Средство для индукции иммунитета и способ выявления злокачественной опухоли

Средство для индукции иммунитета и способ выявления злокачественной опухоли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001]

Настоящее изобретение относится к новому, индуцирующему иммунитет средству, используемому в качестве терапевтического средства и/или профилактического средства в случае злокачественной опухоли. Кроме того, настоящее изобретение относится к новому способу выявления злокачественной опухоли.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002]

Злокачественная опухоль (рак) представляет собой наиболее частую причину смерти среди всех причин летального исхода, и проводимая в настоящее время терапия рака в основном включает хирургическое лечение в сочетании с радиотерапией и химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических методов и разработку в последнее время новых противораковых средств результаты лечения рака к настоящему времени в значительной степени не улучшились, за исключением некоторых видов рака. За последнее время за счет достижений в области молекулярной биологии и иммунологии рака были идентифицированы раковые антигены, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, реактивными в отношении рака, а также гены, кодирующие раковые антигены, что дало надежду на возможность антиген-специфической иммунотерапии рака (непатентный документ 1).

[0003]

При проведении иммунотерапии с целью снижения побочных эффектов необходимо, чтобы пептид, полипептид или белок, распознаваемый как антиген, почти не присутствовал в нормальных клетках, и специфически присутствовал в раковых клетках. В 1991 году Boon et al. в институте Людвига в Бельгии (Ludwig Institute, Бельгия) выделили антиген из меланомы человека MAGE 1, который распознается CD8-положительными Т-клетками, используя метод клонирования экспрессируемой кДНК, в котором применяли аутологичную линию раковых клеток и реактивные к раку Т-клетки (непатентный документ 2). После этого с использованием методики SEREX (серологическая идентификация антигенов путем клонирования продуктов рекомбинантной экспрессии), где опухолевые антигены распознаются антителами, продуцируемыми в живом организме пациента со злокачественной опухолью в ответ на собственные раковые клетки пациента, идентифицировали методом клонирования гена с оценкой генной экспрессии (непатентный документ 3, патентный документ 1), и в результате применения этого метода было выделено несколько раковых антигенов (непатентные документы 4-9). С использованием части выявленных мишеней были начаты клинические тесты для разработки иммунотерапии рака.

[0004]

С другой стороны, как и у человека, так и у собак и кошек также известно множество видов опухолей, таких как рак молочной железы, лейкоз и лимфома, и статистика этих заболеваний у кошек и собак достаточно высока. Однако в настоящее время ни для кошек, ни для собак не было разработано ни терапевтического средства, ни профилактического средства, которое было бы эффективным при раке. Большинство опухолей у кошек и собак выявляется их владельцами только после того, как эти виды рака начинают прогрессировать и во многих случаях бывает уже поздно помещать их в клинику для хирургического удаления опухоли или для введения лекарства, применяемого у человека (противораковый препарат и т.п.), так что собаки и кошки зачастую погибают вскоре после начала лечения. В этих условиях следует ожидать, что если будут доступны терапевтические средства и профилактические средства, эффективные для лечения рака у собак и кошек, то можно будет разработать способы их использования применительно к злокачественным опухолям собак.

[0005]

Поскольку раннее выявление рака приводит к лучшим результатам лечения, способ выявления рака, который легко было бы проводить при тестировании сыворотки крови, мочи или т.п. без серьезного физического или экономического ущерба для пациентов со злокачественной опухолью, весьма необходим. В последнее время широко использовались способы, в соответствии с которыми определяли опухолевые продукты, такие как маркеры опухоли, и эти методы использовались с целью диагностики на образцах крови или мочи. Примеры опухолевых продуктов включают опухолевые антигены, ферменты, специфические белки, метаболиты, опухолевые гены, продукты опухолевых генов и гены-супрессоры опухоли, и в некоторых случаях в качестве опухолевых маркеров при диагностике рака использовали эмбриональный опухолевый антиген CEA, гликопротеины CA19-9 и CA125, специфический антиген простаты PSA, кальцитонин, который является пептидным гормоном, продуцируемым в щитовидной железе и т.п. (непатентный документ 10). Однако в случае большинства видов рака опухолевые маркеры, которые были бы применимы для диагностики рака, отсутствуют. Кроме того, поскольку большинство раковых маркеров, известных к настоящему времени, присутствует в жидкостях организма лишь в очень малых количествах (например, порядка пг/мл), их выявление требует высокоспецифичного способа их определения или специальной методики. В этих условиях если иметь новый способ выявления рака, с помощью которого можно было бы обнаруживать различные виды рака при проведении несложных операций, то это позволило бы разработать диагностику различных видов рака.

[0006]

CD179b известен как часть суррогатной легкой цепи иммуноглобулина и экспрессируется на поверхностях мембран предшественников B-клеток (пре-B-клетки и про-B-клетки). Он исчезает при дифференцировке В-клеток и не экспрессируется в зрелых В-клетках. Однако известно, что CD179b экспрессируется в лейкозных клетках (пре-B лейкозные клетки), образуемых при раковом перерождении пре-B-клеток (непатентные документы 10 и 11). Кроме того, известно, что CD179b экспрессируется также в клетках лимфомы (пре-B-клетки лимфомы), образуемых при раковом перерождении пре-В-клеток, и его можно использовать в качестве диагностического маркера для пре-В-клеточной лимфомы (непатентный документ 12). Однако не сообщалось о его специфичной экспрессии в лейкозных клетках, отличных от пре-В-лейкозных клеток, в лимфомах, отличных от пре-В-клеточной лимфомы, в клетках рака молочной железы и т.п. Кроме того, не было сообщений о том, что усиление иммунитета против CD179b полезно при лечении и/или профилактике рака.

ЛИТЕРАТУРА, ИЗВЕСТНАЯ НА НАСТОЯЩИЙ МОМЕНТ

Патентная литература

[0007]

Патентный документ 1: US 5698396 В

Непатентная литература

[0008]

Непатентный документ 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol.24, pp. 551-519

Непатентный документ 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)

Непатентный документ 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995)

Непатентный документ 4: Int. J. Cancer, 72:965-971 (1997)

Непатентный документ 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998)

Непатентный документ 6: Int. J. Cancer, 29:652-658 (1998)

Непатентный документ 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999)

Непатентный документ 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996)

Непатентный документ 9: Hum. Mol. Genet 6:33-39 (1997)

Непатентный документ 10: Adv. Immunol., 63:1-41 (1996)

Непатентный документ 11: Blood, 92:4317-4324 (1998)

Непатентный документ 12: Modern Pathology, 17:423-429 (2004)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

[0009]

Целью настоящего изобретения было обнаружение нового полипептида, пригодного в качестве средства для лечения, и/или профилактики, и/или любого другого воздействия на рак, что позволило бы использовать полипептид в качестве индуцирующего иммунитет средства. Настоящее изобретение также относится к разработке способа выявления рака, пригодного для диагностики рака.

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ УКАЗАННЫХ ПРОБЛЕМ

[0010]

Авторы настоящего изобретения интенсивно изучали по методу SEREX с использованием сыворотки больной собаки, от которой из тканей, пораженных раком молочной железы, была создана библиотека кДНК, где кДНК кодировала белок, который связывается с антителами, имеющимися в сыворотке, полученной от живого организма с опухолью, и на основании кДНК были получены полипептиды собаки CD179b, имеющие аминокислотные последовательности с нечетными номерами SEQ ID NO: 5-95 (что означает SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 91 и 93), приведенными в списке последовательностей. Далее, на основании гомологии полученных генов с человеческим геном, был получен человеческий полипептид CD179b с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и, аналогично, на основании гомологии с бычьим геном, был получен бычий полипептид CD179b с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 95. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что указанные полипептиды CD179b специфически экспрессируются в клетках рака молочной железы, в лейкозных клетках и клетках лимфомы. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при введении указанных CD179b в живой организм в живом организме могут быть индуцированы иммуноциты против CD179b, что может привести к регрессии опухоли в живом организме, экспрессирующем CD179b. Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий полипептид CD179b или его фрагмент, таким образом, чтобы он мог экспрессироваться, индуцирует противоопухолевый эффект против рака, при котором в живом организме экспрессируется CD179b.

[00011]

Далее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что частичный полипептид белка CD179b обладает способностью презентироваться антигенпрезентирующими клетками, что позволяет достичь активации и роста цитотоксических Т-клеток, специфичных для пептида (иммуноиндуцирующая активность), и что, соответственно, такой пептид будет полезен для лечения и/или профилактики рака, и, кроме того, что антигенпрезентирующие клетки, контактирующие с пептидом, и Т-клетки, контактирующие с антиген-презентирующими клетками, могут использоваться для лечения и/или профилактики рака. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что поскольку рекомбинантный полипептид, полученный на основе аминокислотной последовательности указанного выше белка CD179b, специфически реагирует только с сывороткой из имеющего опухоль живого организма, то этот факт может использоваться для выявления рака. На основании указанных выше открытий и было сделано настоящее изобретение.

[0012]

Таким образом, настоящее изобретение характеризуется следующими положениями.

[0013]

(1) Иммуноиндуцирующее средство, включающее в качество эффективного(ых) ингредиента(ов) по меньшей мере один полипептид, выбранный из представленных ниже полипептидов (a)-(c), где полипептид(ы) обладает(ют) иммуноиндуцирующей активностью/активностями, или в качестве эффективного(ых) ингредиента(ов) рекомбинантный(ые) вектор(а), который(ые) включает(ют) полинуклеотид(ы), кодирующий(ие) полипептид(ы), и способен(ны) экспрессировать полипептид(ы) in vivo:

(a) полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательно соединенных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO:3-95, приведенными в списке последовательностей;

(b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с полипептидом (а) и состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот; и

(c) полипептид, включающий полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности.

[0014]

(2) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (1), где полипептид (b) обладает не менее чем 95% идентичностью последовательности с полипептидом (а).

[0015]

(3) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (1), где каждый из полипептидов, обладающий иммуноиндуцирующей(ими) активностью/активностями, представляет собой полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот, в любой из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей, или полипептид, включающий указанный полипептид в качестве своей частичной последовательности.

[0016]

(4) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (1), где каждый из полипептидов, обладающий иммуноиндуцирующей(ими) активностью/активностями, представляет собой полипептид, имеющий любую из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей.

[0017]

(5) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (3), где каждый из полипептидов, обладающих иммуноиндуцирующей(ими) активностью/активностями, представляет собой полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот на участке аминокислот 1-34 или аминокислот 52-75, в любой из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей, или полипептид, включающий указанный полипептид в качестве своей частичной последовательности.

[0018]

(6) Иммуноиндуцирующее средство по пункту (5), приведенному выше, где каждый из полипептидов, обладающий иммуноиндуцирующей(ими) активностью/активностями, представляет собой полипептид, состоящий по существу из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 или SEQ ID NO: 117, приведенных в списке последовательностей; или полипептид, включающий в качестве своей частичной последовательности аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116 или SEQ ID NO: 117, приведенную в списке последовательностей, где указанный полипептид имеет от 8 до 12 аминокислотных остатков.

[0019]

(7) Иммуноиндуцирующее средство по любому из приведенных выше пунктов (1)-(6), включающее один или несколько полипептидов в качестве эффективного(ых) ингредиента(ов).

[0020]

(8) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (7), где полипептид(ы) представляет(ют) собой средство(а) для воздействия на антигенпрезентирующие клетки.

[0021]

(9) Иммуноиндуцирующее средство по любому из пунктов (1)-(8), которое используется для лечения и/или профилактики злокачественной(ых) опухоли(ей) у животных.

[0022]

(10) Иммуноиндуцирующее средство по пункту (9), приведенному выше, где злокачественная(ые) опухоль(и) представляет(ют) собой злокачественную(ые) опухоль(и), экспрессирующую(ые) ген CD179b.

[0023]

(11) Иммуноиндуцирующее средство по приведенному выше пункту (10), где злокачественная(ые) опухоль(и) представляет(ют) собой рак молочной железы, лейкоз и/или лимфому.

[0024]

(12) Иммуноиндуцирующее средство по любому из пунктов (1)-(11), приведенных выше, дополнительно содержащее средство, усиливающее иммунитет.

[0025]

(13) Выделенная антигенпрезентирующая клетка, включающая комплекс, образованный между полипептидом с иммуноиндуцирующей активностью и молекулой HLA.

[0026]

(14) Выделенная Т-клетка, которая селективно связывается с комплексом, образованным между полипептидом с иммуноиндуцирующей активностью и молекулой HLA.

[0027]

(15) Способ индукции иммунитета, включающий введение индивидууму по меньшей мере одного полипептида, выбранного из полипептидов (a)-(c), представленных ниже, где полипептид(ы) обладает(ют) иммуноиндуцирующей(ими) активностью/активностями, или рекомбинантного(ых) вектора(ов), который(ые) включает(ют) полинуклеотид(ы), кодирующий(ие) полипептид(ы), и способен(ны) к экспрессии полипептида(ов) in vivo:

(a) полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей, приведенных в списке последовательностей в виде SEQ ID NO: 3-95 с нечетными номерами;

(b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с полипептидом (а) и состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот; и

(c) полипептид, включающий полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности.

[0028]

(16) Способ выявления злокачественной(ых) опухоли(ей), где указанный способ применяется в отношении образца, выделенного из живого организма, и где указанный способ включает определение экспрессии по меньшей мере одного из полипептидов (a)-(c), представленных ниже:

(a) полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей, приведенных в списке последовательностей в виде SEQ ID NO:3-95 с нечетными номерами;

(b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с полипептидом (а) и состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот; и

(c) полипептид, включающий полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности.

[0029]

(17) Способ по пункту (16), приведенному выше, где указанное определение экспрессии полипептида(ов) проводится путем измерения количества антитела/антител, которые могут содержаться в образце, с использованием иммуноанализа, позволяющего измерять количество антитела/антител, индуцируемых в живом организме против полипептида(ов).

[0030]

(18) Способ выявления злокачественной(ых) опухоли(ей) применительно к образцу, выделенному из живого организма, где указанный способ включает исследование экспрессии гена CD179b, имеющего кодирующий участок, имеющий любую из последовательностей оснований, показанных в виде SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:4-94 с четными номерами в списке последовательностей, в образце, полученном от пациента со злокачественной опухолью, и его сравнение с уровнем экспрессии гена в образце, полученном от здорового индивидуума.

[0031]

(19) Реагент для выявления злокачественной(ых) опухоли(ей), включающий полипептид, который взаимодействует в реакции «антиген-антитело» с антителом, индуцируемым в живом организме против любого из полипептидов (a)-(c), представленных ниже:

(a) полипептид, состоящий из по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей;

(b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с полипептидом (а) и состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот; и

(c) полипептид, включающий полипептид (а) или (b) в качестве своей частичной последовательности.

ЭФФЕКТ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0032]

В настоящем изобретении предлагается новое иммуноиндуцирующее средство, применяемое для лечения или профилактики рака и/или т.п. Как более подробно будет описано в приведенных примерах, введением полипептида по настоящему изобретению животному с опухолью в указанном организме могут быть индуцированы иммуноциты и может быть достигнуто снижение или даже регресс опухоли.

[0033]

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается новый способ выявления рака. Поскольку измерение уровня экспрессии полипептида в образце согласно способу настоящего изобретения позволяет выявить малые, еще незаметные проявления рака, а также те виды рака, которые существуют в глубоких частях тела, то данный способ также применим для раннего выявления рака при медицинском обследовании и в ходе других процедур. Если способ по настоящему изобретению использовать при наблюдении за пациентами после лечения рака, то рецидив рака может быть выявлен на очень ранней стадии. Кроме того, способ по настоящему изобретению позволяет оценивать стадию прогрессирования рака, такую как стадия роста опухоли, стадия инвазии опухоли в окружающие ткани и метастазирование рака в лимфатические узлы и отдаленные органы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0034]

На фиг. 1 показана диаграмма, демонстрирующая картину экспрессии гена, кодирующего CD179b белок в нормальных тканях и линиях опухолевых клеток. График под номером 1 иллюстрирует характер экспрессии гена, кодирующего белок CD179b; а график под номером 2 демонстрирует характер экспрессии гена GAPDH. На фиг. 1 на ординате графика под номером 1 показан характер экспрессии гена, идентифицированного выше, и график под номером 2 отражает характер экспрессии гена GAPDH, взятого в качестве контроля для целей сравнения.

На фиг. 2 абсцисса графиков с номерами 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 показывает способность HLA-A0201-положительных CD8-положительных Т-клеток к продукции IFN-γ за счет стимуляции Т2-клеток после пульсовой обработки пептидами SEQ ID NO:108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 и 117 соответственно. График под номером 11 показывает результат для пептида SEQ ID NO:118, который использовался в качестве отрицательного контроля (пептид, имеющий последовательность, не соответствующую настоящему изобретению).

На фиг. 3 абсциссы графиков 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 и 19 показывают цитотоксическую активность HLA-A0201-положительных CD8-положительных Т-клеток против клеток Namalwa, где указанные клетки были стимулированы с использованием SEQ ID NO: 108, 109, 110, 113, 114, 115, 116 и 117 соответственно. График под номером 20 показывает цитотоксическую активность CD8-положительных Т-клеток, индуцированных с использованием пептида, взятого в качестве отрицательного контроля (SEQ ID NO: 118).

На фиг. 4 абсциссы графиков 21, 22, 23, 24 и 25 показывают способность HLA-A24-положительных CD8-положительных T-клеток к продукции IFN-γ за счет стимуляции JTK-LCL клеток посредством пульсовой обработки пептидами SEQ ID NO: l10, 111, 112, 115 и 116 соответственно. График под номером 26 показывает результат для пептида SEQ ID NO: 118, который использовался в качестве отрицательного контроля.

На фиг. 5 графики с номерами 27, 28, 29, 30 и 31 показывают цитотоксическую активность HLA-A24-проложительных CD8-положительных T-клеток, стимулированных пептидами SEQ ID NO: 110, 111, 112, 115 и 116 соответственно, против JTK-LCL клеток. График под номером 32 показывает цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированных пептидом, использованным в качестве отрицательного контроля (SEQ ID NO: 118).

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0035]

Полипептид

Примеры полипептида, содержащегося в иммуноиндуцирующем средстве по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, включают один или несколько полипептидов, выбранных из полипептидов (a), (b) и (c), приведенных ниже:

(a) полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот в полипептиде, имеющем любую из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей (что означает, соответственно, SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 и 95), который обладает иммуноиндуцирующей активностью;

(b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с полипептидом (а), который состоит по существу не менее чем из 7 аминокислот и обладает иммуноиндуцирующей активностью; и

(c) полипептид, включающий полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности и обладающий иммуноиндуцирующей активностью.

[0036]

В контексте настоящего описания термин «полипептид» означает молекулу, образованную множеством аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями, и включает не только полипептидные молекулы, содержащие большое число аминокислот, составляющих их, но также низкомолекулярные молекулы, содержащие небольшое количество аминокислот (олигопептиды) и молекулы полной длины. Согласно настоящему изобретению белки, состоящие из полноразмерных последовательностей SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 и 95, также входят в его область.

[0037]

В контексте настоящего описания термин «с аминокислотной последовательностью» означает, что аминокислотные остатки сгруппированы в определенном порядке. В этой связи, например, термин «полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3» означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность Leu Leu Arg Pro (snip)... Ala Glu Cys Ser, описываемую в виде SEQ ID NO: 3, где указанный полипептид имеет размер в 176 аминокислотных остатков. Кроме того, например, термин «полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3» может быть также записан в сокращенном виде как «полипептид SEQ ID NO: 3». Это также применимо к термину «с последовательностью оснований».

[0038]

В контексте настоящего описания термин «иммуноиндуцирующая активность» означает способность индуцировать иммуноциты, которые секретируют цитокины, такие как интерферон, в живом организме.

[0039]

Обладает ли полипептид иммуноиндуцирующей активностью, можно определить с использованием, например, известного теста ELISPOT. Более конкретно, например, как будет подробно описано в примерах, клетки, такие как мононуклеарные клетки периферической крови, получают из живого организма и в них вводят полипептид, иммуноиндуцирующую активность которого необходимо определить, и затем эти клетки подвергают совместному культивированию с полипептидом, после чего определяют количество(а) цитокина(ов) и/или хемокина(ов), таких как IFN-γ и/или интерлейкин (IL), продуцируемых клетками, с использованием специфических антител, что позволяет определить количество иммуноцитов в клетках и установить наличие иммуноиндуцирующей активности.

[0040]

Альтернативно, как будет описано в приведенных далее примерах, когда рекомбинантный полипептид, полученный на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, вводят животному с опухолью, размер указанной опухоли может быть снижен или может быть достигнуть регресс опухоли за счет иммуноиндуцирующей активности. Таким образом, указанную выше иммуноиндуцирующую активность можно оценить также как способность подавлять рост раковых клеток, экспрессирующих полипептид SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, или как способность вызывать снижение или удаление раковой ткани (опухоли) (далее обозначаемой как «противоопухолевая активность»). Противоопухолевая активность полипептида может быть подтверждена, например, при определении, снижается ли размер опухоли или она подвергается регрессии, когда полипептид вводят в живой организм с опухолью, как более подробно будет описано ниже в примерах.

[0041]

Альтернативно, противоопухолевую активность полипептида можно оценить также при определении, будут ли стимулированные полипептидом клетки (то есть Т-клетки, приведенные в контакт с антигенпрезентирующими клетками, представляющими полипептид) демонстрировать цитотоксическую активность против опухолевых клеток in vitro. Контакт между Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками может быть достигнут при их совместном культивировании в жидкой среде, как будет описано ниже. Определение цитотоксической активности может быть проведено, например, по известному методу, основанному на тесте по высвобождению ⁵¹Cr, описанному в Int. J. Cancer, 58: p.317, 1994.

[0042]

В тех случаях, когда полипептид используется для лечения и/или профилактики рака, оценка иммуноиндуцирующей активности предпочтительно проводится с использованием противоопухолевой активности в качестве показателя, хотя этот показатель не является ограничивающим.

[0043]

Аминокислотная последовательность, показанная в виде SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 и 95 в списке последовательностей, представляет собой аминокислотную последовательность полипептида, которая связывается в рамках метода SEREX со специфическим антителом, имеющимся в сыворотке, полученной от собаки с опухолью, где используется сыворотка от больной собаки, для которой была создана библиотека кДНК из ткани молочной железы собаки, больной раком, или представляет собой аминокислотную последовательность CD179b, выделенную в качестве гомологичного для человека (гомолог) фактора относительно полипептида (см. пример 1, приведенный ниже). Полипептид (a) представляет собой такой полипептид, который состоит по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот, предпочтительно 8, 9 или не менее чем из 10 последовательных аминокислот в составе полипептида с одной из аминокислотных последовательностей, описанных в виде SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 и 95 в списке последовательностей, и который обладает иммуноиндуцирующей активностью. Как известно в данной области, полипептид, содержащий не менее чем примерно 7 последовательных аминокислотных остатков, может проявлять свои антигенные и иммуногенные свойства. Таким образом, полипептид, содержащий не менее 7 последовательных аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, может обладать иммуноиндуцирующей активностью, и в этой связи может использоваться для получения иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению.

[0044]

Известно, что иммунная индукция, осуществляемая посредством введения антигенного ракового полипептида, основана на следующей последовательности событий: полипептид включается в антигенпрезентирующую клетку и затем разлагается на более мелкие фрагменты пептидазами клетки с последующим презентированием фрагментов на поверхности клетки. Далее, эти фрагменты распознаются цитотоксической Т-клеткой или т.п., которые селективно уничтожают клетки, представляющие антиген. Размер полипептида, представленного на поверхности антигенпрезентирующей клетки, относительно мал и составляет примерно 7-30 аминокислот. В этой связи, с точки зрения возможности представления на поверхности антигенпрезентирующей клетки, предпочтительным вариантом полипептида (а) является полипептид, включающий примерно 7-30 последовательных аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в виде SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, и более предпочтительно полипептид, состоящий из 8-30 или 9-30 аминокислот, является достаточным по размеру для полипептида (a). В некоторых случаях такие относительно малые полипептиды представляются непосредственно на поверхности антигенпрезентирующих клеток без включения их в антигенпрезентирующие клетки.

[0045]

Кроме того, поскольку полипептид, включенный в антигенпрезентирующую клетку, расщепляется пептидазами клетки по случайным сайтам с образованием различных полипептидных фрагментов, которые затем представляются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, введение крупного полипептида, такого как полноразмерный участок SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, неизбежно вызовет образование полипептидных фрагментов при их разложении в антигенпрезентирующей клетке, и эти фрагменты будут эффективны для иммунной индукции, осуществляемой через антигенпрезентирующую клетку. В этой связи для иммунной индукции через антигенпрезентирующую клетку может также использоваться крупный полипептид, и такой полипептид может состоять не менее чем из 30, предпочтительно не менее чем из 100, более предпочтительно не менее чем из 200 аминокислот и еще более предпочтительно такой полипептид может состоять из полноразмерной последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95.

[0046]

Дополнительно, полипептиды по настоящему изобретению можно проверить с использованием соответствующей среды, где можно провести поиск эпитопных пептидов, которые содержат мотивы связывания различных типов HLA и которые состоят из 8-12, предпочтительно из 9-10 аминокислот, например, с использованием программы прогнозирования возможности связывания HLA пептидов (HLA Peptide Binding Predictions) (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html) в разделе биоинфораматики и молекулярного анализа (Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS)), для скрининга пептидов, которые могут представлять собой пептиды эпитопов. Более конкретно, полипептид, состоящий не менее чем из 7 последовательных аминокислот на участке аминокислот l-34 или аминокислот 52-75 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, является предпочтительным и применительно к полипептиду с последовательностью SEQ ID NO: 3 полипептиды с последовательностями SEQ ID NO: 108-117 являются более предпочтительными.

[0047]

Полипептид (b) является таким же полипептидом, что и полипептид (a), за исключением того, что небольшое число аминокислотных остатков в нем было замещено, делетировано, добавлено и/или встроено, и этот полипептид характеризуется идентичностью по аминокислотной последовательности на уровне не менее чем 80%, предпочтительно не менее чем 90%, более предпочтительно не менее чем 95%, еще предпочтительно не менее чем 98%, не менее чем 99% или не менее чем 99,5% относительно исходной последовательности, и указанный полипептид обладает иммуноиндуцирующей активностью. В данной области хорошо известны случаи, когда белковый антиген сохраняет по существу такие же антигенные или иммуногенные свойства, что и исходный белок, даже если аминокислотная последовательность белка была модифицирована за счет замещения, делетирования, добавления и/или встраивания небольшого количества аминокислот. В этой связи, поскольку полипептид (b) может также демонстрировать иммуноиндуцирующую активность, он может использоваться для получения иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению. Кроме того, предпочтительно, полипептид (b) также является таким же полипептидом, что и полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, …, 93 или 95, за исключением того, что один или несколько аминокислотных остатков в нем замещены, делетированы, добавлены и/или встроены.

[0048]

В контексте настоящего описания термин «идентичность последовательности» применительно к аминокислотным последовательностям или к последовательностям оснований обозначает параметр, рассчитанный при выравнивании двух сравниваемых аминокислотных последовательностей (или последовательностей оснований), так чтобы число спариваемых аминокислотных остатков (или оснований) между аминокислотными последовательностями (последовательностями оснований) стало максимальным, с последующим делением количества спариваемых аминокислотных остатков (или количества спариваемых оснований) на общее количество аминокислотных остатков (или на общее количество оснований), и это значение будет представлять собой процент идентичности (%). При проведении выравнивания один или несколько пропусков (гэпов) встраивают в одну или в обе сравниваемые последовательности при необходимости. Такое выравнивание последовательностей может быть проведено с использованием известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997). Когда один или несколько пропусков (гэпов) встраивают, указанное выше общее количество аминокислотных остатков (или общее количество оснований), рассчитывают при рассмотрении одного пропуска как одного аминокислотного остатка (или основания). В том случае, когда рассчитанное таким образом общее количество аминокислотных остатков (или остатков оснований) различается между двумя сравниваемыми последовательностями, идентичность (%) рассчитывается при делении количества спариваемых аминокислотных остатков (или оснований) на общее количество аминокислотных остатков (или общее количество оснований) в более длинной последовательности.

[0049]

При проведении замещений аминокислотных остатков предпочтительны консервативные замещения аминокислотных остатков. 20 типов аминокислот, составляющих природные белки, могут быть распределены по группам, обладающим сходными свойствами, например, по группам, которые включают нейтральные аминокислоты, содержащие боковые цепи с низкой полярностью (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), нейтральные аминокислоты, содержащие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), кислые аминокислоты (Asp, Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys, His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp, His). Известно, что в большинстве случаев замещения аминокислот в пределах одной и той же группы, т.е. консервативные замещения, не меняют свойства полипептида. В этой связи, в тех случаях, когда один или несколько аминокислотных остатков в полипептиде (а) по настоящему изобретению подвергают замещению, вероятность сохранения иммуноиндуцирующей активности может быть повышена при проведении указанного(ых) замещения(ий) в пределах одной группы.

[0050]

Полипептид (c) включает полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности и обладает иммуноиндуцирующей активностью. Таким образом, полипептид (c) содержит одну или несколько других аминокислот или один или несколько других полипептидов, добавленных на одном конце или на обоих концах полипептида (a) или (b), и обладает иммуноиндуцирующей активностью. Такой полипептид может также использоваться для получения иммуноиндуцирующего средства по настоящему изобретению.

Описанные выше полипептиды могут быть синтезированы, например, методом химического синтеза, таким как Fmoc метод (метод с использованием флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc метод (метод с использованием трет-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы в рамках традиционных методик с использованием различных типов коммерчески доступных пептидных синтезаторов. Дополнительно, представляющие интерес полипептиды могут быт