Элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах

Элементы рекомбинантного вектора экспрессии (reves) для усиления экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/921141, поданной 30 марта 2007 года.

Предпосылки к созданию изобретения

Имеется целый ряд систем, в которых векторные молекулы нуклеиновой кислоты используют для экспрессии рекомбинантных белков в разнообразном и широком спектре эукариотических или прокариотических клеток-хозяев. Решение, какую пару вектор/клетка-хозяин использовать, обычно зависит от того, какая система обеспечивает наиболее высокий выход желаемого рекомбинантного генного продукта в форме, наиболее подходящей для его намеченного использования. Например, если посттрансляционная модификация, такая как гликозилирование, является решающим требованием к желаемому рекомбинантному белку (например, для антигенности, активности, конформации), то потребуется система эукариотической клетки-хозяина, поскольку для прокариотических клеток характерно отсутствие пост-трансляционной гликозилирующей активности. Также важно, что пара вектор/клетка-хозяин не только продуцирует экспрессированный генный продукт в желаемой форме, а также то, что молекулы желаемого экспрессированного генного продукта могут быть легко выделены из клеток, которые их продуцируют.

Вследствие возрастающих затрат, вовлеченных в развитие рекомбинантных белков, предназначенных для лечения людей, продолжаются усилия увеличить уровень экспрессии таких рекомбинантных белков, особенно в системах, в которых используют эукариотические клетки-хозяева. Различные охарактеризованные цис- и трансдействующие регуляторные элементы имеют нуклеотидные последовательности (ДНК или РНК), которые могут улучшать эффективность экспрессии и/или суммарный выход желаемого рекомбинантного генного продукта. Такие регуляторные элементы включают, но не только, высокоэффективные промоторы, трансляционные энхансерные последовательности (смотрите, например, обзор Dillon and Grosveld, Trends Genet., 9: 134 (1993), контрольные области локуса (LCR; смотрите, например, Grosveld et al., Cell, 51: 975 (1987)), области прикрепления матрикса или остова (MAR, SAR; смотрите, например, патент США № 7129062; Bode et al., Int. Rev. Cytol, 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996)); изоляционные элементы (смотрите, например, Kellum et al., Cell, 64: 941 (1991)); и участки внутренней посадки рибосомы (IRES; смотрите, например, обзор McBratney et al., Curr. Opin. Cell Biol, 5: 961 (1993)). Впоследствии было обнаружено, что некоторые из последовательностей нуклеиновой кислоты таких элементов обладают особыми подпоследовательностями, которые могут влиять на экспрессию.

Несмотря на достижения в понимании различных последовательностей и других факторов, которые могут влиять на экспрессию рекомбинантных белков в различных типах клеток-хозяев, остается необходимость в улучшении выходов рекомбинантных белков, особенно когда такие рекомбинантные белки предназначены для терапевтических или других специализированных применений.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты (полинуклеотидным молекулам), содержащим последовательности нуклеотидных оснований, которые усиливают экспрессию рекомбинантных белков. В настоящем описании такие молекулы нуклеиновой кислоты называются элементами рекомбинантного вектора экспрессии (rEVE). Присутствие rEVE в векторе экспрессии усиливает уровень экспрессии одного или нескольких рекомбинантных белков, кодируемых одним или несколькими функциональными генами, которые находятся в векторе экспрессии по сравнению с уровнем экспрессии в отсутствие этого rEVE. Такие rEVE-опосредованные усиления уровня экспрессии рекомбинантного белка возможны при расположении rEVE 5' к, 3' к, или как 5', так и 3' к (например, фланкируя) гену, кодирующему представляющий интерес рекомбинантный белок (белки). rEVE, находящийся в векторе экспрессии, может усиливать экспрессию одного или нескольких рекомбинантных белков либо кодируемых отдельными соответствующими генами, либо кодируемых одним полицистронным геном, находящимся в векторе экспрессии. REVE могут быть использованы для увеличения уровня экспрессии рекомбинантного белка, используя как стабильно экспрессирующие системы, так и транзиторно экспрессирующие системы.

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенной полинуклеотидной молекуле rEVE, которая содержит последовательность нуклеотидных оснований, выбранную из группы, состоящей из последовательности оснований SEQ ID NO:1 («ARM1»), последовательности оснований SEQ ID NO:2 («ARM2»), и усиливающей экспрессию части любой из представленных выше последовательностей, где в случае присутствия rEVE полинуклеотида в одном и том же векторе экспрессии в качестве рекомбинантного гена, кодирующего рекомбинантный белок, представляющий интерес, уровень экспрессии рекомбинантного белка будет увеличен по сравнению с уровнем экспрессии в отсутствие rEVE.

Предпочтительные молекулы rEVE по настоящему изобретению включают молекулу нуклеиновой кислоты rEVE из 2329 пар оснований (п.о.), которая имеет последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:1 и молекулу нуклеиновой кислоты rEVE из 2422 п.о., которая имеет последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:2.

3' концевая область последовательности SEQ ID NO:2 содержит последовательности, которые являются основными для rEVE-опосредованного усиления экспрессии белка. Такие предпочтительные последовательности 3' концевой области последовательности SEQ ID NO:2 включают последовательность оснований 462-2422 последовательности SEQ ID NO:2 и последовательность оснований 1087-2422 последовательности SEQ ID NO:2.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты rEVE, содержащая одну или несколько последовательностей нуклеотидных оснований, описанных в настоящей заявке, может иметь любое разнообразие форм, в том числе, без ограничения, линейной молекулы нуклеиновой кислоты, плазмиды, эукариотической вирусной молекулы, прокариотической вирусной (бактериофагальной) молекулы, искусственной хромосомы и рекомбинантной хромосомы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему по меньшей мере один rEVE, описанный в настоящей заявке. Такой rEVE-содержащий вектор экспрессии обеспечивает увеличенные (повышенные) уровни экспрессии в подходящей клетке-хозяине по меньшей мере одного рекомбинантного белка, кодируемого в векторе экспрессии, по сравнению с уровнем экспрессии в клетке-хозяине, несущей тот же вектор экспрессии, лишенный rEVE. Векторы экспрессии, применяемые в настоящем изобретении, включают любую векторную молекулу нуклеиновой кислоты, которая может быть создана для кодирования и экспрессии одного или нескольких рекомбинантных белков в подходящей (гомологичной) клетке-хозяине. Такие векторы экспрессии включают, без ограничения, эукариотические плазмидные векторы, эукариотические вирусные векторы, прокариотические плазмиды, бактериофагальные векторы, шаттл-векторы (например, вектор, который может реплицироваться в эукариотических и прокариотических клетках), мини-хромосомы и различные искусственные хромосомы. Предпочтительно, вектор экспрессии представляет собой плазмидный вектор экспрессии, более предпочтительно, плазмидный вектор экспрессии, который стабильно интегрируется в геном эукариотической клетки-хозяина, и еще более предпочтительно, плазмидный вектор экспрессии, который стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которая содержит вектор экспрессии, содержащий rEVE, описанный в настоящей заявке, и рекомбинантный ген, который направляет экспрессию по меньшей мере одного рекомбинантного белка в клетке-хозяине. Клеткой-хозяином может быть эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева для применения в настоящем изобретении включают, без ограничения, клетки-хозяева млекопитающих, клетки-хозяева растений, клетки-хозяева грибов, клетки-хозяева эукариотических водорослей, клетки-хозяева простейших, клетки-хозяева насекомых и клетки-хозяева рыб. Более предпочтительно, клетка-хозяин, используемая в настоящем описании, представляет собой клетку-хозяина млекопитающего, в том числе, но без ограничения, ооцит китайского хомяка (CHO), клетку COS, клетку Vero, клетку SP2/0, клетку миеломы NS/0, клетку зародышевой почки человека (HEK 293), клетку почки детеныша хомяка (BHK), клетку HeLa, B-клетку человека, клетку CV-1/EBNA, клетку L, клетку 3T3, клетку HEPG2, клетку PerC6 и клетку MDCK. Особенно предпочтительной является клетка CHO, которую можно обрабатывать в соответствии со стандартным протоколом обработки метотрексатом для амплификации числа копий рекомбинантных генов в векторе экспрессии, вставленном в клетку-хозяин. Клетки грибов, которые могут служить в качестве клеток-хозяев в настоящем изобретении, включают, без ограничения, клетки аскомицитов, таких как Aspergillus, Neurospora, и клетки дрожжей, в частности, дрожжей рода, выбранного из группы, состоящей из Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia и Candida. Предпочтительные виды дрожжей, которые могут служить в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Прокариотические клетки-хозяева, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных белков в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничения, Escherichia coli, серовары Salmonella enterica, Shigella species, Wollinella succinogenes, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Edwardsiella tarda, Citrobacter freundii, Pasteurella species, Haemophilus species, Pseudomonas species, Bacillus species, Staphyloccocus species и Streptococcus species. Другие клетки, которые могут быть использованы в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков по настоящему изобретению, включают клетки простейших, например, трипаносомный хозяин Leishmania tarentolae, и клетки нематоды Caenorhaditis elegans.

Полинуклеотиды rEVE, описанные в настоящей заявке, векторы, содержащие один или несколько rEVE, описанных в настоящей заявке, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы, содержащие один или несколько rEVE, описанных в настоящей заявке, могут быть использованы в целом ряде способов, относящихся к экспрессии рекомбинантных белков, представляющих интерес.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии рекомбинантного белка, представляющего интерес, в клетке-хозяине, предусматривающему стадию вставки в клетку-хозяина рекомбинантного вектора экспрессии, который содержит rEVE, описанный в настоящей заявке, и рекомбинантный ген, который кодирует и направляет синтез рекомбинантного белка, представляющего интерес, в клетке-хозяине, и культивирование клетки-хозяина в условиях, способствующих экспрессии рекомбинантного белка.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу получения метотрексат-резистентных клеток-хозяев, которые стабильно (в отличие от транзиторной) экспрессируют рекомбинантный белок на повышенном уровне в отсутствие метотрексата («MTX»), т.е. в отсутствие селективного давления для повышенной экспрессии рекомбинантного белка, обеспечиваемой присутствием метотрексата. Такой способ включает стадию вставки в клетки-хозяева вектора экспрессии, который содержит рекомбинантный ген, кодирующий интересующий рекомбинантный белок, rEVE, описанный в настоящей заявке, и ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу («DHFR»); выращивания клеток-хозяев в присутствии метотрекстата для отбора клеток-хозяев, резистентных к метотрексату, которые экспрессируют интересующий рекомбинантный белок; и выделения резистентных к метотрексату клеток-хозяев, где резистентные к метотрексату клетки-хозяева экспрессируют интересующий рекомбинантный белок на уровне, который выше уровня чувствительных к метотрексату клеток-хозяев, и где резистентные к метотрексату клетки-хозяева стабильно экспрессируют повышенный уровень интересующего рекомбинантного белка при выращивании в присутствии или отсутствие метотрексата. В особенно предпочтительном варианте осуществления, rEVE, используемый в этот способе, содержит последовательность SEQ ID NO:2 или его часть, усиливающую экспрессию, при нахождении в том же векторе экспрессии, что и ген, кодирующий интересующий рекомбинантный белок, повышает уровень экспрессии рекомбинантного белка в клетке-хозяине.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции клеток-хозяев с повышенной или улучшенной адаптацией к присутствию метотрексата в способе DHFR-метотрексат для усиления экспрессии рекомбинантного белка, предусматривающему стадию вставки в клетки-хозяева вектора экспрессии, содержащего ген, кодирующий интересующий рекомбинантный белок, rEVE, описанный в настоящей заявке, и ген DHFR, где популяция клеток-хозяев, содержащих вектор экспрессии, лучше адаптируется, т.е. имеет более высокую выживаемость и/или более высокую скорость роста, в присутствии метотрексата, по сравнению с популяцией клеток-хозяев, несущих вектор экспрессии, лишенный последовательности rEVE.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу усиления амплификации (повышения) экспрессии рекомбинантного белка в клетках-хозяевах, полученных с помощью способа DHFR-метотрексат, предусматривающему стадию вставки в клетки-хозяева вектора экспрессии, содержащего рекомбинантный ген, кодирующий интересующий рекомбинантный белок, rEVE, описанный в настоящей заявке, и ген DHFR; выращивания клеток-хозяев в присутствии метотрексата для отбора метотрексат-резистентной клетки-хозяина, которая экспрессирует интересующий рекомбинантный белок; и выделения метотрексат-резистентной клетки-хозяина, где выделенная метотрексат-резистентная клетка-хозяин экспрессирует интересующий рекомбинантный белок в присутствии метотрексата на уровне, который выше уровня метотрексат-резистентной клетки-хозяина, содержащей тот же вектор экспрессии, лишенный rEVE.

Метотрексат можно удобно использовать в способах, описанных в настоящей заявке, в диапазоне от 20 нМ до 500 нМ, хотя более низкие и более высокие концентрации, такие как от 5 нМ до 10 мкМ, также могут быть с успехом использованы в таких способах для отбора на усиленную экспрессию интересующих рекомбинантных белков.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения, в основном подавления или по существу заглушения экспрессии рекомбинантного белка из вектора экспрессии. В таких способах используют векторы экспрессии, которые содержат один или несколько фрагментов rEVE, которые обеспечивают более низкие уровни экспрессии конкретного рекомбинантного генного продукта, чем обеспечивается использованием rEVE, содержащего последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Такие фрагменты имеют особый усеченный вариант SEQ ID NO:2, включающий последовательность нуклеотидных оснований 1-1086 последовательности SEQ ID NO:2 или основания 1-461 последовательности SEQ ID NO:2. Молекула нуклеиновой кислоты, имеющая усеченную последовательность ARM2, состоящую из оснований 1-461 последовательности SEQ ID NO:2, особенно подходит для подавления или в основном заглушения экспрессии рекомбинантного белка из векторной молекулы в клетке-хозяине. Эти сведения также указывают на то, что последовательность нуклеотидных оснований 462-2422 последовательности SEQ ID NO:2 и последовательность нуклеотидных оснований 1087-2422 последовательности SEQ ID NO:2 являются наиболее предпочтительными для максимального rEVE-опосредованного повышения экспрессии рекомбинантных белков.

Рекомбинатный белок, экспрессия которого может быть усилена одной или несколькими молекулами rEVE, описанными в настоящей заявке, может представлять собой любой белок (в том числе пептиды, полипептиды и олигомерные белки), для которого функциональный ген(ы) может быть встроен методами генной инженерии в векторную молекулу нуклеиновой кислоты для экспрессии в подходящей клетке-хозяине. Такие белки включают, без ограничения, растворимые белки, мембранные белки, структурные белки (т.е. белки, которые обеспечивают клеткам, тканям или органам структуру или опору), рибосомные белки, ферменты, зимогены, молекулы антител, рецепторные белки клеточной поверхности, регуляторные белки транскрипции, регуляторные белки трансляции, белки хроматина (например, гистоны), гормоны, регуляторные белки клеточного цикла, G белки, нейроактивные пептиды, иммунорегуляторные белки (например, интерлейкины, цитокины), белки компоненты крови, белки ионных каналов, белки теплового шока, дигидрофолатредуктаза, белок устойчивости к антибиотикам, их функциональные фрагменты, их эпитоп-содержащие фрагменты и их сочетания.

Молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность rEVE, описанного в настоящей заявке, или ее часть, также могут быть использованы в качестве зондов нуклеиновой кислоты для идентификации наличия последовательностей rEVE в других молекулах нуклеиновой кислоты посредством гибридизации нуклеиновых кислот, или в качестве источники праймеров для использования в различных методиках полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, как могут быть использованы для манипуляций, идентификации, получения или амплификации описанных в настоящей заявке последовательностей rEVE.

Последовательности rEVE, например, описанные для ARM1 (SEQ ID NO:1) и для ARM2 (SEQ ID NO:2), могут содержать одну или несколько последовательностей участка присоединения матрикса (MAR). Последовательности MAR могут встречаться в кластерах в пределах последовательности rEVE, в том числе в кластерах в 5' и/или 3' концевых областях последовательности rEVE. Полинуклеотиды rEVE, описанные в настоящей заявке, являются подходящим источником последовательностей MAR. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к композициям и способам, которые подходят для увеличения последовательностей MAR в молекуле нуклеиновой кислоты, включающим вставку в молекулу нуклеиновой кислоты rEVE, описанного в настоящей заявке или части rEVE, описанного в настоящей заявке, содержащего одну или несколько последовательностей MAR.

Последовательности нуклеотидных оснований, описанные в настоящей заявке, также служат для обеспечения комплементарности их последовательностей. Молекулы ДНК и последовательности нуклеотидных оснований, описанные в настоящей заявке, также предоставляют соответствующие молекулы РНК и последовательности оснований, в которых тимин (T) заменен на урацил (U), и последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные им.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205, используемого для экспрессии тяжелой и каппа легкой цепей иммуноглобулина, которые образуют активную молекулу IgG1 человека против TNF-α («адалимумаб») в стабильных трансфектантах ооцитов китайского хомяка (CHO). Сокращения: «ЭНХАНСЕР» относится к промежуточному раннему энхансеру гена цитомегаловируса (CMV); «АДЕНОПРОМОТОР» относится к главному позднему промотору аденовируса; «ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ АДАЛИМУМАБА» относится к кодирующей области тяжелой цепи IgG1 адалимумаба; «SV40 Поли A» относится к сайту полиаденилирования обезьяньего вируса 40; «ТЕРМИНАТОР ГАСТРИНА» относится к сигналу терминации транскрипции гена гастрина человека; «ПРОМОТОР SV40» представляет собой промотор обезьяньего вируса 40; «DHFR» относится к мышиному гену дигидрофолатредуктазы; «TK Поли A» относится к сайту полиаденилирования гена тимидинкиназы вируса простого герпеса; «ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ АДАЛИМУМАБА» относится к кодирующей области каппа легкой цепи адалимумаба; «ORI» относится к плазмидной ColE1 прокариотической точке начала репликации, которая функционирует в Escherichia coli; «P(BLA)» относится к прокариотическому промотору гена β-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) и маленькие стрелки указывают направление транскрипции; «APr» («резистентность к ампициллину») относится к кодирующей области β-лактамазы. Стрелки указыват направление транскрипции (от 5' к 3').

На фиг.2 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205Genomic, в котором нуклеиновая кислота ARM1 («A1»), которая имеет последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:1, вставлена в вектор экспрессии pA205 (фиг.1) выше основного позднего аденовирусного промотора и области, кодирующей тяжелую цепь IgG1 адалимумаба, и нуклеиновая кислота ARM2 («A2»), которая имеет последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:2 вставлена ниже области, кодирующей каппа легкую цепь адалимумаба. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.3 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205A1, в котором нуклеиновая кислота ARM1 («A1»), имеющая последовательность SEQ ID NO:1, вставлена в вектор экспрессии pA205 (фиг.1) выше аденопромотора и области, кодирующей тяжелую цепь IgG1 адалимумаба. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.4 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205A2, в котором нуклеиновая кислота ARM2 («A2»), имеющая последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:2, вставлена ниже области, кодирующей каппа легкую цепь адалимумаба. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.5 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pCHOEL246GGhum, используемого для экспрессии тяжелой и каппа легкой цепи иммуноглобулина, которые образуют активную молекулу IgG1 против EL-селектина в стабильных трансфектантах ооцитов китайского хомяка (CHO). «ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ ПРОТИВ EL-СЕЛЕКТИНА» относится к области, кодирующей тяжелую цепь IgG1 антитела человека против EL-селектина; «ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ ПРОТИВ EL-СЕЛЕКТИНА» относится к области, кодирующей каппа легкую цепь IgG1 антитела человека против EL-селектина. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.6 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA-Gen-EL-Selectin, в котором нуклеиновая кислота ARM1 («A1»), имеющая последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:1, вставлена в вектор экспрессии pCHOEL246GGhum (фиг.5) выше области, кодирующей тяжелую цепь IgG1 против EL-селектина, и нуклеиновая кислота ARM2 («A2»), имеющая последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:2, вставлена ниже области, кодирующей каппа легкую цепь против EL-селектина. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.7 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205-eGFP, используемого для экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP) в стабильных трансфектантах клеток CHO. Область, кодирующая eGFP («EGFP»), вставлена ниже основного позднего аденовирусного промотора («АДЕНОПРОМОТОР») в pA205 (фиг.1), из которого область, кодирующая легкую цепь, проксимальный промотор, и проксимальный энхансер, и область, кодирующая тяжелую цепь, были удалены. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.8 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205G-eGFP, в котором нуклеиновая кислота ARM1 («A1»), имеющая последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:1 вставлена в вектор экспрессии pA205-eGFP (фиг.7) выше области, кодирующей eGFP («EGFP»), и нуклеиновая кислота ARM2 («A2»), имеющая последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO:2, вставлена ниже последовательности, кодирующей eGFP. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.9 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205A2-Spe-trunc, который по существу идентичен вектору экспрессии, pA205A2, изображенному на фиг.4, за исключением того, что ARM2 (SEQ ID NO:2) была заменена усеченным вариантом ARM2, «A2 (п.о. 1-1086)», который имеет последовательнось нуклеотидных оснований 1-1086 SEQ ID NO:2 как результат расщепления нуклеиновой кислоты ARM2 эндонуклеазой рестрикции SpeI. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

На фиг.10 представлена схематическая диаграмма плазмидного вектора экспрессии pA205A2-Swa-trunc, который по существу идентичен вектору экспрессии pA205A2, изображенному на фиг.4, за исключением того, что ARM2 (SEQ ID NO:2) была заменена усеченным вариантом ARM2, «A2 (п.о. 1-461)», который имеет последовательность нуклеотидных оснований 1-461 последовательности SEQ ID NO:2 как результат расщепления нуклеиновой кислоты ARM2 эндонуклеазой рестрикции SwaI. Для других сокращений смотрите описание фиг.1, приведенное выше.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того, что одна или несколько выделенных молекул нуклеиновой кислоты (полинуклеотидных молекул), содержащих нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1:

aattgaattcgttccctttagtgagggttaattccgcggccgcgtcgacagctctagagggagtgccaggataggctccaaagctacacagagaatccctgtttcaaaaaaccaaaaaaaaaaaaataaaaaataaaaaataaaaagtagggtacagatctaaatagacaattctcaatagaggaatctaaaatgcctgaaagacaaataagaaagtgttcaacatccttagccatcagggaaatgcaaatcaaaacaactctgagatactatcttactcctgtcataatggccaaattcaaaaacactaatgacagttcatgttggagagaatgtggagaaagaggagcacttctccactgctggtgggagtgccaacttggacagccactttggaaatcagtatggctactcctcaagaaaatggaaatcagtttaccacaagatccagcaattccactcaggcatatacccaaaagaaccgcattcatacaagcaatatctgttcaacgatgttcatagcagctctatttgtaacagccagaaactggaagcagcctagttgcacctcaaccaaagaaatggatagagaaaatatggtacatttatgcaatggagtactactcagcggaaaagtacaatggaatcttgaaatttgcaagaaaatggatggaactagaagaaacctttctgagcaaggtaactcaatcacaaaaagacaaacatgatatgtaatcactcatatgtggattttagacacagtgtaaaggattaccagcctacaatccacactgccaaagaacctaataaacaaggaggaccctaagggagacatacatggtcccctggagatggggaatgggtcaagatatgctgagcaaagtgggaacatgggaagaggggggaaggagctaggaaattgagaaagggagaaaaggagggatgcagaggacataagggagcagaaacattgactcagggaatgaatcgaagataacaagccatggagatatcataatagagggagacattttgggtatacagagaaatcaggcacttgggaaatgtctggaaatctacaaagtataacaccaggtaacaatctaagcaacagaggagaggctaccttaaatgtcctaccctgatagtgagattgatgactaacttatatgccatgttatagccttcatccagcagctggtggaagtagaagcagacacccataactaatcacggaactgaactggaacccagattcagagaaggatgagtgaagggcacagaggtccagaccaggctggtgaaacccacaaaaacagttgaactgaatatcggtgaactcttgctccccagactgatagctggaataccagcatgggactgatccagactccaggaacatgagttcctgtgaggaaacctcggaaatctaagggacctcctgtagaagttcagtacttatccctagcataggtgtggactgagggagcccattccatatagaggaatactctctggagccaacacacatgggggtgggcataggccctttcccaaagcatacaatagactcggatgacaccctatggaaggcctcatcatccagggggagcagaaaggatatgtgatagacagggtttcagttgggagccgggtagtgggaggggagaattggtggaagaaggaaaccgggattgtcatgtaaatcaatgctgtttctaattcaaataagaaagttgaaaaaaaagaaaactgatacttattgcaccatgtaatgttatgaaatggcatttgctgttaagatgagcagtctatctgctaatctccctagctggcttgtgaacttgttatatggacaaagctggtctcaaattcaaagatatttgcgtatgtctgtctcctgagtgttgagagtacaagtatgtaccaccaatccctttgattatacaattacatttgaaaacagtttgagatttaattataactatgcaatcaattcaaaataataaatttaaatctcatatttgtctttaggtggaaatctgttaatatacatcatgattatatattttaatttattatatgttttctaggacaaaatatactaaaatgaaatctaaggctctaaacatacaaaactgtatgcatagatacatcacgatcatataatttccatgacatgctattcgggaatataatgatctacctgcagtaatgattaatttggaaatgctgaatacaactgcttctcttttgaaaatacaaattccttacatttgtaatctatttaattttaaaggttgtaccccagaaagtagtgaattcttaa

или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2:

aagaatatgctcaatgtaatacccatggcaggcattcaatgtttgtctgtcttcatattgaagataaacagatgtatatcatatacaaaaatatttaatgtgaagttgtccatgtgttcaggatctatatactttcaaaaatctttttccatattcttttcttaatcctcctgaagtgtagaccattatactggaaaaccgtcactattgtacaggataggagcctttgactctgagaggatcccatacattgattgtattttcaaatatattttggctgcttttctccatgtgatatttggcaatctggagaggcatttgctcctggaaatttatcaatgttgacaatgttgtttacatgttttaagtaactattttgctaccaaggaaactgcttcactccctttcacatataaaactcataaaatattgaaaggctccaataagtttaaatcattctgtattgctcatggagatttaaatttcagtgctaattttttattagcactttaatttagaaggcaccaggtttctacaagatttaaaattattggagcatttcaaaattttataagctttccagtaaggttgtggctatgattctttgcttgtaaagtaaagtgcaatttaaagttaatttaaataatttaactgctgcagacattttaggagaattgtttgtatttcaaactgaaattcagggtagacaattagaataattttacaaagaggaaatatttttctaataataaattagtaactctaacttatattaaaatttaagtcctcattgctttcaatattttaacaaccctattgtattatttttcttataaatatttgaatttataatgatcaaagaatttctttgatacaagtgtctaaatgattaccatcaaactgttggtaggagcttgttatatatgtgttttaccttatgttttttgatacttcatttgttactgtactgtgatcgagttaattccctactgaaactaaaaatgctatcacatagttttagcatcatctgttggggaaatggctattttaactactctgagatgagaaattcaacaccattcactaacaatatagggaaactagtgttggtagattgttgagtgcttatacatatatcttgtcccatggttaactataagttggtgtctgttgctgccacccagtatggaaacacattatgttttttctttttttttttttatagccatgagaaagaccaaaattctatacttgaaaaaccgtttatattgaatgtgtattcctttcacgtccaccttagattcaactcctaagtcaatttatggtaaagcatagatcatctgcttgacaacagtttggatgatgatcttggaaaaaatgccttattatatgatacaatggaattaatgatatgagctgaataaatatatcaatattcaaatgacatactaatatttatgtctaagagaatgtgttcaaagtagatgaaagtgccttcacttgaaaattcatctgagttaaaacagatagttgcttcggttttagttatttcagaggtattcaagttgacaactaagaatagccgtcacagatacatatcaattatggacccaaattctattgaatgtcagctacatattcttatagaaaataggaacctagatgaggccgtgttcttggaatgaattttcaacacattgtatgagggttttattgtggttttggttgttgttttactttcctttttttccatagacaaatttgtcccatgtacccacaaggtgaccagtggtgacaagcctactccaggagtcctggtgaataaagattatacaagatagtagagactcatcaaaacaataagaaaaagagaatacatagggcagaaatttctcattttctcagctatggtatcctatttcactcttgtactattctactcactagaagtcagtgactaccataactcagtggctgtgccctagatcaaaggaaacattatttcaaggcatgaatgtcagccacaccttcatagtgggttacttttaatttgtttagtaagaatagacaccctactttggttaggaaacataaacttacaagacattcattggtttttctttactaaattaaatcattaagaaaatcgtaattatcagagtttaaatggcatgaaacatagaaatactcatttgctgccctgatttattttcccaagaatattttcaatgtcttctttggaagctccttggtaaatgcactttctttcactcatttatgaggtctgtgcacatcacagtcaataaaggcctgcagtattgaatcagccatacagacataattcataacatttttctatttctcatgaatcaaatattgttattgctgtacataaaataatgaatcaaagtataggtctaga

может быть вставлена методами генной инженерии в молекулы вектора экспрессии для усиления экспрессии одного или нескольких рекомбинантных белков из одного или нескольких генов, находящихся в молекулах вектора экспрессии.

Выделенная полинуклеотидная молекула, которая содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, в настоящем описании называется элементом рекомбинантного вектора экспрессии (rEVE). REVE по изобретению также включают, но не ограничиваются, полинуклеотидную молекулу, которая содержит усиливающую экспрессию часть последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 («ARM1») или SEQ ID NO:2 («ARM2»). Последовательности из 3' концевой области ARM2 SEQ ID NO:2, такие как последовательности, имеющие последовательность оснований 462-2422 последовательности SEQ ID NO:2 и основания 1087-2422 последовательности SEQ ID NO:2, особенно применимы для обеспечения повышенной экспрессии рекомбинантного белка, представляющего интерес. REVE, описанный в настоящей заявке, может быть использован в сочетании с другими контрольными последовательностями, регуляторами, и процедурами, доступными в настоящее время для повышения продукции рекомбинантных белков в клетках-хозяевах.

Для более точного описания изобретения приведены определения следующих терминов:

Термин «антитело» или «молекула антитела», используемый и понимаемый в настоящем описании, в широком смысле относится к любой молекуле иммуноглобулина (Ig), состоящей из четырех полипептидных цепей, двух тяжелый (H) цепей и двух легких (L) цепей, или любого ее функционального фрагмента, мутанта, варианта или производного, которые сохраняют необходимые эпитоп-связывающие особенности молекулы Ig. Такие мутантные, вариантные или производные антитела известны из уровня техники и включают неограничивающие варианты осуществления, рассмотренные ниже.

В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена (CL). Области VH и VL дополнительно можно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), вперемежку с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулы иммуноглобулина могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), или подкласса.

Термины «антитело» и «молекула антитела» также охватывает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Такие антительные конструкции также могут представлять собой биспецифичные, с двойственной специфичностью, или мультиспецифичные форматы; специфически связывающиеся с двумя или несколькими различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, которые охватывает термин «антитело», включают фрагмент Fab, т.е. моновалентный (один связывающий сайт) фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов; фрагмент F(ab')₂, т.е. бивалентный фрагмент (два связывающих сайта), содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; и фрагмент Fd, состоящий из VH и CH1 доменов; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одиночного плеча антитела; одиночный домен антитела (dAb) (Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Winter et al., публикация PCT WO 90/05144 A1, включена в настоящее описание в качестве ссылки), который содержит одиночный вариабельный домен; двойной вариабельный домен антител (DVD) (смотрите, например, публикацию PCT WO 2007/024715); и выделенные области, определяющие комплементарность (CDR). Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены, с помощью рекомбинантных способов, посредством синтетического линкера, который позволяет получить их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH объединяются в пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv), смотрите, например, Bird et al. Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Такие одноцепочечные антитела охватываются терминами «антитело» и «молекула антитела». Диатела также охватываются терминами «антитело» и «молекула антитела». Диатела представляют собой бивалентные, биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но используя линкер, который является слишком коротким, чтобы была возможность образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи, тем самым заставляя домены образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антиген-связывающих сайта (смотрите, например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Термины «антитело» и «молекула антитела» также охватывает двойной вариабельный домен молекул иммуноглобулинов, например, DVD-IG™ (Abbott Laboratories) двойной вариабельный домен молекул иммуноглобулинов (смотрите, например, публикацию PCT WO 2007/024715).

Используемый в настоящем описании «вектор» относится к любому генетическому элементу, способному служить в качестве носителя генетического переноса, экспрессии или репликации для чужеродного полинуклеотида в клетку-хозяина. Например, вектор может представлять собой искусственную хромосому или плазмиду и может быть способен к стабильной интеграции в геном клетки-хозяина, или он может существовать в виде независимого генного элемента (например, эписомы, плазмиды). Вектор может существовать в виде одиночного полинуклеотида или в виде двух или нескольких отдельных полинуклеотидов. Векторы в клетке-хозяине могут быть однокопийными векторами или мультикопийными векторами. Предпочтительные векторы для использования в настоящем изобретении представляют собой молекулы векторов экспрессии, в которых один или несколько функциональных генов могут быть вставлены в молекулу вектора, в соответствующей ориентации и близости к контрольным элементам экспрессии, находящимся в молекуле вектора экспрессии, таким образом, чтобы направлять экспрессию одного или нескольких белков, когда молекула вектора находится в соответствующей (гомологичной) клетке-хозяине.

Векторы экспрессии могут включать, без ограничения, эукариотические плазмидные векторы, эукариотические вирусные векторы, прокариотические плазмиды, бактериофагальные векторы, шаттл-векторы (например, вектор, который может реплицироваться в эукариотических и прокариотических клетках), мини-хромосомы, и различные искусственные хромосомы (например, бактериальные искусственные хромосомы (BAC), искусственные хромосомы дрожжей (YAC)). Предпочтительно, вектор экспрессии, используемый в настоящем изобретении, представляет собой плазмиду, более предпочтительно, плазмидный вектор экспрессии, который стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина, и, еще более предпочтительно, плазмидный вектор экспрессии, который стабильно экспрессируется в геном клетки-хозяина посредством негомологичной рекомбинации. «Шаттл-вектор» (или бифункциональный вектор) относится к любому вектору, который может реплицироваться в более чем одном типе организмов. Например, шаттл-вектор, который может реплицироваться как в Escherichia coli (E. coli), так и Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) может быть сконструирован путем связывания последовательностей из плазмиды E. coli с последовательностями из дрожжевой плазмиды 2 мкм.

Системы экспрессии включают вектор экспрессии и подходящую (гомологичную) клетку-хозяина, которая будет экспрессировать рекобинантный белок (белки), кодируемый в векторе экспрессии. Система экспрессии может представлять собой систему стабильной экспрессии или систему транзиторной экспрессии. В системе стабильной экспрессии, вектор экспрессии стабильно интегрируется в геном клетки-хозяина или непрерывно реплицируется, и успешно переходя в обе дочерние клетки, таким образом, что клетки-хозяева способны продолжать экспрессировать рекомбинантный белок (белки) при культивировании в соответствующих условиях. В транзиторной системе экспрессии, молекулы вектора экспрессии не остаются в обеих дочерних клетках и со временем утрачиваются или так уменьшаются в растущей клеточной культуре, что экспрессия рекомбинантного белка (белков) из культуры в конечном счете прекратится или будет такой низкой, что будет неприменима в для большинства целей получения. Векторы экспрессии, используемые в примерах, приведенных ниже, представляют собой типы шаттл-векторов, которые могут