Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии

Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка претендует на приоритет в отношении предварительной заявки на патент США №61/110187, озаглавленной "Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample", поданной 31 октября 2008, которая включена в данную заявку.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и системам для обнаружения, изоляции и/или идентификации микроорганизмов в образце. В частности, настоящее изобретение представляет собой прямой способ быстрой характеристики и/или идентификации микроорганизма с помощью масс-спектрометрии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Обнаружение патогенных микроорганизмов в биологических жидкостях следует осуществлять в кратчайшее по возможности время, в частности, в случае септицемии, для которой смертность остается высокой, несмотря на широкий спектр антибиотиков, доступных врачам. Присутствие биологически активных агентов, таких как микроорганизмы, в жидкости организма пациента, в частности в крови, обычно определяют, используя флаконы гемокультуры. Инфекции системы кровообращения связаны с высокой заболеваемостью и смертностью, кроме того, осуществление современных способов диагностики, культивирование с последующей биохимической идентификацией и тестирование на чувствительность к антибиотикам может занять несколько суток. Обычно начинают эмпирическую терапию на основании клинических симптомов, и результаты тестов влияют на клинические решения только тогда, когда первоначальная терапия неудачна. Способность охарактеризовать инфекции кровообращения в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата гемокультуры значительно усилило бы клиническую релевантность предоставленной диагностической информации. Для восполнения данной потребности предложены способы молекулярной амплификации, но при данном подходе остаются серьезные проблемы. Сама среда положительной гемокультуры представляет собой естественно амплифицированную популяцию микроорганизмов с потенциалом использования быстрых тестов идентификации (ID).

Традиционные автоматические фенотипические ID тесты, такие как системы Vitek®, Phoenix™ и Microscan®, или ручные фенотипические тесты, такие как API, требуют, чтобы микроорганизмы находились в соответствующей фазе роста и были свободны от мешающих сред и продуктов крови с целью получения надежных результатов. Эти системы используют колонии, выращенные из положительной культуры в течение 18-24 часов на средах в чашках Петри. Однако при стремлении получить более быстрые результаты некоторые лаборатории сообщили об использовании этих систем с микроорганизмами, выделенными из флаконов с положительными гемокультурами. Эти тесты "непосредственно из флакона" пригодны не для всех микроорганизмов (например, непригодны для грамположительных кокков), не подтверждены изготовителями тестов и, как правило, занимают 3-8 часов для получения результатов. Более быстрые и более широко специфичные тесты крайне необходимы в целях обеспечения врача клинически релевантными результатами в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата культуры.

Масс-спектрометрические способы обладают потенциалом, предоставляющим возможность идентификации микроорганизмов очень быстро, но они могут столкнуться с интерференцией от множества соединений, присутствующих в жидких микробиологических культуральных средах и в клинических образцах, таких как кровь, или в их сочетании. Чаще всего используемые способы выделения микроорганизмов непосредственно из положительной гемокультуры представляют собой двухступенчатое дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в пробирке для отделения сыворотки.

Другие описанные способы разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов включают:

В патенте США №6177266 раскрыт способ хемотаксономической классификации бактерий биомаркерами, специфичными для рода, вида и штамма, созданными с помощью анализа масс-спектрометрии времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF-MS) либо клеточных белковых экстрактов, либо целых клеток.

В патенте США №7070739 представлен способ экстракции, разделения и очистки микроорганизмов, включая вирусы, путем двумерного ультрацентрифугирования непосредственно из жидкостей организма или из гомогенизированной ткани. На первой стадии центрифугирования удаляют все частицы, имеющие более высокую скорость седиментации, чем те из микроорганизмов, которые нужно идентифицировать. На второй стадии ультрацентрифугирования используют зональное центрифугирование в градиенте плотности в жидкостях, заполненных с образованием градиента плотности широкого диапазона, используя специальные рифленые центрифужные пробирки. В соответствии с этим патентом этот метод разделения можно использовать для определения сгруппированных частиц с помощью светорассеяния или флуоресценции, используя красители, специфичные для нуклеиновых кислот, и для выделения сгруппированных частиц в очень малых объемах для характеристики с помощью масс-спектрометрии субъединиц вирусных белков и интактных вирусных частиц, а также с помощью флуоресцентного проточного цитометрического определения как массы нуклеиновых кислот, так и масс фрагментов, образуемых ферментами рестрикции.

В опубликованной заявке на патент США №2007/0175278 описано использование жидкой культуральной среды для культивирования интересующего образца, включающего, например, кровь, мочу, фекалии, внутривенные катетеры и т.д., линии промышленного производства, водные системы, пищевой продукт, косметическое изделие, фармацевтический препарат и криминалистический образец. Следовательно, микроорганизмы могут быть собраны из жидкой среды способами, известными в данной области техники, например, центрифугированием. Затем концентрированные микроорганизмы можно переносить на материал-носитель, необязательно после высушивания, для получения вибрационного спектра. В заявке на патент обсуждены различные способы идентификации и классификации микроорганизмов, включая вибрационную спектроскопию, такую как рамановская спектроскопия.

Однако эти способы имеют несколько недостатков при попытке разделить и охарактеризовать микроорганизмы из комплексных образцов, таких как культуральные среды, содержащие кровь. Полученные в результате препараты микроорганизмов часто содержат загрязняющие эритроциты, тромбоциты, липидные частицы, плазматические ферменты и клеточный детрит, что может вызвать плохие результаты. Эти способы также являются очень трудоемкими и небезопасными за счет стадий, которые могут привести в результате к аэрозольному воздействию потенциально опасных патогенов на пользователя. Необходимы простые, безопасные и надежные способы выделения микроорганизмов из клинических образцов (например, гемокультуры) и других комплексных образцов, которые свободны от этих интерферирующих материалов и совместимы с технологиями быстрой идентификации.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены способы разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов в образце. Эти способы дают возможность характеристики и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем методы предшествующего уровня техники, приводя в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего или подозреваемого на септицемию) и идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). Стадии, включенные в способы по изобретению, от получения образца для характеристики и/или идентификации микроорганизмов до получения клинически релевантной информации, дающей основания для действий, можно осуществлять в очень короткой временной рамке, например, менее чем примерно за 120 минут.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из тестируемого образца, включающий:

(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в тестируемом образце с получением лизированного образца;

(c) разделение микроорганизмов от других компонентов лизированного образца с образованием изолированного образца микроорганизма;

(d) исследование изолированного образца микроорганизма с помощью масс-спектрометрии для снятия масс-спектра этого микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию этого микроорганизма в изолированном образце путем сравнения измеренного масс-спектра с референсными масс-спектрами и/или с известными или предсказанными массами клеточных компонентов известных микроорганизмов.

Еще в одном другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из гемокультуры, включающий:

(a) получение образца из гемокультуры, о которой известно, что она содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в образце с получением лизированного образца;

(c) наслаивание лизированного образца на плотностный буфер в герметичном контейнере;

(d) центрифугирование контейнера для разделения микроорганизмов от других компонентов образца и образование осадка микроорганизмов;

(e) исследование изолированного образца микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии для снятия масс-спектра этого микроорганизма; и

(f) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения измеренного масс-спектра с референсными масс-спектрами и/или с известными или предсказанными массами клеточных компонентов известных микроорганизмов.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения селективный лизис клеток проводят с помощью лизирующего раствора, дополнительно содержащего композицию ферментов, включающую одну или более чем одну протеиназу и одну или более чем одну нуклеазу.

Еще в одном другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма, включающий:

(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) наслаивание тестируемого образца на плотностный буфер в контейнере;

(c) центрифугирование контейнера для разделения микроорганизмов от других компонентов образца и образование осадка микроорганизмов;

(d) исследование осадка с помощью масс-спектрометрии для снятия масс-спектра этого микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения измеренного масс-спектра с референсными масс-спектрами и/или с известными или предсказанными массами клеточных компонентов известных микроорганизмов.

В одной форме осуществления разделение осуществляют путем наслаивания тестируемого образца на плотностный буфер в контейнере и центрифугирование контейнера для осаждения микроорганизмов, в то время как среда тестируемого образца остается сверху плотностного буфера.

В другой форме осуществления способы включают стадию выделения осадка микроорганизма, ресуспендирования микроорганизма, отбора образца из суспензии и введения в масс-спектрометр и проведения масс-анализа на образце.

В другой форме осуществления способы дополнительно включают стадию выделения осадка микроорганизма, ресуспендирования микроорганизма и проведения дополнительных тестов идентификации или характеристики (например, лекарственной устойчивости, факторов вирулентности, антибиограммы).

Настоящее изобретение более подробно объяснено в графических материалах данной заявки и в приведенном ниже описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 показаны масс-спектры различных микроорганизмов, обработанных и выделенных из гемокультуры.

На фиг.2 показаны масс-спектры пяти изолятов S.aureus, обработанных и выделенных из гемокультуры.

На фиг.3 показано сравнение масс-спектров Е.coli непосредственно с чашек с агаром и Е.coli, обработанной из культуральной среды гемокультуры в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение может быть осуществлено в различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное формами осуществления, изложенными в данной заявке. Вероятнее, эти формы осуществления представлены, чтобы данное описание было более тщательным и полным и полностью передавало объем изобретения специалистам в данной области техники. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одной формы осуществления, могут быть включены в другие формы осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретной формы осуществления, могут быть удалены из этой формы осуществления. Кроме того, различные изменения и дополнения к предложенным здесь формам осуществления, которые не отклоняются от настоящего изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, которое общепринято понимают обычные специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Терминология, используемая в описании изобретения в данной заявке, предназначена только для целей описания конкретных форм осуществления и не предназначена для ограничения изобретения.

Определения

Как используют в данной заявке, единственное число может означать одно или более чем одно. Например, "клетка" может означать единственную клетку или множество клеток.

Как используют в данной заявке, "и/или" также относится к любой или ко всем возможным комбинациям одного или более чем одного из сопутствующих перечисленных пунктов и включает их, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в альтернативе ("или").

Кроме того, термин "примерно", как используют в данной заявке по отношению к измеримому значению, такому как количество соединения или агента по данному изобретению, доза, время, температура и тому подобное, подразумевают как охватывающий вариации ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1% указанного количества.

Как используют в данной заявке, термин "микроорганизм" предназначен для включения организмов, которые являются в целом одноклеточными, которые можно размножать и держать в лаборатории, включающие, но не ограниченные ими, грамположительные или грамотрицательные бактерии, дрожжи, плесневые грибы, паразиты и молликуты. Неограничивающие примеры грамотрицательных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafhia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurella, Providencia и Legionella. Heограничивающие примеры грамположительных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria и Corynebacteria. Heограничивающие примеры дрожжей и плесневых грибов по данному изобретению включают дрожжи и плесневые грибы из следующих родов: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces и Trichosporon. He ограничивающие примеры паразитов по данному изобретению включают паразиты из следующих родов: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca и Naegleria. Heограничивающие примеры молликутов по данному изобретению включают молликуты из следующих родов: Mycoplasma и Ureaplasma.

В одной форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды можно разделить и исследовать, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "разделить" подразумевают как включающий любой образец микроорганизмов, который извлечен, сконцентрирован или иначе удален из его исходного состояния или из ростовой или культуральной среды. Например, в соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть отделены (например, в виде разделенного образца) от не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Этот термин может включать слой микроорганизмов, проложенный между двумя другими слоями, например, микроорганизмы, собранные наверху градиента высокой плотности после центрифугирования, или слой микроорганизмов, собранный на твердой поверхности (например, на мембране фильтра). Этот термин может также включать коллекцию микроорганизмов, которая частично прошла через слой (например, плотностный буфер). Как таковой, разделенный образец микроорганизмов может включать любую коллекцию или слой микроорганизмов и/или их компонентов, которые являются более концентрированными, либо иначе отделенными от исходного образца, и могут находиться в диапазоне от тесно упакованного плотного комка микроорганизмов до диффузного слоя микроорганизмов. Компоненты микроорганизмов, которые могут содержаться в разделенной форме или в образце, включают без ограничения пили, флагеллы, фимбрии и капсулы в любой комбинации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Еще в одной другой форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды могут быть изолированы и исследованы, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "изолированный" предназначен для включения любого образца микроорганизмов, который по меньшей мере частично очищен от его исходного состояния или от ростовой или культуральной среды и любых не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, содержащихся в ней. Например, в соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть изолированы (например, в виде изолированного образца) от не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Еще в одной другой форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды могут быть осаждены и исследованы, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "осадок" предназначен для включения любого образца микроорганизмов, который спрессован или депонирован в массе микроорганизмов. Например, микроорганизмы из образца можно спрессовать или депонировать в массе на дне пробирки центрифугированием или другими способами, известными в данной области техники. Этот термин включает коллекцию микроорганизмов (и/или их компонентов) на дне и/или стенках контейнера после центрифугирования. Компоненты микроорганизмов, которые могут содержаться в осадке, включают без ограничения пили, флагеллы, фимбрии и капсулы в любой комбинации. В соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть осаждены (например, в виде по существу очищенного осадка микроорганизмов) из не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Как используют в данной заявке, термин "плотностный буфер" относится к раствору, имеющему однородную плотность по всему раствору.

В настоящем изобретении предложены способы изоляции, характеристики и/или идентификации микроорганизмов в образце. Кроме того, этот способ может быть, в частности, полезен для разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов из комплексных образцов, таких как культуральная среда, содержащая кровь. Быстрые способы также дают возможность для характеристики и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем методы предшествующего уровня техники, что приводит в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего или подозреваемого на септицемию) и характеристике/идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). Стадии, вовлеченные в способы по изобретению, от получения образца до характеристики/идентификации микроорганизмов, можно осуществлять в очень короткой временной рамке с получением клинически релевантной информации, дающей основания для действий. В некоторых формах осуществления способы по изобретению можно осуществлять менее чем примерно за 120 минут, например, менее чем примерно за 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 минуту. Огромная скорость способов по изобретению представляет усовершенствование по сравнению со способами предшествующего уровня техники. Эти способы можно применять для характеристики и/или идентификации любого микроорганизма, как описано в данной заявке. В одной форме осуществления микроорганизм представляет собой бактерию. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой дрожжи. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой плесневый гриб. В следующей форме осуществления микроорганизм представляет собой паразит. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой молликут. Кроме того, способы по изобретению могут быть полностью автоматизированы, уменьшая за счет этого риск обращения с инфекционными материалами и/или заражения образцов.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из тестируемого образца, включающий:

(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в тестируемом образце с получением лизированного образца;

(c) разделение микроорганизмов от других компонентов лизированного образца с образованием изолированного образца микроорганизма;

(d) исследование изолированного образца микроорганизма с помощью масс-спектрометрии для снятия масс-спектра этого микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию этого микроорганизма в изолированном образце путем сравнения измеренного масс-спектра с референсными масс-спектрами и/или с известными или предсказанными массами клеточных компонентов известных микроорганизмов.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма, включающий:

(a) получение тестируемого образца, известного как содержащий, или который может содержать микроорганизмы;

(b) наслаивание тестируемого образца на плотностный буфер в контейнере;

(c) центрифугирование контейнера для разделения микроорганизмов от других компонентов образца и образование осадка микроорганизмов;

(d) исследование осадка с помощью масс-спектрометрии для снятия масс-спектра этого микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения измеренного масс-спектра с референсными масс-спектрами и/или с известными или предсказанными массами клеточных компонентов известных микроорганизмов.

В другой форме осуществления изобретения способы включают выделение осадка микроорганизмов, образованного во время стадии отделения, или их части из разделительного контейнера перед исследованием микроорганизмов. Например, после образования осадка жидкости можно отсосать от осадка, а осадок ресуспендировать в подходящей среде (например, в среде, в которой микроорганизмы жизнеспособны). Ресуспендированные микроорганизмы можно извлечь из разделительного контейнера. Затем микроорганизмы можно исследовать для характеристики и/или идентификации, например, в суспензии или после того, как они повторно осаждены. В других формах осуществления ресуспендированные микроорганизмы можно исследовать в разделительном контейнере, например, в суспензии или после того, как они повторно осаждены. В следующей форме осуществления микроорганизмы, выделенные из осадка, можно использовать непосредственно для дальнейшего исследования (например, масс-спектроскопией) без ресуспендирования.

Образцы

Образцы, которые можно тестировать (то есть тестируемый образец) способами по изобретению, включают как клинические, так и неклинические образцы, в которых присутствие и/или рост микроорганизма существует, либо его можно подозревать, а также образцы материалов, которые обычно или время от времени тестируют на присутствие микроорганизмов. Количество используемого образца может значительно варьировать в зависимости от универсальности и/или чувствительности способа. Получение образца можно осуществить с помощью любого набора методик, известных специалистам в данной области техники, хотя одно из преимуществ настоящего изобретения состоит в том, что комплексные типы образцов, такие как, например, кровь, жидкости организма и/или другие непрозрачные вещества, можно тестировать непосредственно, используя систему небольшой обработки или без обширной обработки. В одной форме осуществления образец берут из культуры. В другой форме осуществления образец берут из микробиологической культуры (например, гемокультуры). В другой форме осуществления образец подозревают на наличие в нем микроорганизмов, либо оно известно.

Клинические образцы, которые можно тестировать, включают любой тип образца, типично тестируемого в клинических или исследовательских лабораториях, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, сыворотку, плазму, фракции крови, суставную жидкость, мочу, семенную жидкость, слюну, фекалии, цереброспинальную жидкость, содержимое желудка, вагинальные секреции, гомогенаты тканей, пунктаты костного мозга, костные гомогенаты, мокроту, пунктаты, мазки и промывные воды мазков, другие жидкости организма и тому подобное. В другой форме осуществления клинический образец можно культивировать и использовать образец культуры.

Настоящее изобретение находит применение как в исследованиях, так и в ветеринарных и медицинских областях применения. Подходящими субъектами, от которых могут быть получены клинические образцы, обычно являются субъекты млекопитающих, но может быть и любое животное. Термин "млекопитающее", как используют в данной заявке, включает, но не ограничен ими, людей, приматов, не являющихся человеком, крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, кошек, собак, кроликов, грызунов (например, крыс или мышей) и т.д. Субъекты-люди включают новорожденных, детей, подростков, взрослых и пожилых субъектов. Субъекты, от которых могут быть получены образцы, включают без ограничения млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб.

Неклинические образцы, которые можно тестировать, также включают вещества, охватывающие, но не ограниченные ими, пищевые продукты, напитки, фармацевтические препараты, косметические изделия, воду (например, питьевую воду, не питьевую воду и сточные воды), балласты морской воды, воздух, почву, бытовые стоки, растительный материал (например, семена, листья, стебли, корни, цветы, плоды), препараты крови (например, тромбоциты, сыворотку, плазму, фракции лейкоцитов и т.д.), образцы донорских органов или тканей, образцы биологического оружия и тому подобное. Способ также особенно хорошо пригоден для тестирования в реальном времени для мониторинга уровней заражения, контроля процесса, контроля качества и тому подобного в промышленных условиях. В другой форме осуществления неклинический образец можно культивировать и использовать образец культуры.

В одной форме осуществления изобретения образцы получают от субъекта (например, пациента), страдающего или подозреваемого на инфекцию микроорганизмов. В одной форме осуществления субъект страдает или подозреваем на септицемию, например, бактериемию или фунгемию. Образец может представлять собой образец крови непосредственно от субъекта. Образец может быть взят из гемокультуры, выращенной из образца крови пациента, например, гемокультуры BacT/ALERT®. Образец гемокультуры может быть взят из положительной гемокультуры, например, гемокультуры, которая показывает присутствие микроорганизма. В некоторых формах осуществления образец берут из положительной гемокультуры в пределах короткого времени после того, как она оказывается положительной, например, в пределах примерно 6 часов, например, в пределах примерно 5, 4, 3 или 2 часов или в пределах примерно 60 минут, например, примерно 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 минуты. В одной форме осуществления образец берут из культуры, в которой микроорганизмы находятся в log фазе роста. В другой форме осуществления образец берут из культуры, в которой микроорганизмы находятся в стационарной фазе.

Настоящее изобретение обеспечивает высокую чувствительность обнаружения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов. Это дает возможность обнаружения, характеристики и/или идентификации без первоначальной необходимости в прохождении стадий изоляции микроорганизмов путем выращивания их на твердой или полутвердой среде и отбора выросших колоний. Таким образом, в одной форме осуществления изобретения образец не является образцом из колонии микроорганизма (например, бактерии, дрожжей или плесневого гриба), выращенной на твердой или полутвердой поверхности.

Объем образца должен быть достаточно большим, чтобы получить изолированный образец микроорганизмов или осадок микроорганизмов, который можно исследовать после осуществления стадии отделения/изоляции способов по изобретению. Соответствующие объемы будут зависеть от источника образца и предполагаемого уровня микроорганизмов в образце. Например, положительная гемокультура будет содержать более высокий уровень микроорганизмов на объем, чем образец питьевой воды, подлежащий тестированию на заражение, поэтому меньший объем среды гемокультуры может быть необходим по сравнению с образцом питьевой воды. Как правило, размер образца может составлять менее чем примерно 50 мл, например, менее чем примерно 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 или 2 мл. В некоторых формах осуществления размер образца может составлять примерно 1 мл, например, примерно 0,75, 0,5 или 0,25 мл. В некоторых формах осуществления, в которых разделение осуществляют в микромасштабе, размер образца может составлять менее чем примерно 200 мкл, например, менее чем примерно 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 мкл. В некоторых формах осуществления (например, когда ожидают, что образец содержит малое число микроорганизмов), размер образца может составлять примерно 100 мл или более, например, примерно 250, 500, 750 или 1000 мл или более.

Необязательная стадия лизиса

В некоторых формах осуществления после получения образца следующая стадия в способе по настоящему изобретению состоит в селективном лизисе нежелательных клеток, которые могут присутствовать в образце, например, клеток крови и/или клеток ткани. Клетки можно подвергать лизису, чтобы дать возможность отделить микроорганизмы от других компонентов образца. Отделение микроорганизмов от других компонентов предотвращает интерференцию во время стадии исследования. Если не ожидают, что клетки не микроорганизмов присутствуют в образце, или не ожидают, что они интерферируют на стадии исследования, нет необходимости проводить стадию лизиса. В одной форме осуществления клетками, подлежащими лизису, являются клетки не микроорганизмов, которые присутствуют в образце, но клетки микроорганизмов, которые могут присутствовать в образце, не подвергаются лизису. Однако в некоторых формах осуществления селективный лизис определенных классов микроорганизмов может быть желателен, и, следовательно, его можно осуществлять в соответствии со способами, как описанными в данной заявке, так и хорошо известными в данной области техники. Например, класс нежелательных микроорганизмов можно подвергать селективному лизису, например, дрожжи подвергаются лизису, тогда как бактерии не подвергаются, или наоборот. В другой форме осуществления желательные микроорганизмы подвергают лизису с целью отделения конкретного субклеточного компонента микроорганизмов, например, клеточных мембран или органелл. В одной форме осуществления все клетки не микроорганизмов подвергают лизису. В других формах осуществления часть клеток не микроорганизмов подвергают лизису, например, достаточное количество клеток, чтобы предотвратить интерференцию на стадии исследования, лизис клеток можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники как эффективный для селективного лизиса клеток без лизиса или с лизисом микроорганизмов, включающим без ограничения добавление раствора для лизиса, разрушение ультразвуком, осмотический шок, химическую обработку и/или их комбинацию.

Раствор для лизиса является таким, чтобы обладать способностью к лизису клеток, например, клеток не микроорганизмов (например, путем солюбилизации мембран эукариотических клеток) и/или клеток микроорганизмов. В одной форме осуществления раствор для лизиса может содержать один или более чем один детергент и один или более чем один фермент и может, кроме того, включать дополнительные агенты. В одной форме осуществления детергент может представлять собой неденатурирующий литический детергент, такой как Тритон® Х-100, Тритон® X-100-R, Тритон® Х-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® Х-100, Igepal® СА 630, Arlasolve™200, Brij® 96/97, CHAPS (3-[(3-холанидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат), октил-пара-D-глюкопиранозид, сапонин и нонаэтиленгликоля монододециловый эфир (С₁₂Е₉, полидоценол). Необязательно можно включать денатурирующие литические реагенты, такие как додецилсульфат натрия, М-лаурилсаркозин, деоксихолат натрия, желчные соли, гексадецилтриметиламмония бромид, SB3-10, SB3-12, амидосульфобетаин-14 и C₇BzO. Необязательно можно также включать солюбилизаторы, такие как Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Твин® 80, Твин® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, недетергентные сульфобетаины (NDSB 201), амфиполы (PMAL-C8) и метил-β-цикподекстрин. Типично неденатурирующие детергенты и солюбилизаторы используют при концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования (ККМ), тогда как денатурирующие детергенты можно добавлять при концентрациях ниже их ККМ. Например, неденатурирующие литические детергенты можно использовать при концентрации от примерно 0,010% до примерно 10%, например, от примерно 0,015% до примерно 1,0%, например, от примерно 0,05% до примерно 0,5%, например, от примерно 0,10% до примерно 0,30% (конечная концентрация после разведения образцом). В другой форме осуществления могут быть предпочтительны детергенты, представляющие собой полиоксиэтиленовый детергент. Полиоксиэтиленовый детергент может содержать структуру C_12-18/E_9-10, где C_12-18 обозначает длину углеродной цепи от 12 до 18 атомов углерода, а Е_9-10 означает от 9 до 10 оксиэтиленовых гидрофильных концевых групп. Например, полиоксиэтиленовый детергент может быть выбран из группы, состоящей из Brij 97, Bnj 96V, Genapol® C-100, Genapol® Х-100, нонаэтиленгликоля монододецилового эфира (полидоценола) или их комбинации.

Ферменты, которые можно использовать в растворах для лизиса, включают без ограничения ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты и другие вещества, загрязняющие мембрану (например, протеиназу XXIII, ДНКазу, нейраминидазу, полисахаридазу, Glucanex® и Pectinex®). Другие добавки, которые можно использовать, включают без ограничения восстанавливающие агенты, такие как 2-меркаптоэтанол (2-Ме) или дитиотрейтол (DTT), и стабилизирующие агенты, такие как магний, пируват, а также увлажнители. Раствор для лизиса может быть забуферен при любом рН, который пригоден для лизиса желаемых клеток