Способ обнаружения злокачественных опухолей

Способ обнаружения злокачественных опухолей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественной опухоли путем использования в качестве опухолевого маркера CAPRIN-1.

Предшествующий уровень техники

Злокачественные опухоли являются основной причиной смерти. Лечение, проводимое в настоящее время, представляет собой, главным образом, симптоматическую терапию, которая в основном состоит из хирургического вмешательства в сочетании с лучевой терапией и химиотерапией. Благодаря достижениям медицинской техники, злокачественные опухоли теперь стали практически излечимы при ранней диагностике. Следовательно, в настоящее время необходим способ выявления злокачественной опухоли, который легко осуществляется при использовании сыворотки, мочи или тому подобного, не требующий физических или экономических затрат со стороны пациента, страдающего злокачественной опухолью.

В качестве способа диагностики злокачественной опухоли с использованием крови или мочи в последнее время стал популярным способ измерения продукта опухоли, такого как опухолевый маркер. Термин «продукт опухоли» относится к антигену, связанному с опухолью, ферменту, специфическому белку, метаболиту, опухолевому гену, продукту опухолевого гена, гену-суппрессору опухоли и тому подобному. Карциноэмбриональный антиген CEA, гликопротеин CA19-9, CA125, простатспецифический антиген (PSA), кальцитонин, которые являются пептидными гормонами, продуцируемыми, например, щитовидной железой, и тому подобное, используются в качестве опухолевых маркеров для диагностики некоторых типов злокачественных опухолей. Однако опухолевые маркеры, используемые для диагностики злокачественной опухоли, отсутствуют для многих типов злокачественных опухолей. Также, наиболее известные в настоящее время опухолевые маркеры присутствуют в жидкостях организма только в следовых количествах (приблизительно порядка пг/мл). Следовательно, для обнаружения таких опухолевых маркеров необходимы высокочувствительные способы измерения или специальные методики. При сложившихся обстоятельствах ожидается, что новые способы диагностики злокачественных опухолей, способные обнаруживать различные типы злокачественных опухолей с высокой чувствительностью, станут удобными методами для диагностического использования в отношении различных типов злокачественных опухолей.

Также, такие способы диагностики очень могут быть крайне эффективны, если с их помощью можно обнаруживать не только злокачественные опухоли, но и диагностировать злокачественные опухоли в невидимых глазом местах, степень распространения злокачественной опухоли, злокачественность или послеоперационное течение злокачественного заболевания, рецидив, метастазирование и тому подобное.

В особенности, если диагностика злокачественной опухоли в невидимом глазом месте станет возможной, то такие способы диагностики злокачественной опухоли могут использоваться для раннего обнаружения злокачественной опухоли, например, во внутрибрюшинной части, которую трудно распознать. Также, можно будет обнаружить опухоль, которая не имеет макроскопически видимого размера, например злокачественную опухоль, которая не обнаруживается даже с помощью ультразвукового исследования, КТ (компьютерной томографии) или ЯМР (магнитно-резонансной визуализации).

Кроме того, степень распространения злокачественной опухоли классифицируется исходя из степени, до которой распространяется опухоль в первичном очаге, и наличия или отсутствия метастаз в региональные лимфоузлы или отдаленные органы. В основном, существует 5 стадий заболевания (каждая называется здесь «стадией») и чем больше номер стадии, тем сильнее прогрессировало заболевание. Строго говоря, стадия зависит от органов. Однако, например, злокачественная опухоль в 0 стадии представляет собой злокачественную опухоль, которая остается внутриэпителиальной, а злокачественная опухоль IV стадии представляет собой злокачественную опухоль, которая метастазировала в отдаленную локализацию. Если определена степень злокачественного заболевания, становится возможным принятие решения о соответствующих курсах лечения, а также об оценке терапевтических эффектов противоопухолевого средства. В качестве примеров принятия решения о ходе лечения в случае рака предстательной железы и тому подобного существуют виды, не требующие лечения, поскольку их злокачественность крайне низкая и почти никогда такие виды опухоли не будут прогрессировать. Напротив, существуют виды, требующие лечения, поскольку являются прогрессирующими, и метастазируют в кость или другие органы, и являются причиной мучительной смерти пациента. Все способы лечения, такие как гормональная терапия и радикальное хирургическое вмешательство, связаны с побочными реакциями. Таким образом, следует правильно определить и выбрать способы лечения. Также, если оценка, касающаяся выбора противоопухолевого средства, может быть правильно выполнена или если время или так далее об окончании введения противоопухолевого средства может быть корректно определено, то физические и экономические затраты пациентов также могут быть уменьшены. Следовательно, важно иметь возможность диагностировать степень распространения злокачественного заболевания.

Одним из характерных признаков злокачественных клеток является продолжение их бластогенеза; то есть отсутствие способности дифференцироваться. Кроме некоторых типов злокачественных опухолей, слабо дифференцированные или недифференцированные злокачественные клетки с низкой степенью дифференцировки быстро растут после метастазирования, что является плохим прогнозом для лечения. Говорят, что такие злокачественные опухоли имеют высокую злокачественность. Наоборот, высоко дифференцированные злокачественные клетки с высокой степенью дифференцировки сохраняют структурные и функциональные характеристики неповрежденных органов. Говорят, что такая злокачественная опухоль имеет относительно низкую злокачественность. Если можно определить злокачественность опухоли, то могут быть сделаны ее последующие измерения. Даже если опухоль небольшая, то широкий хирургический захват может обеспечить безопасность при удалении опухоли в тех случаях, если злокачественность опухоли высокая. Более того, последующие мероприятия могут быть сосредоточены на широком диапазоне периферических тканей.

Если можно оценить течение послеоперационного периода, в том числе рецидивирование и метастазирование, то можно оценить полноту удаления опухоли при хирургическом вмешательстве. Неполное удаление опухоли, вероятно, приведет к рецидиву. Следовательно, такая оценка может обеспечить критерий определения для более точного выполнения последующих мероприятий с короткими интервалами или для немедленного проведения повторной операции при необходимости. Также, в случае возникновения рецидива будет существовать большая вероятность раннего обнаружения. Если имеют место отдаленные метастазы, то их обнаружение зачастую отсрочено. Однако если можно диагностировать метастаз, то можно получить критерий, с помощью которого ряд исследований может быть расширен, включающий области, отличные от места удаления и его наружной границы.

Известно, что собаки стареют в 7 раз быстрее людей. В последнее время животные-компаньоны воспитываются и содержатся как члены семьи и зачастую ведут образ жизни и имеют привычки, сходные с образом жизни и привычками хозяев. Следовательно, предсказуем высокий риск развития злокачественного заболевания у хозяина, если у его животного-компаньона развивается злокачественная опухоль. Если правильная и точная диагностика злокачественного заболевания станет возможной для животного-компаньона, то можно ожидать, что она станет диагностическим критерием для профилактики развития злокачественных опухолей у хозяев.

В настоящее время говорят, что число домашних собак в Японии составляет примерно 6700000 и такая же цифра для США составляет примерно 17640000. Все большее распространение получают пятикратные, семикратные и восьмикратные комбинированные вакцины и тому подобное, кроме прививок от бешенства, и за счет этого уменьшается количество инфекционных заболеваний с высоким процентом летальности, такие как парвовирусная инфекция у собак, инфицирование вирусом чумы собак, парагрипп собак (кашель псарен), инфицирование собак аденовирусом-2 (кашель псарен), инфекционный гепатит собак, коронавирусная инфекция у собак и лептоспироз. Таким образом, увеличивается средняя продолжительность жизни собак. Немолодые собаки, которым семь лет или больше, составляют 35,5% всех домашних собак. Возрастают причины смерти домашних собак, сходные с таковыми у людей, такие как злокачественные заболевания, гипертензия и заболевания сердца. В США примерно у 4000000 миллионов собак ежегодно диагностируют злокачественные опухоли. Также в Японии говорят, что примерно 1600000 собак потенциально поражены опухолями.

Однако подходящие средства диагностики злокачественных опухолей у животных отсутствовали. Более того, при медицинском наблюдении за животными способы диагностики, которые включают фотосъемку или рентгенографию с использованием рентгеновских лучей, КТ сканирование, ЯМР сканирование или тому подобное, не были широко распространены. После проведения пальпации, общего анализа крови и диагностики с использованием рентгенофотографии диагноз в настоящее время зависит в значительной мере от опыта ветеринаров. Частично начали проводить способы диагностики с использованием сыворотки, но в этих способах используют опухолевые маркеры человека, поскольку не обнаружено опухолевых маркеров собак.

Для точной диагностики злокачественной опухоли требуется абдоминальная хирургия, которая связана со значительной физической нагрузкой для собаки и экономическими затратами для владельцев. Если диагностику злокачественной опухоли можно было бы провести животному-компаньону, такому как собаки и кошки, то это привело бы к ранней или точной диагностике злокачественной опухоли, и можно было бы предположить, что эти данные могли бы быть полезны для лечения злокачественных опухолей у животных компаньонов. Также, если такая удобная диагностика злокачественной опухоли с использованием сыворотки станет возможной, то можно ожидать, что она не только обеспечит диагностику злокачественной опухоли, но также внесет значительный вклад в регулярное медицинское обследование, предоперационную диагностику и принятие решения о стратегии лечения.

Медицинский осмотр для животных-компаньонов в отличие от ситуации с людьми широко не распространен. Следовательно, выявление злокачественной опухоли часто происходит слишком поздно, когда хозяин узнает о заболевании и приводит животное-компаньона в клинику, как правило, только после того, как опухоль стала большого размера. Если такая опухоль, которая увеличилась в размере, является злокачественной, зачастую это приводит к тому, что проведение лечения оказывается невозможным, даже если проводят хирургическое вмешательство, например операцию, или медикаментозное лечение с использованием противоопухолевого средства или тому подобное. Следовательно, в тех случаях, когда ветеринар определяет, что опухоль является злокачественной, лечение противоопухолевым средством, как правило, проводят без операции. Если операцию все-таки выполняют, то во время операции также следует учесть такие меры, как определение размера безопасного края, определение количества крови, необходимого во время операции, и меры против распространения клеток по организму. Желательно, чтобы лечение противоопухолевым средством назначалось сразу же после операции и чтобы последующее врачебное наблюдение проводилось с короткими интервалами. Ожидается, что включение вышеуказанной диагностики злокачественных опухолей в медицинское обследование собак, которые в последнее время все больше и больше распространены и называются полным медицинским обследованием собак, приведет к раннему выявлению злокачественных опухолей.

С другой стороны, в случае доброкачественной опухоли операция может быть рекомендована, даже если опухоль большого размера. После операции в уходе нуждаются только иссеченные области, без необходимости какого-либо дорогостоящего лечения с использованием противоопухолевых средств и без каких-либо опасений, относящихся к последующим врачебным наблюдениям.

В сложившейся ситуации разработка удобных способов обнаружения злокачественных опухолей с высокой чувствительностью, которые можно использовать для диагностики злокачественных опухолей у животных, обеспечивает точное и эффективное лечение и влечет за собой ряд преимуществ как для владельцев, так и для ветеринаров.

Белок 1, связанный с цитоплазмой и пролиферацией, (CAPRIN-1) представляет собой внутриклеточный белок, который экспрессируется, когда нормальные клетки фазы покоя активируются или подвергаются делению. Также известно, что CAPRIN-1 участвует в транспорте мРНК посредством внутриклеточного образования внутриклеточных стрессовых зерен с РНК и трансляционного контроля, например. При этом CAPRIN-1 имеет много различных названий. Примеры таких названий включают GPI-заякоренный мембранный белок 1 и белок 1 мембранного компонента поверхностного маркера (M11S1), как будто белок является мембранным белком. Эти различные названия происходят на основании данных (J Biol. Chem. 270:20717-20723 (1995)), что генная последовательность CAPRIN-1 исходно имеет GPI-связывающую область и CAPRIN-1 является мембранным белком, экспрессируемым в клеточных линиях, полученных из толстой кишки. Позже стало известно, что последовательность гена CAPRIN-1 в этом документе неверная; имеет место сдвиг рамки считывания за счет делеции 1 нуклеотида последовательности гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированного в GenBank или другом депозитарии, так что 80 аминокислот делетировано с С-конца и полученный в результате артефакт (74 аминокислоты) соответствует GPI-связывающей части предыдущего сообщения; и ошибка также сделана на 5' конце последовательности гена, и делеция 53 аминокислот с N-конца была доказана (J Immunol. 172:2389-2400 (2004)). Также сообщалось, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированного в GenBank или другом депозитарии, не является мембранным белком (J Immunol. 172:2389-2400 (2004)).

Кроме того, на основании сообщения J Biol. Chem. 270:20717-20723 (1995), что CAPRIN-1 представляет собой белок клеточной мембраны, в US2008/0075722 и WO2005/100998 описано, что CAPRIN-1, называемый M11S1, может быть мишенью для лечения злокачественных опухолей в качестве белка клеточной мембраны (не указано в «Примерах»). Однако, как сообщалось в J Immunol. 172:2389-2400 (2004), на дату подачи US2008/0075722 и WO2005/100998 вплоть до настоящего времени было известно, что CAPRIN-1 не экспрессируется на клеточных поверхностях. Очевидно, что содержание US2008/0075722 и WO2005/100998, основанное только на ошибочной информации о том, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, не следует учитывать как документы уровня техники в данной области. Более того, никогда не сообщалось о том, что CAPRIN-1 экспрессируется на более высоких уровнях в клетках при раке груди или подобном, чем в нормальных клетках.

Краткое изложение сущности изобретения

Проблема, решаемая настоящим изобретением

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественных опухолей, который подходит для диагностики злокачественных опухолей.

Способы решения этой проблемы

В результате глубокого изучения авторы настоящего изобретения получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, находящимся в сыворотке, полученной из живого организма, имеющего опухоль, с помощью способа SEREX, используя библиотеку кДНК, полученную из семенников собак и сыворотку собак, имеющих опухоль, и таким способом были получены белки CAPRIN-1 собак, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в последовательностях SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14 на основе кДНК. Также, авторы настоящего изобретения получили белки CAPRIN-1 человека, имеющие аминокислотные последовательности, показанные в последовательностях SEQ ID NO:2 и 4 на основании генов человека, гомологичных полученным генам. Авторы настоящего изобретения дополнительно обнаружили, что гены, кодирующие эти белки, специфически экспрессируются в семенниках собак и людей и злокачественных опухолевых клетках (см. пример 1, описанный позже); рекомбинантные полипептиды, полученные на основании аминокислотных последовательностей этих белков, специфически реагируют только с сыворотками из живых организмов, имеющих злокачественную опухоль; и CAPRIN-1 может быть специфически выявлен из живого организма, имеющего злокачественную опухоль, используя антитела, полученные с использованием рекомбинантных полипептидов. Таким образом, авторы настоящего изобретения создали это изобретение.

В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения злокачественной опухоли, предусматривающем измерение экспрессии CAPRIN-1, которое проводится для образцов, выделенных из живых организмов. Также настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему антитело, которое индуцируется in vivo против CAPRIN-1, и полипептид, который подвергается реакции антиген-антитело. Более того, настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему антитело, которое подвергается реакции антиген-антитело с CAPRIN-1 или его антигенсвязывающий фрагмент. Более того, настоящее изобретение относится к агенту для обнаружения злокачественной опухоли, содержащему полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, или подобных в списке последовательностей.

В частности, настоящее изобретение характеризуется следующими признаками.

(1) Способ обнаружения злокачественной опухоли, предусматривающий измерение экспрессии полипептида, обладающего способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей, в образце, выделенном из живого организма.

(2) Способ по пункту (1), приведенному выше, где измеряемым полипептидом является белок CAPRIN-1, имеющий любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 (т.е. SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,...,30) или полипептид, последовательность которого на 85% или более идентична белку CAPRIN-1.

(3) Способ по пункту (1) или (2), приведенному выше, где живым организмом является человек, собака или кошка.

(4) Способ по пункту (3), приведенному выше, где живым организмом является собака, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность с четными номерами SEQ ID NO:2-30.

(5) Способ по пункту (4), приведенному выше, где живым организмом является собака, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14.

(6) Способ по пункту (3), приведенному выше, где живым организмом является человек, а определяемый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или 4.

(7) Способ по любому из пунктов (1)-(6), приведенному выше, в котором экспрессию полипептида измеряют с помощью иммуноанализа антитела, которое может содержаться в образце, и индуцируется in vivo против определяемого полипептида.

(8) Способ по любому из пунктов (1)-(7), приведенных выше, где образцом является сыворотка, плазма крови, асцитическая жидкость или плевральный выпот.

(9) Способ по любому из пунктов (1)-(6), приведенных выше, в котором экспрессию полипептида измеряют путем определения мРНК, кодирующей полипептид, который содержится в этом образце.

(10) Способ по пункту (9), приведенному выше, предусматривающий исследование существующего количества мРНК в образце, используя полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности указанной выше мРНК.

(11) Способ по пункту (10), приведенному выше, в которым указанным выше живым организмом является собака, а указанный выше полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 или 13.

(12) Способ по пункту (10), приведенному выше, где указанным выше живым организмом является человек и указанный выше полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, специфически гибридизирующийся с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 3.

(13) Способ по любому из пунктов (9)-(12), приведенных выше, в котором указанным выше образцом является ткань или клетка.

(14) Способ по любому из пунктов (1)-(13), приведенных выше, в котором злокачественная опухоль представляет собой по меньшей мере один тип злокачественной опухоли, выбранный из группы, состоящей из опухоли головного мозга, сквамозно клеточной карциномы тканей головы, шеи, легких, матки или пищевода, меланомы, аденокарциномы легких или матки, рака почек, злокачественной смешанной опухоли, печеночно-клеточной карциномы, базальноклеточной карциномы, акантома-подобной опухоли десен, опухоли ротовой полости, перианальной аденокарциномы, опухоли анальной пазухи, апокринной аденокарциномы анальной пазухи, карциномы клеток сертоли, рака преддверия влагалища, сальной аденокарциномы, сальной эпителиомы, сальной аденомы, карциномы потовых желез, интраназальной аденокарциномы, назальной аденокарциномы, рака щитовидной железы, рака толстой кишки, аденокарциномы бронхов, аденокарциномы, карциномы из эпителия протоков, аденокарциномы молочной железы, аденокарциномы молочной железы составного типа, сложной злокачественной опухоли молочной железы, внутрипротоковой сосочковой аденокарциномы, фибросаркомы, гемангиоперицитомы, остеосаркомы, хондросаркомы, саркомы мягких тканей, ретикулоклеточной саркомы, миксосаркомы, недифференцированной саркомы, рака легких, мастоцитомы, лейомиомы кожи, внутрибрюшинной лейомиомы, лейомиомы, хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы, гастроинтестинальной лимфомы, кишечной лимфомы, мелкоклеточной-промежуточноклеточной лимфомы, опухоли мозгового слоя надпочечников, гранулезоклеточной опухоли и феохромоцитомы.

(15) Способ по любому из пунктов (1)-(14), приведенных выше, предусматривающий дополнительное выявление злокачественности опухоли на основании того, что злокачественность опухоли выше, когда уровень экспрессии указанного выше полипептида выше, чем уровень экспрессии контроля.

(16) Способ по любому из пунктов (1)-(15), приведенному выше, предусматривающий дополнительное обнаружение прогрессирования злокачественной опухоли на основании показателя того, что степень злокачественной опухоли является прогрессирующей, когда уровень экспрессии указанного выше полипептида выше, чем уровень экспрессии контроля.

(17) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий полипептид, который обладает способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом, которое индуцируется in vivo против белка CAPRIN-1, имеющего любую из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей.

(18) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с полипептидом, где указанный полипептид обладает способностью связываться посредством реакции антиген-антитело с антителом против белка CAPRIN-1, имеющего одну из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO:2-30 списка последовательностей и продуцируется in vivo (или в живом организме).

(19) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по пункту (18), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с поверхностью злокачественной клетки.

(20) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по пункту (18) или (19), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, обладает иммунологической реактивностью в отношении:

полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из 7 или более последовательных аминокислотных остатков в пределах области аминокислотных остатков №№ 50-98 или аминокислотных остатков №№ 233-305 в одной из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ IDS NO:2-30 за исключением последовательностей SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18; или

полипептида, содержащего этот полипептид в виде частичной последовательности.

(21) Агент для обнаружения злокачественной опухоли по любому из пунктов (18)-(20), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое подвергается реакции антиген-антитело с этим полипептидом, представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с последовательностью SEQ ID NO:43, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 45, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 46, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 47, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:44 и 48, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:49 и 50, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:51 и 52, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:53 и 54, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:55 и 56, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:57 и 58, или моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:59 и 60.

(22) Агент для обнаружения злокачественной опухоли, содержащий полинуклеотид, который специфически гибридизируется с частичной последовательностью из 15 или более нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 25 или более нуклеотидов, и более предпочтительно из 30 или более нуклеотидов в одной из нуклеотидных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 (т.е. SEQ ID NO:1, 3, 5, 7,…,29) списка последовательностей.

Преимущество изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу обнаружения злокачественных опухолей. Как подробно описано в «Примерах», приведенных ниже, рекомбинантный полипептид, полученный на основе аминокислотной последовательности CAPRIN-1 (или также называемой Caprin-1), взаимодействует с антителом, которое специфически находится в сыворотке пациента со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль, находящаяся в живом организме, может быть обнаружена путем определения антитела в образце способом по настоящему изобретению. Также, злокачественная опухоль, находящаяся в живом организме, может быть обнаружена путем определения собственно CAPRIN-1. В соответствии со способом по настоящему изобретению злокачественная опухоль небольшого размера является невидимой невооруженным глазом или злокачественная опухоль в глубине организма может быть обнаружена in vivo. Следовательно, способ по настоящему изобретению может использоваться для раннего обнаружения злокачественной опухоли во время медицинского осмотра или тому подобного. Более того, рецидивирующая злокачественная опухоль может быть обнаружена на ранней стадии способом по настоящему изобретению во время последующего наблюдения за пациентом после лечения злокачественной опухоли. Более того, в соответствии со способом по настоящему изобретению можно диагностировать степень злокачественной опухоли, например увеличение опухоли, инфильтрацию в периферические ткани и метастазирование злокачественной опухоли в лимфатические узлы и отдаленные органы. Также уровень антитела в сыворотке является более высоким у пациента с высокозлокачественной опухолью, чем у пациента с низкозлокачественной опухолью. В соответствии со способом по настоящему изобретению также может быть установлена злокачественность опухоли. Также, как описано в приведенных ниже “Примерах”, мРНК, кодирующая CAPRIN-1, специфически экспрессируется на высоких уровнях в семенниках и злокачественных клетках. Следовательно, злокачественные опухоли также могут быть обнаружены путем определения мРНК.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны профили экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1 в нормальных тканях и клеточных линиях опухолей. Контроль № 1 указывает на профили экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1. Контроль № 2 указывает на профили экспрессии гена GAPDH.

На фиг.2 показаны результаты обнаружения с помощью окрашивания Кумасси синим CAPRIN-1-производного полипептида собак, который является примером полипептидов, используемых в настоящем изобретении, которые получены и очищены с использованием Escherichia coli в “Примерах”. Контроль № 3 указывает полосу CAPRIN-1-производного полипептида собак.

На фиг.3 показаны некоторые результаты диагностики злокачественных опухолей собак, несущих злокачественные опухоли, с использованием CAPRIN-1-производных полипептидов, полученные в “Примерах”.

На фиг.4 показаны некоторые результаты тщательной диагностики злокачественной опухоли собак, несущих злокачественные опухоли, с использованием CAPRIN-1-производных полипептидов собак, полученные в “Примерах”.

Наилучший вариант осуществления изобретения

В соответствии со способом по настоящему изобретению экспрессию CAPRIN-1 определяют, используя образец, выделенный из живого организма. Примеры способа измерения экспрессии CAPRIN-1 включают способ (1-й способ), который включает иммуноанализ антитела против CAPRIN-1, содержащегося в образце, способ (2-й способ), который включает иммуноанализ самого CAPRIN-1, содержащегося в образце, и способ (3-й способ), который включает измерение мРНК, кодирующей CAPRIN-1, содержащейся в образце. В способе по настоящему изобретению экспрессия CAPRIN-1 может быть измерена любым из этих способов. В настоящем изобретении термин «измерение» относится к любому из обнаружения, качественного определения, количественного определения и полуколичественного определения.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14 представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1 собаки. CAPRIN-1 собаки с аминокислотной последовательностью был идентифицирован как полипептид, связывающийся с антителом, специфически находящимся в сыворотке, полученной от собак, страдающих злокачественной опухолью, способом SEREX, используя библиотеку кДНК из семенников собаки и сыворотку собак со злокачественной опухолью (см. пример 1). В частности, антитело против CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, специфически индуцируется in vivo у собак со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль у собак может быть обнаружена путем измерения указанного выше антитела против CAPRIN-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, с использованием указанного 1-го способа (см. примеры 3 и 4). Злокачественная опухоль у собак также может быть обнаружена путем измерения самого CAPRIN-1 как антигена, показанного в последовательностях SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, с использованием указанного выше 2-го способа (см. примеры 5 и 6). Также, злокачественная опухоль у собак может быть обнаружена, как описано в последующих “Примерах”, путем измерения мРНК, кодирующей CAPRIN-1, поскольку мРНК экспрессируется на значительно более высоких уровнях в семенниках и злокачественных клетках (см. пример 1).

Используемый в настоящем изобретении термин «имеющий аминокислотную последовательность» относится к аминокислотным остаткам, выровненным в релевантном порядке. Следовательно, например, выражение «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» относится к полипептиду, имеющему 709 аминокислотных остатков, который состоит из аминокислотной последовательности Met Pro Ser Ala···(сокращено)··Gln Gln Val Asn, показанной в последовательности SEQ ID NO:2. Также, например, выражение «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2» также может быть сокращено как «полипептид последовательности SEQ ID NO:2». Тоже используется к выражению «имеющий нуклеотидную последовательность». В этом случае, термин «имеющий» может быть заменен выражениями «состоящий из».

Также, термин «полипептид», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к молекуле, которая образована посредством пептидного связывания множества аминокислот. Примеры такой молекулы включают не только молекулы полипептидов с большим числом составляющих аминокислот, а также молекулы с низкой молекулярной массой (олигопептиды) с небольшим числом аминокислот и полноразмерные белки. Настоящее изобретение дополнительно охватывает полноразмерные белки CAPRIN-1, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность, с четными номерами ID последовательности из SEQ ID NO:2-30.

В способе по настоящему изобретению не только CAPRIN-1 собак последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14, а также CAPRIN-1 других млекопитающих (здесь и далее также может быть назван как «гомолог» для CAPRIN-1 собак. В тех случаях, когда называют просто «CAPRIN-1», CAPRIN-1 не только собак, а также другого млекопитающего также охватывается в настоящем изобретении) также подвергаются определению. Как подробно описано в следующих “Примерах”, мРНК, кодирующая CAPRIN-1 человека, в значительной степени экспрессируется на высоком уровне в семенниках человека и злокачественных клетках, как в случае CAPRIN-1 собак последовательности SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 или 14. Однако в здоровом организме человека отсутствует антитело против CAPRIN-1 человека. Также, антитело против CAPRIN-1 кошек не определяется в организме здоровой кошки, а определяется только у кошек со злокачественной опухолью. Следовательно, злокачественная опухоль млекопитающего, отличного от собаки, может быть определена путем измерения экспрессии CAPRIN-1 у млекопитающего. Примеры CAPRIN-1 млекопитающих, отличных от собак, которые являются предметом определения в способе по настоящему изобретению, включают, но не только, CAPRIN-1 человека и CAPRIN-1 кошек. Нуклеотидная последовательность, кодирующая CAPRIN-1 человека и его аминокислотная последовательность, отдельно показаны в последовательностях SEQ ID NO:1 и 3, и 2 и 4, соответственно, в списке последовательностей. Идентичность последовательностей с CAPRIN-1 собак составляет 94% в отношении нуклеотидной последовательности и составляет 98% в отношении аминокислотной последовательности. Даже собаки и люди, которые являются генетически далекими млекопитающими, имеют идентичность последовательностей вплоть до 98% в отношении аминокислотной последовательности CAPRIN-1. Следовательно, считается, что собака и млекопитающее, отличное от человека; то есть CAPRIN-1 собаки и его гомолог, имеют высокую идентичность последовательностей примерно вплоть до 85% или более. Следовательно, CAPRIN-1, экспрессию которого измеряют в способе по настоящему изобретению, имеет, предпочтительно, 85% или более и, более предпочтительно, 95% или более идентичность последовательностей с аминокислотной последовательностью CAPRIN-1 соб