2519637 - Способ восстановления фертильности у пациенток с онкологическими заболеваниями

Способ восстановления фертильности у пациенток с онкологическими заболеваниями

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано при необходимости сохранения и восстановления репродуктивной функции у женщин с онкологическими заболеваниями. Для этого до проведения курса лучевой и/или химиотерапии лапароскопическим доступом осуществляют забор образцов яичниковой ткани из кортикального слоя с фрагментацией их на части по 2-5 мм². Из полученных образцов одну часть берут на гистологические исследования, а другую помещают в криопробирки и консервируют в две стадии. При этом в качестве криопротектора на первой стадии используют 10-14% раствор диметилсульфоксида, на второй стадии - 20% раствор 2,5 М сахарозы и 29-32% раствор диметилсульфоксида. При проведении аутотрансплантации образцы яичниковой ткани размораживают с использованием среды Kitazata и оценивают их качество путем гистологического исследования. Непосредственно перед трансплантацией лапароскопическим путем проводят биопсию сохраненных яичников с последующим проведением гистологического исследования. При удовлетворительном результате исследования в кортикальном слое каждого яичника формируют ложе и помещают в них от 5 до 10 фрагментированных размороженных образцов. Затем края ложа смыкают, обрабатывают биологически нейтральным клеем и накладывают клеммы для последующего визуального контроля и оценки динамики роста фолликулов трансплантированной ткани с применением визуальной диагностики. Контроль уровня гормонов проводят один раз в месяц до достижения уровня гормонов на момент забора яичниковой ткани для консервации. Способ позволяет сохранить или восстановить репродуктивную функцию у женщин с онкологическими заболеваниями за счет трансплантации декриоконсервированной овариальной ткани в сохраненные яичники, что обеспечивает адекватную васкуляризацию и приживаемость ткани. 3 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил., 3 пр.

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к лечению онкологических больных, и может быть использовано для сохранения репродуктивной функции у онкологических больных.

В 2010 г. в Российской Федерации выявлено 516874 случаев злокачественных новообразований. Прирост заболеваемости по сравнению с 2009 г. составил 2,4%. Основной контингент больных составили пациенты со злокачественными новообразованиями молочной железы (18,1%), тела (7,0%) и шейки (5,7%) матки, лимфатической и кроветворной ткани (5,6%). В зарубежной литературе опубликовано 43 случая успешной трансплантации криоконсервированной или «свежей» ткани яичников, которая привела к восстановлению менструального цикла на несколько (около 45) месяцев практически у всех пациенток (Bedaiwy М.А., Shahin A.Y., Falcone Т. Reproductive organ transplantation: advances and controversies. Fertil Steril 2008; 90:6:2031-2055.). Сообщается о рождении 7 здоровых детей после аутотрансплантации криоконсервированной ткани яичников, а также о наступлении беременности после трансплантации «свежей» или криоконсервированной ткани яичников у пар монозиготных близнецов. При развитии у одной из сестер развился синдром преждевременного истощения яичников (Н.В.Баркалина, Н.А.Ревишвили, Т.А.Назаренко. Криоконсервация ткани яичников: метод сохранения генетического материала для отсроченной реализации репродуктивной функции (обзор литературы). // Проблемы репродукции, 2010, №2. - С 30-33).

Известны способы трансплантации криоконсервированной и свежей овариальной ткани, а также пересадки целого яичника с позиции их превентивного забора и отсроченной трансплантации (Байтингер В.Ф., Цуканов А.И., Волочков И.В. «Трансплантация яичника, криоконсервированной и свежей овариальной ткани: состояние вопроса». ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г.Томск, 2012 г.). В статье отражен анализ мирового опыта и актуализирована проблема гетеротопической трансплантации целого яичника на сосудистых анастомозах, что дает сохранение гормональной функции и репродуктивного потенциала женщины.

Недостатками изложенных способов являются: 1) сложность выполнения техники немедленной реваскуляризации с помощью аппаратного микрососудистого шва; 2) отсутствие возможности исправления отрицательного результата.

Известен «СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТКАНИ ЯИЧНИКА К ТРАНСПЛАНТАЦИИ У ПАЦИЕНТОК СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ОРГАНОВ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ» (патент №RU 2336697, 20.07.2007, Быстрова О.В.). Способ включает этап транспортировки ткани во льду и характеризуется тем, что осуществляют забор ткани яичника, обработку ткани средами, отделение кортикального слоя от медуллярной части, криоконсервацию путем замораживания ткани в криовиолах со стартовой температурой +4°C и пошаговым охлаждением 2°C/мин до -9°C, инициацию кристаллизации при -9°С и выполнение пошагового охлаждения 0,3°C/мин до температуры -40°C, затем 10°C/мин до температуры -140°C, последующее погружение в криобанк с жидким азотом с температурой -196°C и хранение с последующим размораживанием ткани для трансплантации. При заборе ткани ее обрабатывают вначале Flushing-средой с гепарином (Medicult) при комнатной температуре, затем средой Sperm Preparation Medium (Medicult), после чего отделяют кортикальный слой от медуллярной части, и ткань, находящуюся в стерильных пробирках в среде Sperm Preparation Medium (Medicult) помещают в лед для транспортировки. Кортикальный слой нарезают на фрагменты размером 5×10 мм и толщиной 1 мм на холодном столе при температуре +4°C и подвергают дегидратации в течение 95 мин путем помещения фрагментов ткани в криовиолы с раствором 1,5 моль/л пропандиола и с 0,1 моль/л сахарозы и осуществляют криоконсервацию. После размораживания ткань помещают в среду Sperm Preparation Medium (Medicult) при комнатной температуре, в которой она находится до трансплантации.

Недостаток способа заключается в том, что отражены способы только гетеротопической трансплантации ткани (предплечье, передняя брюшная стенка). Не раскрыты вопросы трансплантации ткани в сохраненный яичник.

Известен «Способ восстановления гормонального фона и функциональной активности яичников у онкологических пациенток» (патент №RU 2350290 от 20.08.2007, Минихас Г.М.). Он заключается в криоконсервации овариальной ткани с последующим размораживанием и аутотрансплантации путем помещения овариальной ткани в подкожную клетчатку предплечья или в брюшную стенку. При этом предварительно формируют зоны васкуляризации вне поля облучения путем выполнения хирургического разреза кожи длинной 1,5 см с наложением швов на четверо суток. Затем в развившуюся грануляционную ткань и сформированную зону васкуляризации трансплантируют фрагменты овариальной ткани, ориентированные кортикальным слоем к поверхности кожи.

Недостатки способа заключаются в необходимости формирования зоны усиленной васкуляризации (область подкожной клетчатки предплечья или брюшной стенки), в которую трансплантируют фрагменты овариальной ткани. Способ применим к пациентам, не имеющим собственной яичниковой ткани. Он не рассматривает трансплантацию ткани в сохраненные яичники и требует проведения трансдермальной гормональной стимуляции после проведения аутотрансплантации.

Известен способ трансплантации криоконсервированного коркового вещества яичника подкожно, на брюшину fossa ovarica и на поверхность яичника (Demeestere I., Simon P., Emiliani S. et al. Fertility preservation: successful transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a young patient previously treated for Hodgkin's disease. Oncologist 2007; 12:12:1437-1442.).

К недостаткам способа следует отнести то, что в трансплантате, расположенном подкожно, редко удается добиться роста фолликулов до диаметра более 15 мм.

Известен способ ортотопической трансплантации в брюшину fossa ovarica и/или на поверхность противоположного яичника (Demeestere I., Simon P., Emiliani S. et al. Orthotopic and heterotopic ovarian tissue transplantation. Hum Reprod Update 2009; 15:6:649-665). Он создает доказательную возможность восстановления естественной фертильности и обеспечивает развитие фолликулов в более благоприятных естественных условиях.

Недостаток способа заключается в трансплантации размороженной ткани на поверхность яичника. Не рассматривается возможность использования способа у онкологических больных

Известен СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ У БОЛЬНЫХ МИНИМАЛЬНОЙ ВЫСОКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЭНДОМЕТРИЯ РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА (RU 2218920 от 18.02.2002). Способ заключается в проведении гормонотерапии опухоли для достижения ее регресса не более чем в течение 6 месяцев. Затем проводят в течение не более 2-х лет циклы стимуляции овуляции с помощью кломифена с хориогонином или декапептилом (не более 3-х циклов). Способ сохраняет фертильность при минимальной опасности рецидива опухоли.

К недостаткам метода относится ограниченный контингент онкологических пациенток с заболеванием эндометрия.

Прототипом предлагаемого изобретения является «СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ» (ЗАЯВКА RU 2009138937, 22.10.2009 Киселева М.В., Цыб А.Ф.). Способ включает отбор больных и забор у них генетического материала перед проведением курса лучевой и/или химиотерапии, криоконсервацию отобранной яичниковой ткани и хранение ее для последующего размораживания и использования в качестве донорского материала, например, для трансплантации пациентке или суррогатной матери или для выращивания яйцеклетки «in vitro». Забор генетического материала в виде яичниковой ткани из кортикального слоя осуществляют с минимальными размерами не менее 10 мм. В срок не более 10 мин от момента забора ткани производят криоконсервацию с предшествующим двухстадийным отмыванием материала и поэтапным взаимодействием с растворами криопротектора различной концентрации. Яичниковую ткань получают при помощи лапароскопического оперативного вмешательства. Криоконсервированную яичниковую ткань хранят не менее 5 лет в случае последующей аутотрансплантации.

Кроме того, отбор пациентов включает проверку на наличие опухоли яичников или их метастатическое поражение, на предшествующее лечение химиотерапией и гормонотерапией, лучевой терапией, иммунотерапией, на наличие признаков системной инфекции, выраженной астенозооспермии и тератозооспермии, беременности или кормление грудью.

Недостаток прототипа - отсутствие упоминания о видах и способах последующей трансплантации.

Ожидаемый технический результат заключается в восстановлении гормонального фона и репродуктивной функции до показателей, определяемых до криоконсервации у пациенток, перенесших различные виды онкологических заболеваний.

Накопленный нами опыт открывает возможности создания универсального способа восстановления гормонального статуса и фертильности у онкологических пациенток за счет трансплантации декриоконсервированной овариальной ткани в сохраненные яичники. При трансплантации ткани подобным способом обеспечивается лучшая васкуляризация и приживаемость ткани, т.к. ткань возвращается в естественную среду, откуда она была извлечена для криоконсервации.

Сущность изобретения включает отбор больных и забор у них генетического материала лапароскопическим доступом перед проведением курса лучевой и/или химиотерапии, криоконсервацию отобранной яичниковой ткани и хранение ее для последующего размораживания/декриоконсервации и использования в качестве донорского материала, например, для трансплантации. При этом забор образцов яичниковой ткани осуществляют из кортикального слоя размерами не менее 10 мм, толщиной не более 1 мм. Образцы фрагментируют на части по 2-5 мм². Из полученных образцов одну часть берут на гистологическое исследование, а другую помещают в криопробирки (SPL Lifesciences) и консервируют. Криоконсервацию производят с предшествующим двухстадийным отмыванием материала. Затем поэтапно образцы пропитывают криопротектором в два этапа растворами криопротектора различной концентрации. На первом этапе используют 10-14% раствор диметилсульфоксида, а на втором этапе 20% раствор 2,5 М сахарозы и 28-32% раствор диметилсульфоксида. Обработку ткани осуществляют при температуре 4 С°.

Для проведении аутотрансплантации размораживают яичниковую ткань с использованием среды Kitazata и оценивают сохранность ткани путем гистологического исследования. Перед трансплантацией лапароскопическим путем проводят биопсию сохраненных яичников для гистологического исследования. В кортикальном слое каждого яичника формируют ложе и помещают в него от 5 до 10 фрагментированных размороженных образцов. Затем края ложа смыкают, обрабатывают биологически нейтральным клеем Тиссукол (Baxter comp) и накладывают клеммы для последующего визуального контроля и оценки динамики роста фолликулов аутотрансплантированной ткани с применением УЗ диагностики. Гормональный контроль проводят один раз в месяц по уровню гормонов: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), антимюллеров гормон (АМГ), а также: лютеинизирующий гормон (ЛГ), эстрадиол и ингибин В в сыворотке крови. Достижением положительного результата восстановления фертильности является уровень гормонов, соответствующий моменту забора овариальной ткани для консервации.

Перечень фигур:

Фиг.1 Процесс биопсии яичниковой ткани. 1 - яичник, 2 - матка, 3 - ножницы.

Фиг.2 Процесс формирования «ложа». 1 - яичник, 4 - зажимы, 5 - ложе.

Фиг.3 Ткань, погруженная в «ложе». 1 - яичник, 2 - матка, 4 - зажимы, 6 - размороженная ткань.

Фиг.4 Наложение клемм на яичник. 1 - яичник, 2 - матка, 4 - зажимы, 5 - ложе, 7 - клемма.

Фиг.5. Вид яичника после трансплантации и фиксации клеем. 1 - яичник, 2 - матка, 8 - участок яичника с трансплантированной тканью.

Способ реализуют по этапам:

1. При поступлении больной проводят обследование на возможность забора образцов яичниковой ткани. Показания: репродуктивный возраст от 18 до 35 лет, отсутствие опухоли яичников или их метастатическое поражение, отсутствие предшествующего лечения химиотерапией, гормонотерапией, лучевой терапией и иммунотерапией. Критерием исключения является наличие признаков системной инфекции или тяжелых заболеваний, а также беременность или кормление грудью. Относительными противопоказаниями могут служить наличие вирусоносительства (ВИЧ, гепатит В и С, сифилис), системных инфекций и тяжелых заболеваний жизненно важных систем организма (сердечно-сосудистой, нервной, дыхательной или эндокринной системы).

2. Забор биопсийного материала лапароскопическим доступом

Операцию обычно выполняют в любой день после постановки диагноза и до начала терапии в отсутствие менструации. Ткань яичника иссекают стерильным скальпелем или ножницами (см. Фиг 1). Несколько образцов немедленно фиксируется в 10%-ном растворе формалина для гистологического исследования. При проведении гистологического исследования оценивают наличие примордиальных фолликулов, их количество и отсутствие опухолевых клеток. К удовлетворительным критериям состояния фолликулов относят: форма, близкая к округлой, светлоокрашенная цитоплазма с более яркими эозинофильными структурами в перинуклеарной области, ядра округлой формы с равномерно окрашенной кариоплазмой, небольшим ядрышком и слабоконденсированным хроматином, желательно наличие хорошо различимой базальной мембраны фолликулов и плотного прилегания текальных клеток к наружной стороне базальной мембраны. Остальные биоптаты яичниковой ткани подвергаются криоконсервации.

3. Криоконсервация образцов

В операционном блоке образцы биопсийного материала из ткани яичника помещают пинцетом в стерильный раствор и в кратчайшие сроки доставляют непосредственно из операционной в лабораторию для замораживания. Нитрификации подвергают только кортикальный слой, толщина которого около 1 мм. Образец ткани полоской примерно 10 мм фрагментируют на части по 2-5 мм² и консервируют в криопробирки (SPL Lifesciences). Одну из них выделяют в качестве контрольной для последующего гистологического анализа после размораживания.

Во избежание повреждения ткани перед замораживанием образцы пропитывают криопротектором в два этапа. На первом этапе используют 12% раствор диметилсульфоксида (ДМСО), а на втором этапе 30% раствор диметилсульфоксида в комбинации с 20% раствором 2,5 М сахарозы. Обработку ткани осуществляют при температуре 4 градуса Целься. Биоптаты, помещенные в криопробирки (SPL Lifesciences), немедленно погружают в жидкий азот.

4. Хранение образцов

Маркированные криопробирки подлежат хранению в криохранилище, где температурный режим поддерживается на уровне -196 C°.

5. Перед трансплантацией проводят отбор пациенток, которым проводили криоконсервацию образцов яичниковой ткани. У них должна быть фиксирована стойкая ремиссия основного заболевания. Перед проведением лапароскопического вмешательства с целью трансплантации декриоконсервированной овариальной ткани проводят забор крови на анализ RW, ВИЧ, гепатиты В и С; определение группы крови и резус-фактора; биохимический анализ крови, общий анализ крови; коагулограмма; общий анализ мочи, ЭКГ, рентгенография легких, мазок на степень чистоты, Са-125, УЗИ малого таза, брюшной полости и почек, консультация врача-онколога, проводившего курс специализированной (XT, ЛТ) терапии основного заболевания, консультация анестезиолога.

6. Подготовка к проведению трансплантации

Контрольные образцы яичниковой ткани подвергают размораживанию с использованием сред Kitazata и проводят гистологическое исследование, где оценивается качество размороженной ткани, удовлетворяющее требованиям для трансплантации по п.2 (см. выше).

7. Операцию трансплантации выполняют в любой день после окончания обследования в отсутствие менструации. Выбор оптимального доступа к яичниковой ткани осуществляет врач-онколог совместно с репродуктологом, чаще используют лапароскопический доступ. К лапаротомии прибегают в случае отсутствия условий для лапароскопии (распространенный спаечный процесс, сопутствующие общесоматические заболевания, исключающие нагнетание газа в брюшную полость).

8. Размораживание консервированных образцов ткани проводят в день трансплантации с использованием сред Kitazata за 30 минут до операции.

9. Для трансплантации ткани выполняют полуовальные разрезы кортикального слоя на каждом яичнике, производится подготовка ложа для декриоконсервированной ткани (фиг.2). Подготовленный эмбриологами материал через лапароскопические отверстия вводится в брюшную полость пациентки. В сформированный «карман» под кортикальный слой сохраненных яичников помещается от 5 до 10 фрагментированных размороженных образцов (Фиг.3). Края ложа смыкают и обрабатывают биологически нейтральным клеем Тиссукол (Baxter company) (Фиг.5). На ткань сохраненных яичников, куда была трансплантирована декриоконсервированная ткань, накладывают клеммы для последующего визуального контроля (Фиг.4).

Срок госпитализации данного контингента пациенток составляет в среднем 5 дней.

10. Контроль.

Гормональный контроль проводят 1 раз в месяц по уровню гормонов: ФСГ, АМГ, а также: ЛГ, эстрадиол и ингибин В в сыворотке крови до фиксации уровня гормонов, соответствующего таковому на момент забора овариальной ткани для консервации. Визуальный контроль проводят в те же сроки, что и гормональный, и включает в себя УЗ-исследование органов малого таза с верификацией роста фолликулов аутотрансплантированной ткани. Свидетельством восстановления утраченной функции является: наличие 7 и более фолликулов на 2-3-й день менструального цикла в каждом яичнике. Общий объем яичниковой ткани должен превышать 8 см ³. Примеры реализации способа.

Пример 1. Больная Каштанова Евгения Владимировна, 1986 г.р. (история болезни №5624).

Диагноз: Рак щитовидной железы. T4N1M0, IV стадия. Метастатическое поражение лимфоузлов шеи. Комбинированное лечение (оперативное лечение, радиойодтерапия в 2011 г). МКБ 10: С73.

Сопутствующая патология: Хр. гастрит. Левосторонняя мочекаменная болезнь.

Больная обследована, произведено исследование гормонального статуса на основе анализа сыворотки крови:

Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
12.01.11	5,1	10,9	71,6	92	4,37

Данные о наличии опухолей яичников или их метастатического поражения отсутствуют. Отсутствовали признаки системной инфекции или тяжелого заболевания, беременности, вирусоносительства (ВИЧ, гепатит В и С, сифилис), системных инфекций.

В связи с тем, что больной планировалось проведение оперативного вмешательства с последующей радиойодтерапией, ей предложено проведение криоконсервации овариальной ткани. Согласие получено, заявление на криоконсервацию и хранение биологического материала оформлено. Абсолютных противопоказаний к операции не было.

08.02.11: Произведена лапароскопическая биопсия яичниковой ткани с целью криоконсервации.

Ход операции: троакар введен в нижний параумбиликальный разрез. Пневмоперитонеум. Ревизия: тело матки не увеличено, без особенностей. Придатки - без особенностей. Патологии других органов и систем не выявлено. Произведена биопсия ткани обоих яичников для криоконсервации: ткань яичника иссечена стерильными ножницами. Несколько образцов немедленно фиксировано в 10%-ном формалине для гистологического исследования. Остальные образцы доставлены в лабораторию для криоконсервации. Санация брюшной полости. Дополнительный гемостаз не потребовался. Раны ушиты викрилом. Выполнены асептические наклейки.

Гистологическое заключение биопсийного материала, взятого в операционной №4654-59 от 11.02.11: I - тека-ткань яичника, II - тека-ткань с наличием примордиальных фолликулов (результат для фертильности удовлетворительный).

Остальные биоптаты яичниковой ткани были консервированы. Во избежание повреждения ткани при замораживании используют 2 вида криопротекторов: на первом этапе использовали 12% раствор диметилсульфоксида, на 2 этапе - 20% раствор 2,5 М сахарозы и 30% раствор диметилсульфоксида. Время пропитки составило 10 и 2 минуты соответственно. Обработку ткани осуществляли при температуре 4 C°. Биоптаты, помещенные в криопробирки (SPL Lifesciences), немедленно были погружены в жидкий азот.

Послеоперационный период протекал гладко, больная активизирована на 2 сутки, швы сняты на 5 сутки и направлена на лечение по основному заболеванию.

С 23.12.10 по 18.02.11: курс специфического лечения: оперативное лечение, радиойодтерапия (с 15 по 18.02.11 г.).

С 08.02.11 с момента взятия биопсии по август 2012 пациентка периодически находилась под наблюдением у гинеколога: УЗИ малого таза, исследование гормонального статуса. При анализе полученных результатов зафиксирована преждевременная недостаточность яичников, связанная вероятнее всего с проведением радиойодтерапии. На 09.08.2012 г. фиксирован уровень гормонов: ФСГ 9.01 и АМГ 0.75, что подтверждает факт угасания функции яичников.

Контроль гормонального статуса
Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
09.08.12	10,4	2,65	31,2	67,6	0,75

В 19.09.2012 году после проведения контрольного обследования по основному заболеванию признаков рецидива и метастатического поражения не выявлено. Фиксирована стойкая ремиссия основного заболевания. Пациентка изъявила желание реализовать свою репродуктивную функцию, в связи с чем была предложена процедура аутотрансплантации консервированной овариальной ткани. Противопоказаний к проведению трансплантации декриоконсервированной ткани не выявлено.

20.09.12: Аутотрансплантация декриоконсервированной яичниковой ткани. Ход операции: Троакар введен в нижний параумбиликальный разрез. Пневмоперитонеум. Ревизия: Матка не увеличена. Придатки - без особенностей. Патологии других органов и систем не выявлено. Патологии других органов и систем не выявлено. Произведена биопсия яичниковой ткани обоих яичников. Выполнены полуовальные разрезы кортикального слоя обоих яичников, произведена трансплантация размороженной овариальной ткани под кортикальный слой одноименных яичников, наложены клеммы, поверхность обработана клеем Тиссукол. Дополнительный гемостаз не потребовался. Наложены швы на послеоперационные раны и асептические наклейки.

Послеоперационный период протекал гладко. Больная на второй день была активизирована и через 3 дня выписана под наблюдение врача.

Контрольное обследование проводили один раз в месяц: УЗ-исследование состояния яичников с подсчетом количества и размеров фолликулов, а также определяют гормональный уровень (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, АМГ, ингибин В). Результаты лечения см. в таблице 1.

Таблица 1
Максимально значимые гормоны
	12.01.11	20.02.11	09.08.12	01.09.12	03.10.12	01.11.12	07.12.12
ФСГ	5,1	9,24	10,4	9,01	8,6	5,2	4,97
АМГ	4,37	2,1	0,75	1,5	1,7	1,85	2,45

Пример 2. Больная Мальцева Мария Сергеевна, 1985 г.р. (история болезни №1487). Диагноз: Лимфома Ходжкина II АЕ стадии с поражением шейных, надключичных, подключичных лимфоузлов с двух сторон, средостения, парамедиальной плевры справа (комбинированное лечение в 2009 г). МКБ 10: С 81.1 Сопутствующая патология: нет.

Больная обследована, произведено исследование гормонального статуса на основе анализа сыворотки крови:

Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
11.03.09	10,7	80,2	42,4	109	4,55

В связи с тем, что больной планировалось проведение токсичных курсов полихимиотерапии, ей предложено проведение криоконсервации овариальной ткани. Согласие получено, заявление на криоконсервацию и хранение биологического материала оформлено. Абсолютных противопоказаний к операции не было.

24.03.2009 Произведена лапароскопическая биопсия яичниковой ткани с целью криоконсервации.

Гистологическое заключение биопсийного материала, взятого в операционной: от 28.03.09: В левом и правом яичниках - множественные примордиальные фолликулы (результат для фертильности удовлетворительный).

Послеоперационный период протекал гладко, больная активизирована на 2 сутки, швы сняты на 5 сутки, она направлена на лечение по основному заболеванию.

С 14.03.09 по август 2009 курсы ПХТ (4ABVD+2CVPP), дистанционная лучевая терапия на область лимфоколлекторов выше диафрагмы - 30 Гр, область селезенки 20 Гр.

С момента взятия биопсии по сентябрь 2012 пациентка периодически находилась под наблюдением у гинеколога: УЗИ малого таза, исследование гормонального статуса. При анализе полученных результатов зафиксирована преждевременная недостаточность яичников, связанная вероятнее всего с проведением радиойодтерапии. На 28.09.2012 г. фиксирован уровень гормонов: ФСГ 48,2 и АМГ менее 0,17, что подтверждает факт утраты функции яичников.

Контроль гормонального статуса
Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
28.09.2012	48,2	12,9	Менее 9,7	Менее 9,4	Менее 0,17

В 10.10.2012 году после проведения контрольного обследования по основному заболеванию признаков рецидива и метастатического поражения не выявлено. Фиксирована стойкая ремиссия основного заболевания. Пациентка изъявила желание реализовать свою репродуктивную функцию, в связи с чем была предложена процедура аутотрансплантации консервированной овариальной ткани. Противопоказаний к проведению трансплантации декриоконсервированной ткани не выявлено.

23.10.12: Аутотрансплантация декриоконсервированной яичниковой ткани. Ход операции: Троакар введен в нижний параумбиликальный разрез. Пневмоперитонеум. Ревизия: Матка не увеличена. Придатки - без особенностей. Патологии других органов и систем не выявлено. Произведена биопсия яичниковой ткани обоих яичников. Выполнены полуовальные разрезы кортикального слоя обоих яичников, произведена трансплантация размороженной овариальной ткани под кортикальный слой одноименных яичников, наложены клеммы, поверхность обработана клеем Тиссукол. Дополнительный гемостаз не потребовался. Наложены швы на послеоперационные раны и асептические наклейки.

Таблица 2
	11.03.09	13.10.09	28.09.12	30.10.12	27.11.12
ФСГ	10,70	154,10	48,2	26,5	20,1
АМГ	4,55	1,5	Менее 0,17	1,0	1,7

Пример 3. Больная Дорошенко Наталья Сергеевна, 1990 г.р. (история болезни №6348). Диагноз: Рак носоглотки T3N3M0 (оперативное лечение, ПХТ в 2009 г). МКБ 10: С 11 Сопутствующая патология: диффузный токсический зоб.

Больная обследована, произведено исследование гормонального статуса на основе анализа сыворотки крови:

Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
01.11.09	4,1	30,9	70,5	47,9	3,56

Данные о наличии опухолей яичников, или их метастатического поражения отсутствуют. Отсутствовали признаки системной инфекции или тяжелого заболевания, беременности, вирусоносительства (ВИЧ, гепатит В и С, сифилис), системных инфекций.

В связи с тем, что больной планировалось проведение цитотоксической полихимиотерапии, ей предложено проведение криоконсервации овариальной ткани. Согласие получено, заявление на криоконсервацию и хранение биологического материала оформлено. Абсолютных противопоказаний к операции не было.

02.11.09: Произведена лапароскопическая биопсия яичниковой ткани с целью криоконсервации.

Гистологическое заключение биопсийного материала, взятого в операционной от 09.11.09: ткань яичников представлена преимущественно корковым веществом с большим количеством примордиальных фолликулов (результат для фертильности удовлетворительный).

Остальные биоптаты яичниковой ткани были консервированы. Во избежание повреждения ткани при замораживании используют 2 вида криопротекторов: на первом этапе использовали 12% раствор диметилсульфоксида, на 2 этапе - 20% раствор 2,5 М сахарозы и 30% раствор диметилсульфоксида. Время пропитки составило 10 и 2 минуты соответственно. Обработку ткани осуществляли при температуре 4°C. Биоптаты, помещенные в криопробирки (SPL Lifesciences), немедленно были погружены в жидкий азот.

С 08.11.09 по 22.12.09 курс специфического лечения: ДЛТ области носоглотки и лимфоколлекторов до СОД60 Гр. Курсы полихимиотерапии.

С момента взятия биопсии по август 2012 пациентка периодически находилась под наблюдением у гинеколога: УЗИ малого таза, исследование гормонального статуса. При анализе полученных результатов зафиксирована преждевременная недостаточность яичников, связанная вероятнее всего с проведением радиойодтерапии. На 19.07.2012 г. фиксирован уровень гормонов: ФСГ 12,5и АМГ 0,02, что подтверждает факт угасания функции яичников.

Контроль гормонального статуса:

Дата	ФСГ	ЛГ	Эстрадиол	Ингибин В	АМГ
19.07.2012	12,5	5,2	141,1	34,1	0,02

В 24.07.2012 году после проведения контрольного обследования по основному заболеванию признаков рецидива и метастатического поражения не выявлено. Фиксирована стойкая ремиссия основного заболевания. Пациентка изъявила желание реализовать свою репродуктивную функцию, в связи с чем была предложена процедура аутотрансплантации консервированной овариальной ткани. Противопоказаний к проведению трансплантации декриоконсервированной ткани не выявлено.

26.08.12: Аутотрансплантация декриоконсервированной яичниковой ткани. Ход операции: Троакар введен в нижний параумбиликальный разрез. Пневмоперитонсум. Ревизия: Матка не увеличена. Придатки - без особенностей. Патологии других органов и систем не выявлено. Произведена биопсия яичниковой ткани обоих яичников. Выполнены полуовальные разрезы кортикального слоя обоих яичников, произведена трансплантация размороженной овариальной ткани под кортикальный слой одноименных яичников, наложены клеммы, поверхность обработана клеем Тиссукол. Дополнительный гемостаз не потребовался. Наложены швы на послеоперационные раны и асептические наклейки.

Контрольное обследование проводили один раз в месяц: УЗ-исследование состояния яичников с подсчетом количества и размеров фолликулов, а также определяли гормональный уровень (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, АМГ, ингибин В). Результаты лечения см. в таблице 3.

Таблица 3
Максимально значимые гормоны
	01.11.09	08.12.09	19.07.12	05.09.12	03.10.12	31.10.12	28.11.12
ФСГ	4,1	5,3	12,5	10,02	8,6	6,7	5,97
АМГ	3,56	0,15	0,02	1,5	1,75	1,85	2,36

Доказательства достижения технического результата

В процессе проведения исследования произведена лапароскопическая аутотрансплантация размороженной овариальной ткани у 10 пациенток с онкопатологией в анамнезе и фиксированной ремиссией основного заболевания.

Для контроля за результатом проведенного вмешательства проводится динамическое наблюдение, заключающееся в оценке гормонального статуса и УЗИ верификации роста фолликулов (с подсчетом количества и размеров фолликулов) один раз в месяц.

В процессе динамического контроля, проводившегося на основании анализа уровней гормонов (ФСГ, АМГ, а также ЛГ, эстрадиол, ингибин В) в сыворотке крови, зафиксировано их стремление к уровню на момент забора овариальной ткани для криоконсервации.

Визуальный контроль проводят в те же сроки, что и гормональный. Он включает в себя УЗ-исследование органов малого таза с верификацией роста фолликулов аутотрансплантированной ткани. Свидетельством восстановления утраченной функции является: наличие 7 и более фолликулов на 2-3-дни менструального цикла в каждом яичнике. Общий объем яичниковой ткани должен превышать 8 см³.

1. Способ восстановления фертильности у пациенток с онкологическими заболеваниями, включающий забор образцов яичниковой ткани лапароскопическим доступом до проведения курса лучевой и/или химиотерапии, криоконсервацию образцов и хранение их для последующего размораживания и использования для трансплантации, перед криоконсервацией отмывают образцы и пропитывают раствором криопротектора, отличающийся тем, что из полученных образцов одну часть берут на гистологические исследования, а другую помещают в криопробирки и консервируют в две стадии, при аутотрансплантации образцы яичниковой ткани размораживают, оценивают ее качество путем гистологического исследования, перед трансплантацией лапароскопическим путем проводят биопсию сохраненных яичников на гистологическое исследование, при удовлетворительном результате которого в кортикальном слое каждого яичника формируют ложе и помещают в них от 5 до 10 фрагментированных размороженных образцов, затем края ложа смыкают, обрабатывают биологически нейтральным клеем, накладывают клеммы для последующего визуального контроля и оценки динамики роста фолликулов аутотрансплантированной ткани с применением визуальной диагностики, гормональный контроль проводят один раз в месяц до фиксации уровня гормонов на момент забора яичниковой ткани для консервации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор образцов яичниковой ткани осуществляют из кортикального слоя и фрагментируют их на части по 2-5 мм².

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что с целью исключения повреждения ткани при замораживании в качестве криопротектора на первой стадии используют 10-14% раствор диметилсульфоксида, на второй стадии - 20% раствор 2,5 М сахарозы и 29-32% раствор диметилсульфоксида.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что образцы размораживают с использованием среды Kitazata.

Способ восстановления фертильности у пациенток с онкологическими заболеваниями

Патент 2519637