Средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток

Средство для вовлечения происходящей из костного мозга плюрипотентной стволовой клетки в периферический кровоток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Техническая область

Настоящее изобретение относится к средствам, которые вовлекают происходящие из костного мозга плюрипотентные стволовые клетки в периферический кровоток.

Уровень техники

В последние годы было выявлено, что в процессе репарации поврежденных тканей участвуют различные стволовые клетки, и в настоящее время проводится разработка новых регенеративных лекарственных средств, которые индуцируют регенерацию функциональных тканей путем привлечения большого количества стволовых клеток в области повреждения. Для реализации этих новых регенеративных лекарственных средств, (i) стволовые клетки, которые могут быть привлечены в области повреждения, должны присутствовать in vivo в большом количестве; и (ii) должны быть выделены/идентифицированы факторы, которые привлекают стволовые клетки в области повреждения.

Примеры стволовых клеток, которые могут привлекаться в области повреждения, включают тканевые стволовые клетки, присутствующие в области повреждения или в соседних тканях, и происходящие из костного мозга стволовые клетки, присутствующие в периферической крови. В последние годы было описано, что происходящие из костного мозга клетки участвуют во многих типах регенерации поврежденной ткани, однако механизм привлечения происходящих из костного мозга клеток в области повреждения неизвестен. Происходящие из костного мозга клетки, как используют в настоящем документе, отличаются от гемопоэтических стволовых клеток, которые обладают потенциалом к дифференцировке в клетки крови (лейкоциты и эритроциты), и включают стволовые клетки, которым соответствуют клетки, называемые мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга, или клеточными группами предшественников тканей, присутствующими в костном мозге. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга представляют собой недифференцированные стволовые клетки с потенциалом к дифференцировке в остеобласты, адипоциты и хондроциты, и, кроме того, они могут дифференцироваться в другие мезенхимальные клетки, такие как фибробласты, мышечные клетки, стромальные клетки и клетки сухожилий. Недавно было показано, что мезенхимальные стволовые клетки костного мозга дифференцируются в нервные клетки и, кроме того, в эпителиальные клетки (такие как кератиноциты кожи) и сосудисто-эндотелиальные клетки (непатентный документ 9). Клетки-предшественники тканей определяют как недифференцированные клетки, имеющие однонаправленный потенциал к дифференцировке в конкретные ткани/клетки, отличные от тканей/клеток кровеносной системы, и включают недифференцированные клетки с потенциалом к дифференцировке в мезенхимальную ткань, эпителиальную ткань, нервную ткань, паренхиматозные органы и эндотелий сосудов, как упоминалось выше.

HMGB1 (High Mobility Group Box 1: белок 1 группы с высокой подвижностью) представляет собой белок с молекулярной массой приблизительно 25000, который существует практически во всех типах клеток in vivo. Согласно недавним отчетам, известны следующие функции:

1) HMGB1 регулирует экспрессию генов путем внутриклеточного связывания с ДНК для контроля структуры хроматина (непатентный документ 1);

2) HMGB1 секретируется из моноцитов или макрофагов, присутствующих в воспалительных тканях, под действием воспалительных цитокинов TNF-α, IL-1 и LPS, и внеклеточно связывается с RAGE (рецептор для поздних продуктов гликирования) (непатентный документ 2), индуцируя сильные воспалительные реакции (непатентный документ 3);

3) HMGB1 высвобождается из индуцируемых гипоперфузией некротизированных клеток в окружающие ткани (непатентный документ 4);

4) HMGB1 ассоциирован с прогрессированием воспаления у пациентов с септицемией, тяжелым инфекционным заболеванием (непатентный документ 5);

5) введение HMGB1 в области инфаркта в модели инфаркта миокарда обеспечивает деление/пролиферацию стволовых клеток, присутствующих в миокарде, и, таким образом, регенерацию/функциональное восстановление миокарда (патентный документ 1);

6) введение HMGB1 модельному животному с гипоперфузионной печеночной недостаточностью перед индукцией гипоперфузионных состояний смягчает степень нарушения печени (непатентный документ 6);

7) введение HMGB1 в области повреждения в модели повреждения мышц направляет одновременно вводимые клетки-предшественники сосудов в области повреждения, и, таким образом, стимулирует регенерацию мышечной ткани (непатентный документ 7); и

8) HMGB1 индуцирует образование нейритов в нервных клетках (непатентный документ 8). Однако в предыдущих сообщениях не показано, что происходящие из костного мозга стволовые клетки, в частности мезенхимальные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, адипоциты и т.п., привлекаются в поврежденные ткани.

Традиционно полагали, что центральные нервные клетки в головном мозге и спинном мозге не могут регенерировать после повреждения. Однако недавно стало известно о существовании нервных стволовых клеток, и стала возможной индукция этих клеток. Также идентифицирована ниша нервных стволовых клеток в нормальной нервной системе. Таким образом, восстановление поврежденных центральных нейронов, которое долго считали невозможным, в настоящее время считается осуществимым. В настоящее время исследования, связанные с нейрональной регенерацией при повреждении головного и спинного мозга, дегенеративных заболеваниях и т.п., расширяются.

Основными причинами повреждения ткани (клеток) головного мозга являются травматический ушиб головного мозга и ишемические заболевания головного мозга. Другими причинами могут быть повреждение вследствие хирургической операции головного мозга, такой как удаление опухоли головного мозга. В частности, полное удаление нейроглиомы, развившейся из клеток паренхимы головного мозга, является трудным, и нет другого выхода, кроме того, как остановиться на частичном удалении, чтобы избежать повреждения двигательных и речевых функций. Более того, злокачественная нейроглиома имеет плохой прогноз, и ни один из способов лечения, активно исследованных в последние годы, от химиотерапии и лучевой терапии до иммунотерапии/генной терапии, не имел удовлетворительных эффектов. Таким образом, идеальным способом лечения может быть лечение, которое может удалять столько клеток опухоли, сколько возможно, и восстанавливать повреждение функций головного мозга вследствие этого удаления.

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: Публикация патентной заявки Японии Kohyo No. (JP-A) 2005-537253 (нерассмотренная публикация национальной фазы Японии, соответствующая не японской международной публикации)

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Bustin et al., Mol. Cell Biol., 19: 5237-5246, 1999.

Непатентный документ 2: Hori et al., J. Biol. Chem., 270, 25752-25761, 1995.

Непатентный документ 3: Wang et al., Science, 285: 248-251, 1999.

Непатентный документ 4: Muller et al., EMBO J, 20: 4337-4340, 2001.

Непатентный документ 5: Wang et al., Science, 285: 248-251, 1999.

Непатентный документ 6: Germani et al., J. Leukoc. Biol., Jan; 81(1): 41-5, 2007.

Непатентный документ 7: Palumbo et al., J. Cell Biol., 164: 441-449, 2004.

Непатентный документ 8: Merenmies et al., J. Biol. Chem., 266: 16722-16729, 1991.

Непатентный документ 9: Wu Y. et al., Stem. cells, 25: 2648-2659, 2007.

Описание изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Известно, что мезенхимальные стволовые клетки, способные дифференцироваться в костные ткани, хрящевые ткани и жировые ткани, существуют среди стволовых клеток в костном мозге. В последние годы было выявлено, что существуют плюрипотентные стволовые клетки, которые дифференцируются в эпителиальные клетки и нервные клетки.

Тем временем, способы лечения трудноизлечимой язвы кожи включают лечение трансплантацией кожи. Исследования авторов настоящего изобретения показали, что кожа регенерирует посредством реконструкции эпидермиса, дермы, волосяных фолликулов (ткани, образующей волос), и т.п., из происходящих из костного мозга клеток в пересаженной коже после лечения язвы. Таким образом, ожидается, что может быть создан простой и эффективный способ взятия таких популяций клеток со способностью к репарации тканей из костного мозга. Однако до настоящего времени такой способ все еще не разработан.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление способов вовлечения большого количества происходящих из костного мозга плюрипотентных стволовых клеток в периферическую кровь.

Средства для решения задач

Существует возможность, что в процессе приживления пересаженной кожи на биологической ткани в трансплантат кожи привлекаются происходящие из костного мозга клетки из ткани, не являющейся кожей, и, таким образом, участвуют в регенерации ткани кожи. Это предполагает потенциальный механизм вовлечения таких плюрипотентных происходящих из костного мозга клеток в периферическую кровь. Настоящее изобретение обеспечивает вовлечение большого количества происходящих из костного мозга плюрипотентных стволовых клеток в периферическую кровь путем внутривенного введения экстракта ткани кожи или индуктора происходящих из костного мозга плюрипотентных стволовых клеток. Конкретно, с помощью настоящего изобретения впервые в мире выявлено, что

(1) происходящие из ткани костного мозга плюрипотентные стволовые клетки можно индуцировать в периферической крови путем внутривенного введения экстракта ткани, полученного из выделенных фрагментов кожи;

(2) вещество в выделенных фрагментах кожи, которое ответственно за вовлечение происходящих из ткани костного мозга плюрипотентных стволовых клеток в периферическую кровь, представляет собой HMGB1; и

(3) HMGB1, который обладает активностью вовлечения происходящих из костного мозга плюрипотентных стволовых клеток в периферическую кровь, можно легко очищать из культивированных клеток.

Исходя из открытий, описанных выше, настоящее изобретение относится к следующим изобретениям:

[1] средство для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое вводят в кровеносный сосуд или мышцу и которое содержит любой из компонентов:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

[2] средство для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое продуцируют способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель, и которое вводят в кровеносный сосуд или мышцу;

[3] средство для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое вводят в кровеносный сосуд или мышцу и которое содержит гепарин-связывающую фракцию, полученную способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

[4] способ оценки того, содержится ли фактор, который вовлекает клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, в экстракте клетки или ткани, и, когда активность вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга на стадии (b) превышает активность контроля, определения того, что фактор содержится в экстракте клетки или ткани, где способ включает стадии, указанные ниже:

(a) получение экстракта клетки; и

(b) измерение активности вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга в экстракте, полученном на стадии (a);

[5] способ скрининга экстракта клетки или ткани, содержащего фактор, который вовлекает клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, который включает стадии

(a) оценки множества экстрактов способом согласно [4] в отношении того, содержится ли в экстракте фактор, который вовлекает клетку костного мозга в периферическую кровь; и

(b) выбора экстракта, который согласно оценке на стадии (a) содержит фактор, который вовлекает клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга;

[6] способ идентификации фактора, вовлекающего клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, который включает стадию очистки фактора, вовлекающего клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, из экстракта, который определен как содержащий фактор, вовлекающий клетку костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, способом согласно [4] или [5], с использованием активности вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга в качестве индикатора;

[7] набор для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, содержащий композицию, подлежащую введению в кровеносный сосуд или мышцу, и который содержит любое из веществ:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

[8] набор для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, содержащий экстракт клетки или ткани, подлежащий введению в кровеносный сосуд или мышцу и который получают способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель;

[9] набор для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, содержащий гепарин-связывающую фракцию, подлежащую введению в кровеносный сосуд или мышцу и которую получают способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

[10] способ вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, включающий стадию введения в кровеносный сосуд или мышцу любого из следующих веществ:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

[11] способ вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, который включает стадию введения в кровеносный сосуд или мышцу экстракта клетки или ткани, полученного способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель;

[12] способ вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, включающий стадию введения в кровеносный сосуд или мышцу гепарин-связывающей фракции, полученной способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

[13] применение любого из следующих веществ (a)-(i) при изготовлении средства для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое вводят в кровеносный сосуд или мышцу:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

[14] применение экстракта клетки или ткани, полученного способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель, для получения средства для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое подлежит введению в кровеносный сосуд или мышцу;

[15] применение гепарин-связывающей фракции, полученной способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

для получения средства для вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое подлежит введению в кровеносный сосуд или мышцу;

[16] любое вещество из следующих:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, которая секретирует белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, которая секретирует белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, которая секретирует белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, кодирующая белок HMGB3;

которое используют в способе вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которое подлежит введению в кровеносный сосуд или мышцу;

[17] экстракт клетки или ткани, получаемый способом, включающим стадию погружения клетки или ткани в растворитель, который используют в способе вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга и который подлежит введению в кровеносный сосуд или мышцу; и

[18] гепарин-связывающая фракция, полученная способом, включающим стадии

(a) погружения клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирования иммобилизованного гепарина с экстрактом, полученным на стадии (a); и

(c) элюирования гепарин-связывающей фракции с иммобилизованного гепарина;

которую используют в способе вовлечения клетки костного мозга в периферическую кровь из костного мозга и которая подлежит введению в кровеносный сосуд или мышцу.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлена схема, на которой показан экспрессирующий вектор HMGB1.

На фиг.2 представлена схема, на которой показано введение экстракта кожи (SE) мыши через хвостовую вену с последующим сбором периферической крови.

На фиг.3 представлена схема фракционирования проточной цитометрией фракции мононуклеарных клеток периферической крови мыши, флуоресцентно меченных антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши через 12 часов после введения экстракта кожи (SE). Верхние три диаграммы соответствуют группе введения PBS (n=3) в качестве отрицательного контроля, а нижние три диаграммы соответствуют группе введения экстракта кожи (SE) (n=3). Вертикальная ось указывает на уровень экспрессии CD44, а горизонтальная ось указывает на уровень экспрессии PDGFRα. Область, заключенная в рамку, соответствует популяции двойных положительных по CD44 и PDGFRα клеток. Популяция была увеличена в группе введения экстракта кожи (SE) по сравнению с группой введения PBS.

На фиг.4 представлена схема введения HMGB1 мыши через хвостовую вену с последующим взятием периферической крови.

На фиг.5 представлена схема, на которой показано фракционирование проточной цитометрией фракции мононуклеарных клеток периферической крови, флуоресцентно меченных антителом против PDGFRα мыши и антителом против CD44 мыши через 12 часов после введения HMGB1. Левая диаграмма соответствует мышам, которым вводили PBS в качестве отрицательного контроля, а правая диаграмма соответствует мышам, которым вводили HMGB1. Вертикальная ось указывает на уровень экспрессии CD44, а горизонтальная ось указывает на уровень экспрессии PDGFRα. Область, заключенная в рамку, соответствует популяции двойных положительных по CD44 и PDGFRα клеток. У мышей, которым вводили HMGB1, популяция была увеличена по сравнению с мышами, которым вводили PBS.

На фиг.6 представлен набор фотографий, на которых показана детекция вестерн-блоттингом семейства HMGB в экстракте кожи новорожденной мыши.

На фиг.7 представлен набор фотографий результатов вестерн-блоттинга для семейства очищенных рекомбинантных слитых белков метка Flag-HMGB, экспрессированных в клетках HEK293.

На фиг.8 представлен набор графиков, на которых показана активность рекомбинантного HMGB1/HMGB2/HMGB3 в отношении миграции костномозговых мезенхимальных стволовых клеток с использованием камеры Бойдена. Все рекомбинантные белки показали более высокую активность в отношении миграции по сравнению с контрольными группами.

На фиг.9 представлен набор графиков, на которых показан результат лечения в модели лечения кожных язв у мышей с использованием белков семейства HMGB. Все из HMGB1, HMGB2 и HMGB3 показали значимые эффекты в отношении снижения площади язвы по сравнению с контрольными группами.

На фиг.10 представлена фотография, на которой показана активность HMGB1 человека и экстракта кожи человека в отношении индукции миграции происходящих из костного мозга человека мезенхимальных стволовых клеток, подтвержденная с использованием камеры Бойдена.

На фиг.11 представлен набор фотографий, на которых показана активность активаторов, очищенных на колонке с гепарином, из экстрактов сердца, головного мозга и кожи мыши в отношении индукции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, подтвержденная с использованием камеры Бойдена.

На фиг.12 представлен набор фотографий, на которых показана активность экстракта культивированной клеточной линии HEK293 и экстракта HeLa в отношении индукции миграции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека, подтвержденная с использованием камеры Бойдена. Обе культивированные клеточные линии показали хемотаксическую активность в отношении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека.

На фиг.13A представлена фотография, на которой показана мышь, фиксированная к стереотаксическому устройству для головного мозга с разрезом головы по средней линии скальпелем, с последующей трепанацией с использованием бура. На фиг.13B представлена фотография, на которой показан головной мозг, к которому применяют отрицательное давление с использованием шприца для отсасывания части ткани головного мозга. На фиг.13C представлена фотография мыши после инъекции 5 мкл очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, растворенного в фибриновом адгезивном составе (фибриноген), и последующей инъекции 5 мкл состава фибринового клея (тромбин). На фиг.13D и 13E представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 2 недели после лечения. Более высокое накопление положительных по GFP клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на E, по сравнению с контролем, на D. На фиг.13F и 13G представлены фотографии модели повреждения головного мозга, полученные через 6 недель после лечения. Более высокое накопление GFP-положительных клеток наблюдали в группе лечения с использованием очищенной на колонке с гепарином фракции экстракта кожи, на G, по сравнению с контролем, на F.

На фиг.14A представлена диаграмма результата проточной цитометрии, на которой показано присутствие клеток, имеющих CD44 и PDGFRα. Введение HMGB1 приводило к увеличению популяций как двойных положительных по PDGFRα и CD44 клеток, так и положительных PDGFRα, отрицательных по CD44 клеток, в периферической крови. На фиг.14B и 14C представлены результаты сравнения между группами введения PBS и HMGB1 в отношении присутствия двойных положительных по PDGFRα и CD44 клеток, положительных по PDGFRα и отрицательных по CD44 клеток в периферической крови соответственно. Обе популяции клеток были на статистически значимом уровне увеличены в группе введения HMGB1.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам для вовлечения клеток костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, включающим один из следующих ингредиентов (a)-(i), которые подлежат введению в периферическую кровь или мышцу:

(a) белок HMGB1;

(b) клетка, секретирующая белок HMGB1;

(c) вектор, в который встроена ДНК, которая кодирует белок HMGB1;

(d) белок HMGB2;

(e) клетка, секретирующая белок HMGB2;

(f) вектор, в который встроена ДНК, которая кодирует белок HMGB2;

(g) белок HMGB3;

(h) клетка, секретирующая белок HMGB3; и

(i) вектор, в который встроена ДНК, которая кодирует белок HMGB3.

При введении описанных выше фармацевтических средств в кровеносный сосуд или мышцу стволовые клетки ткани костного мозга вовлекаются в периферический кровоток, и, таким образом, можно стимулировать регенерацию поврежденной ткани. Кроме того, помимо применения указанного выше фармацевтического средства в качестве индуктора/промотора функциональной регенерации ткани, ожидается его применение в качестве так называемого профилактического лекарственного средства, которое предотвращает повреждение функций ткани/органа, вызываемое уменьшением количества тканевых стволовых клеток, или в качестве лекарственного средства против старения, которое замедляет прогрессирование связанных с возрастом изменений.

Альтернативно такое лечение можно осуществлять введением указанного выше фармацевтического средства, сбором и концентрированием плюрипотентных стволовых клеток, вовлеченных в периферическую кровь из организма, и введением клеток в области повреждения. Общепринятая терапия с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга является инвазивной, поскольку клетки отбирают из костного мозга, расположенного глубоко в организме. Тем временем, с использованием фармацевтических средств по настоящему изобретению, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга можно собирать из периферической крови менее инвазивным способом и использовать для трансплантации клеток или сходных с ней.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам для вовлечения клеток костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которые содержат экстракты клеток или тканей, подлежащие введению в кровеносный сосуд или мышцу, и которые получают способами, включающими стадию погружения клеток или тканей в растворитель.

Клетки или ткани, подлежащие погружению в растворитель, конкретно не ограничены, но включают, например, происходящие из ткани клетки, клетки клеточных линий, полученных из происходящих из ткани клеток (включая, но не ограничиваясь ими, например, HeLa и HEK293), выделенные клетки, невыделенные клетки (например, клетки в выделенных тканях) и клетки, трансфицированные ДНК, кодирующей белок HMGB1, HMGB2 или HMGB3. В качестве описанной выше ткани можно использовать любую ткань. Например, такие ткани включают, но не ограничиваются ими, живые ткани кожи или ткани, полученные внутренней биопсией (хирургической операцией) (такие как головной мозг, легкое, сердце, печень, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, почка, мочевой пузырь, селезенка, матка, семенники и кровь).

Примеры указанного выше растворителя включают, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, PBS (фосфатно-солевой буфер) и TBS (забуференный солевой раствор Tris). Более того, время погружения клеток или ткани в растворитель должно иметь продолжительность, необходимую и достаточную для индукции некроза клеток, т.е. от 1 часа до 48 часов (например, от 6 до 48 часов), и предпочтительно от 12 до 24 часов, но оно не ограничивается этим. Таким образом, "стадию погружения клеток в растворитель" можно перефразировать как "стадию погружения клеток в растворитель на период времени, необходимый и достаточный для индукции некроза" или "стадию обеспечения некроза клеток". Более того, примеры температуры для погружения клеток или ткани в растворитель включают, но не ограничиваются этим, от 4°C до 25°C (например, от 4°C до 8°C), и предпочтительно 4°C. Кроме того, примеры pH для погружения клеток или ткани в растворитель включают, но не ограничиваются этим, pH от 7 до 8, предпочтительно pH 7,5. Примеры буфера включают, но не ограничиваются этим, фосфатно-солевой буфер в концентрации от 10 мМ до 50 мМ, предпочтительно от 10 до 20 мМ.

Более того, в настоящем изобретении, после погружения клеток или тканей в растворитель их можно извлекать из растворителя, содержащего их. Способ извлечения клеток или тканей из растворителя конкретно не ограничен, при условии, что способ хорошо известен специалистам в данной области. Например, клетки или ткани можно удалять из растворителя центрифугированием при гравитационном ускорении от 10 G до 100000 G (например, 440 G) при от 4°C до 25°C (например, 4°C) с последующим отделением супернатанта, однако способ удаления не ограничивается этим способом. Супернатант можно использовать в качестве экстракта клеток или тканей.

Экстракты клеток или тканей по настоящему изобретению, полученные способами, включающими стадию погружения клеток или тканей в растворитель, включают, например, но не ограничиваются ими, экстракт кожи и экстракт мононуклеарных клеток периферической крови (экстракт периферической крови).

Экстракт периферической крови получают следующим способом: после сбора крови шприцом или сходными с ним, клетки замораживают в морозильной камере или в жидком азоте, на сухом льду, или сходными способами, а затем размораживают при температуре 0°C или более. Затем для удаления нерастворимых клеточных компонентов образец центрифугируют, например, при силе тяжести от 10 до 100000 G (например, при 440 G) и при от 4°C до 25°C (например, при 4°C) и полученный супернатант собирают. Нерастворимые клеточные компоненты можно удалять из растворителя способом, описанным выше. Однако способы удаления нерастворимых клеточных компонентов не ограничены указанным выше примером. Полученный супернатант можно использовать в качестве экстракта клеток или тканей. Альтернативно вместо центрифугирования нерастворимые клеточные компоненты можно удалять фильтрацией через фильтр из нитроцеллюлозы с микропорами 0,45 мкм, или т.п. Альтернативно, собранной периферической крови можно позволять стоять в течение от трех до 48 часов при 4°C для индукции некроза клеток. При такой обработке из клеток периферической крови могут высвобождаться внутриклеточные компоненты. Затем, для удаления из растворителя нерастворимых клеточных компонентов, образец центрифугируют при силе тяжести от 10 до 100000 G (например, при 440 G), и полученный супернатант собирают. Нерастворимые клеточные компоненты можно удалять из растворителя способом, описанным выше, но не ограничиваясь им. Полученный супернатант можно использовать в качестве экстракта клеток или тканей. Альтернативно вместо центрифугирования нерастворимые клеточные компоненты можно удалять фильтрацией через фильтр из нитроцеллюлозы с микропорами 0,45 мкм или т.п.

Тем временем экстракты из мононуклеарных клеток периферической крови получают следующим способом: проводят взятие цельной периферической крови с использованием шприца или сходных с ним, а затем весь образец разбавляют вплоть до 4 мл посредством PBS. После помещения 3 мл Ficoll-Paque Plus (GE) в центрифужную пробирку разбавленную кровь наслаивают на слой Ficoll. Пробирку центрифугируют при 400 G и 18°C в течение 40 минут. Полученный средний слой, содержащий мононуклеарные клетки, переносят в свежую центрифужную пробирку и в нее добавляют 45 мл PBS. Образец центрифугируют при 800 G и 18°C в течение пяти минут и полученный супернатант удаляют. К клеткам снова добавляют 45 мл PBS и образец центрифугируют при 800 G и 18°C в течение пяти минут. Полученный супернатант удаляют. К осажденным клеткам добавляют 200 мкл PBS и их суспендируют. Суспензии клеток позволяют стоять при -80°C в морозильной камере в течение 30 минут. Замороженную суспензию извлекают из морозильной камеры и размораживают на льду. Обработку замораживанием-размораживанием повторяют три раза. Затем образец центрифугируют при 800 G и 4°C в течение 15 минут и супернатант собирают. Альтернативно вместо замораживания клеток образцу клеток можно позволять стоять при 4°C в течение от трех до 48 часов для индукции некроза клеток. Посредством этой обработки можно высвобождать внутриклеточные компоненты. Альтернативно клетки можно разрушать обработкой ультразвуком при охлаждении на льду. Посредством этой обработки можно высвобождать внутриклеточные компоненты. В любом случае после высвобождения внутриклеточных компонентов из клеток образец центрифугируют при силе тяжести от 440 до 1000000 G, предпочтительно от 20000 до 100000 G. Полученный супернатант собирают в качестве экстракта клеток. Альтернативно вместо центрифугирования нерастворимые компоненты можно удалять фильтрацией через фильтр из нитроцеллюлозы или ацетата целлюлозы с микропорами 0,45 мкм или т.п. Полученный фильтрат используют в качестве экстракта клеток.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим средствам, подлежащим введению в кровеносный сосуд или мышцу, для применения для вовлечения клеток костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, включающим гепарин-связывающую фракцию, продуцируемую способом, который включает следующие стадии:

(a) погружение клетки или ткани в растворитель;

(b) контактирование экстракта, полученного на стадии (a), с иммобилизованным гепарином; и

(c) элюирование гепарин-связывающей фракции (также она может называться очищенной гепарином фракцией или очищенной на колонке с гепарином фракцией) с иммобилизованного гепарина.

"Иммобилизованный гепарин" относится к гепарину, ковалентно связанному с нерастворимым носителем. Примеры нерастворимого носителя включают, но не ограничиваются ими, гранулы сефарозы (такие как сефароза 4B, сефароза 6B и т.п.: GE Healthcare). В настоящем изобретении также можно использовать коммерчески доступный иммобилизованный гепарин (колонка Hitrap Heparin HP: GE Healthcare).

Примеры условий для контактирования экстракта клеток или тканей с иммобилизованным гепарином включают, но не ограничиваются ими, pH приблизительно от 7 до 8 (предпочтительно pH 7,5) и концентрацию соли от 0 до 200 мМ, предпочтительно приблизительно от 100 до 200 мМ. Время, в течение которого экстракт контактируют с иммобилизованным гепарином, конкретно не ограничено, однако контакт предпочтительно продолжается в течение 5 минут или более для достаточной адсорбции гепарин-связывающей фракции на иммобилизованный гепарин. Примеры температуры включают, но не ограничиваются ими, от 4 до 8°C, предпочтительно 4°C. Кроме того, примеры условий элюирования гепарин-связывающей фракции, адсорбированной на иммобилизованный гепарин, включают, но не ограничиваются ими, pH приблизительно от 7 до 8 и концентрацию соли от 200 до 1000 мМ (предпочтительно приблизительно 1000 мМ).

При введении в кровеносный сосуд или мышцу фармацевтические средства, содержащие экстракт или фракцию, описанную выше, вовлекают стволовые клетки ткани костного мозга в периферический кровоток и могут стимулировать регенерацию поврежденных тканей. Более того, предполагается, что описанные выше фармацевтические средства можно использовать не только в качестве индукторов/промоторов для функциональной регенерации ткани, но также в качестве так называемого профилактического лекарственного средства для профилактики функционального нарушения тканей/органов, вызываемого уменьшением количества тканевых стволовых клеток, или лекарственного средства против старения для замедления прогрессирования связанных со старением изменений.

Альтернативно такое лечение можно осуществлять введением указанного выше фармацевтического средства, сбором и концентрированием плюрипотентных стволовых клеток, вовлеченных в периферическую кровь из организма, и затем введением клеток в области повреждения. Общепринятая терапия с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга является инвазивной, поскольку клетки собирают из костного мозга, расположенного глубоко в организме. Тем временем, с использованием фармацевтических средств по настоящему изобретению, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга можно собирать из периферической крови менее инвазивным способом и использовать для трансплантации клеток или сходных с ней.

Настоящее изобретение относится к наборам для вовлечения клеток костного мозга в периферическую кровь из костного мозга, которые состоят из к