения

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность AGCGUG.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность CCCGGU.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

третий фрагмент “бокс В3” содержит нуклеотидную последовательность GUG.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

четвертый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность GUA.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

пятый фрагмент “бокс В5” содержит нуклеотидную последовательность GGGGGGCGCGACC.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

шестой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность UACAUUUG.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения

седьмой фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность CACGCU.

В одном из вариантов первого подаспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:21.

Во втором подаспекте первого аспекта изобретения нуклеиновая кислота типа 1В содержит, в направлении 5'→3', первый фрагмент “бокс В1А”, второй фрагмент “бокс В2”, третий фрагмент “бокс В3”, четвертый фрагмент “бокс В4”, пятый фрагмент “бокс В5”, шестой фрагмент “бокс В6” и седьмой фрагмент “бокс B1B”, где:

первый фрагмент “бокс В1А” и седьмой фрагмент “бокс B1B” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность AGYRUG,

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность CCAGCU или CCAGY,

третий фрагмент “бокс В3” содержит нуклеотидную последовательность GUG,

четвертый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность AUG,

пятый фрагмент “бокс В5” содержит нуклеотидную последовательность GGGGGGCGCGACC,

шестой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность CAUUUUA или CAUUUA и

седьмой фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность CAYRCU.

В одном из вариантов второго подаспекта изобретения

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность AGCGUG.

В одном из вариантов второго подаспекта изобретения

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность CCAGU.

В одном из вариантов второго подаспекта изобретения

шестой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность CAUUUUA.

В одном из вариантов второго подаспекта изобретения

седьмой фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность CACGCU.

В одном из вариантов второго подаспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:27.

В третьем подаспекте первого аспекта изобретения нуклеиновая кислота типа 2 содержит, в направлении 5'→3', первый фрагмент “бокс B1A”, второй фрагмент “бокс В2” и третий фрагмент “бокс В1В”, где

первый фрагмент “бокс В1А” и третий фрагмент “бокс В1В” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей ACGCA, CGCA и GCA,

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей UGCGU, UGCG и UGC.

В одном из вариантов третьего подаспекта изобретения

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC.

В одном из вариантов третьего подаспекта изобретения

a) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность ACGCA, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность UGCGU; или

b) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность CGCA, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность UGCG; или

c) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GCA, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность UGC или UGCG.

В одном из вариантов третьего подаспекта изобретения

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GCA.

В предпочтительном варианте третьего подаспекта изобретения

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность UGCG.

В одном из вариантов третьего подаспекта изобретения нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:37, SEQ ID NО:116, SEQ ID NО:117 и SEQ ID NO:278.

В четвертом подаспекте первого аспекта изобретения нуклеиновая кислота типа 3 содержит, в направлении 5'→3', первый фрагмент “бокс В1А”, второй фрагмент “бокс В2А”, третий фрагмент “бокс В3”, четвертый фрагмент “бокс В2В”, пятый фрагмент “бокс В4”, шестой фрагмент “бокс В5A”, седьмой фрагмент “бокс В6”, восьмой фрагмент “бокс В5B” и девятый фрагмент “бокс В1В”, где

первый фрагмент “бокс В1А” и девятый фрагмент “бокс В1В” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

второй фрагмент “бокс В2A” и четвертый фрагмент “бокс В2B” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

шестой фрагмент “бокс В5A” и восьмой фрагмент “бокс В5B” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей GURCUGC, GKSYGC, KBBSC и BNGC,

второй фрагмент “бокс В2А” содержит нуклеотидную последовательность GKMGU,

третий фрагмент “бокс В3” содержит нуклеотидную последовательность KRRAR,

четвертый фрагмент “бокс В2В” содержит нуклеотидную последовательность ACKMC,

пятый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW и UGCCAGUG,

шестой фрагмент “бокс В5А” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей GGY и CWGC,

седьмой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей YAGA, CKAAU и CCUUUAU,

восьмой фрагмент “бокс В5В” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей GCYR и GCWG, и

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM и GCNV.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

третий фрагмент “бокс В3” содержит нуклеотидную последовательность GAGAA или UAAAA.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

пятый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность CAGCGACU или CAACGACU.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

пятый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность CAGCGACU, а бокс B3 содержит нуклеотидную последовательность UAAAA.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

пятый фрагмент “бокс В4” содержит нуклеотидную последовательность CAACGACU, а бокс B3 содержит нуклеотидную последовательность GAGAA.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

седьмой фрагмент “бокс В6” содержит нуклеотидную последовательность UAGA.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

a) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GURCUGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCAGCAC; или

b) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GKSYGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCRSMC; или

c) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность KBBSC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GSVVM; или

d) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность BNGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCNV.

В предпочтительном варианте четвертого подаспекта изобретения

a) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GUGCUGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCAGCAC; или

b) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GUGCGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCGCAC; или

c) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность KKSSC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GSSMM; или

d) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность SNGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCNS.

В другом предпочтительном варианте четвертого подаспекта изобретения

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GGGC, а

девятый фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GCCC.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения второй фрагмент “бокс В2A” содержит нуклеотидную последовательность GKMGU, а четвертый фрагмент “бокс В2В” включает нуклеотидную последовательность ACKMC.

В предпочтительном варианте четвертого подаспекта изобретения второй фрагмент “бокс В2A” содержит нуклеотидную последовательность GUAGU, а четвертый фрагмент “бокс В2B” содержит нуклеотидную последовательность ACUAC.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения

a) шестой фрагмент “бокс В5A” содержит нуклеотидную последовательность GGY, а

восьмой фрагмент “бокс В5B” содержит нуклеотидную последовательность GCYR; или

b) шестой фрагмент “бокс В5A” содержит нуклеотидную последовательность CWGC, а

восьмой фрагмент “бокс В5B” содержит нуклеотидную последовательность GCWG.

В предпочтительном варианте четвертого подаспекта изобретения

шестой фрагмент “бокс В5A” содержит нуклеотидную последовательность GGC, а

восьмой фрагмент “бокс В5B” содержит нуклеотидную последовательность GCCG.

В более предпочтительном варианте четвертого подаспекта изобретения шестой фрагмент “бокс В5A” гибридизуется с нуклеотидами GCY восьмого фрагмента “бокс B5B”.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:56.

В одном из вариантов четвертого подаспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:57-61, SEQ ID NO:67-71 и SEQ ID NO:73.

В пятом подаспекте первого аспекта изобретения нуклеиновая кислота типа 4 содержит, в направлении 5'→3', первый фрагмент “бокс В1А”, второй фрагмент “бокс В2” и третий фрагмент “бокс В1В”, где

первый фрагмент “бокс В1А” и третий фрагмент “бокс В1В” необязательно гибридизуются друг с другом, и в результате такой гибридизации образуется двухцепочечная структура,

первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU и UGUU;

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG и CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC и GGCA.

В одном из вариантов пятого подаспекта изобретения

a) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GUGUU, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GRCAC;

b) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность GCGCGAG, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность CUCGCGUC; или

c) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность CSKSUU, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GRSMSG; или

d) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность UGUU, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GGCA; или

e) первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность AGCGUGDU, а

третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GNCASGCU.

В предпочтительном варианте пятого подаспекта изобретения первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность CSKSUU, а третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GRSMSG.

В более предпочтительном варианте пятого подаспекта изобретения первый фрагмент “бокс В1А” содержит нуклеотидную последовательность CCGCUU, а третий фрагмент “бокс В1В” содержит нуклеотидную последовательность GGGCGG.

В одном из вариантов пятого подаспекта изобретения

второй фрагмент “бокс В2” содержит нуклеотидную последовательность AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG.

В одном из вариантов пятого подаспекта изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:80.

В одном из вариантов 1-5 подаспектов изобретения нуклеиновая кислота обладает способностью связываться с MCP-1, предпочтительно с человеческим MCP-1.

В одном из вариантов 1-5 подаспектов изобретения нуклеиновая кислота обладает способностью связываться с хемокином, где указанный хемокин выбран из группы, включающей эотаксин, MCP-1, MCP-2 и MCP-3.

В одном из вариантов 1-5 подаспектов изобретения нуклеиновая кислота обладает способностью связываться с хемокином, где указанный хемокин выбран из группы, включающей человеческий эотаксин, человеческий MCP-1, человеческий MCP-2 и человеческий MCP-3.

В одном из вариантов 1-5 подаспектов изобретения нуклеиновая кислота обладает способностью связываться с MCP-1, где указанный MCP-1 предпочтительно выбран из группы, включающей обезьяний MCP-1, лошадиный MCP-1, кроличий MCP-1, коровий MCP-1, собачий MCP-1, свиной MCP-1 и человеческий MCP-1.

В одном из вариантов 1-5 подаспектов изобретения нуклеиновая кислота обладает способностью связываться с человеческим MCP-1.

В предпочтительном варианте 1-5 подаспектов изобретения MCP-1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения с использованием нуклеиновой кислоты, предпочтительно связывающейся с мышиным MCP-1, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:253 и SEQ ID NO:254.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с третьим аспектом настоящеего изобретения с использованием нуклеиновой кислоты, предпочтительно связывающейся с мышиным MCP-1, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:127.

В одном из вариантов второго и третьего аспектов изобретения мышиный MCP-1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения нуклеиновая кислота имеет модификацию, где указанная модификация предпочтительно представляет собой высокомолекулярную группу, и/или указанная модификация предпочтительно позволяет изменять свойства нуклеиновой кислоты согласно первому, второму или третьему аспектам изобретения, а именно время ее присутствия в организме животного или человека, предпочтительно в организме человека.

В предпочтительном варианте 1-3 аспектов изобретения указанная модификация выбрана из группы, включающей группу ГЭК и группу ПЭГ.

В более предпочтительном варианте 1-3 аспектов изобретения указанной модификацией является молекула ПЭГ, состоящая из прямого или разветвленного ПЭГ, где молекулярная масса указанной молекулы ПЭГ предпочтительно составляет примерно от 20 до 120 кД, более предпочтительно примерно от 30 до 80 кД, а наиболее предпочтительно примерно 40 кД.

В альтернативном более предпочтительном варианте 1-3 аспектов изобретения указанной модификацией является молекула ГЭК, где молекулярная масса указанной молекулы ГЭК предпочтительно составляет примерно от 10 до 130 кД, более предпочтительно примерно от 30 до 130 кД, а наиболее предпочтительно примерно 100 кД.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения указанная модифицирующая молекула присоединена к нуклеиновой кислоте посредством линкера.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения указанная модифицирующая молекула присоединена к нуклеиновой кислоте у ее 5'-концевого нуклеотида и/или у ее 3'-концевого нуклеотида, и/или к нуклеотиду указанной нуклеиновой кислоты между 5'-концевым нуклеотидом и 3'-концевым нуклеотидом.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения нуклеотидами указанной нуклеиновой кислоты или нуклеотидами, образующими указанную нуклеиновую кислоту, являются L-нуклеотиды.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения указанной нуклеиновой кислотой является L-нуклеиновая кислота.

В одном из вариантов 1-3 аспектов изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты, обладающая способностью связываться с MCP-1, состоит из L-нуклеотидов.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с четвертым аспектом изобретения с использованием фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения и, необязательно, дополнительный компонент, где указанный дополнительный компонент выбран из группы, включающей себя фармацевтически приемлемые наполнители, фармацевтически приемлемые носители и фармацевтически активные средства.

В одном из вариантов четвертого аспекта изобретения указанная фармацевтическая композиция включает в себя нуклеиновую кислоту согласно 1-3 аспектам изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с пятым аспектом с применением нуклеиновой кислоты согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения, используемой для получения лекарственного средства.

В одном из вариантов пятого аспекта изобретения указанное лекарственное средство может быть использовано в медицине или в ветеринарии.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с шестым аспектом изобретения с применением нуклеиновой кислоты согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения, используемой для получения диагностических средств.

В одном из вариантов пятого аспекта изобретения и в одном из вариантов шестого аспекта изобретения лекарственное средство и диагностическое средство соответственно предназначены для лечения и/или предупреждения и диагностики соответственно заболеваний или расстройств, выбранных из группы, включающей в себя воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аутоиммунный энцефаломиелит, инсульт, острый и хронический рассеянный склероз, хроническое воспалительное заболевание, ревматоидный артрит, болезни почек, рестеноз, рестеноз после ангиопластики, острые и хронические аллергические реакции, первичные и вторичные иммунологические или аллергические реакции, астму, конъюнктивит, бронхит, рак, атеросклероз, атеросклеротическую сердечно-сосудистую недостаточность или инсульт, псориаз, псориатический артрит, воспаление нервной системы, атопический дерматит, колит, эндометриоз, увеит, заболевания сетчатки, включая дегенерацию желтого пятна, отслоение сетчатки, диабетическую ретинопатию, ретролентальную фиброплазию, пигментный ретинит, пролиферирующую витреоретинопатию и центральную серозную хориоретинопатию; идеопатический фиброз легких, саркоидоз, полимиозит и дерматомиозит; для профилактики иммуносупрессии и снижения риска инфицирования; а также для лечения сепсиса, воспаления почек, гломерулонефрита, быстропрогрессирующего гломерулонефрита, пролиферирующего гломерулонефрита, диабетической нефропатии, обструктивной нефропатии, острого тубулярного некроза и диффузного гломерулосклероза, системной красной волчанки, хронического бронхита, болезни Бехчета, амиотрофического бокового склероза (АБС), раннего атеросклероза, ассоциированного с болезнью Кавазаки, инфаркта миокарда, ожирения, хронической болезни печени, болезни Пейрони, острого поражения хорды спинного мозга, заболеваний, ассоциированных с трансплантацией легких или почек, миокардита, болезни Альцгеймера и невропатии, карциномы молочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака яичника, гамартомы, карциномы прямой и ободочной кишки, аденомы толстой кишки, панкреатита, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и воспалительных заболеваний кишечника, таких как болезнь Крона или язвенный колит.

Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует отметить, что применение нуклеиновых кислот согласно изобретению в диагностических целях основано, главным образом, на повышенном или пониженном уровне хемокинов, где указанный хемокин выбран из группы, включающей эотаксин, MCP-1, MCP-2 и MCP-3, причем более предпочтительным является MCP-1. Для специалиста в данной области очевидно, что большинство из вышеупомянутых заболеваний характеризуется таким повышенным или пониженным уровнем хемокинов.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения с использованием комплекса, включающего в себя хемокин и нуклеиновую кислоту согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения, где указанный хемокин выбран из группы, включающей в себя эотаксин, MCP-1, MCP-2 и MCP-3, при этом предпочтительным комплексом является кристаллический комплекс.

В одном из вариантов седьмого аспекта изобретения указанный хемокин выбран из группы, включающей в себя человеческий эотаксин, человеческий MCP-1, человеческий MCP-2 и человеческий MCP-3.

В одном из вариантов седьмого аспекта изобретения указанным хемокином является MCP-1, предпочтительно выбранный из группы, включающей в себя человеческий МСР-1, обезьяний MCP-1, лошадиный MCP-1, кроличий MCP-1, коровий MCP-1, собачий MCP-1 и свиной MCP-1, при этом более предпочтительным является человеческий MCP-1.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения с использованием нуклеиновой кислоты согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения для детектирования хемокина, где указанный хемокин выбран из группы, включающей в себя эотаксин, MCP-1, MCP-2 и MCP-3.

В одном из вариантов восьмого аспекта изобретения указанный хемокин выбран из группы, включающей в себя человеческий эотаксин, человеческий MCP-1, человеческий MCP-2 и человеческий MCP-3.

В одном из вариантов восьмого аспекта изобретения указанным хемокином является MCP-1, где указанный МСР-1 предпочтительно выбран из группы, включающей в себя человеческий МСР-1, обезьяний MCP-1, лошадиный MCP-1, кроличий MCP-1, коровий MCP-1, собачий MCP-1 и свиной MCP-1, при этом более предпочтительным является человеческий MCP-1.

Проблема, рассматриваемая в настоящем изобретении, может быть решена в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения с применением способа скрининга антагониста хемокина или агониста хемокина, где указанный способ включает следующие стадии:

- получение кандидата на антагонист и/или кандидата на агонист хемокина,

- получение нуклеиновой кислоты согласно первому, второму или третьему аспектам изобретения,

- получение тест-системы, которая обеспечивает детекцию сигнала в присутствии антагониста хемокина и/или агониста хемокина, и

- установление того факта, является ли данный кандидат антагонистом хемокина и/или агонистом хемокина,

где указанный хемокин выбран из группы, включающей в себя эотаксин, MCP-1, MCP-2 и MCP-3.

В одном из вариантов девятого аспекта изобретения указанный хемокин выбран из группы, включающей в себ