Метод иммунотерапии онкологических заболеваний и фармацевтические композиции на основе онкологического вируса сендай

Метод иммунотерапии онкологических заболеваний и фармацевтические композиции на основе онкологического вируса сендай

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области вирусологии, иммунологии и онкологии, в частности к созданию фармацевтических композиций, предназначенных для лечения онкологических заболеваний, и способам лечения онкологических заболеваний, а так же иммунопрофилактики метастазирования. Конкретно настоящее изобретение относится к созданию терапевтической фармацевтической композиции на основе вируса Сендай штамм Москва РТА-13024, эффективной при лечении и иммунопрофилактике пациентов, страдающих злокачественными онкологическими заболеваниями.

Предшествующий уровень техники

Во многих случаях метастатический рак остается неизлечимым заболеванием и, следовательно, необходима разработка новых терапевтических противораковых методов и новых методов воздействия на метастазы. Идея применения вирусов для лечения злокачественных заболеваний не является новой. Ее возникновение относят к началу XX века, когда было замечено, что у некоторых пациентов происходит спонтанная регрессия опухоли после вирусного заболевания или вакцинаций живым вирусом (1), (2). В онкологию был введен термин "онколитический вирус" для вирусов, способных специфично разрушать злокачественные клетки и оставлять невредимыми нормальные. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток происходит за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках либо же опосредовано иммунной системой, простимулированной вирусом.

Настоящее изобретение относится к онколитическому вирусу Сендай, принадлежащему к семейству Paramyxoviridae. Среди представителей этого семейства были исследованы в качестве противораковых агентов ослабленные штаммы вирусов: кори (3) (4) и эпидемического паротита, а также различные патогены животных, такие как вирус болезни Ньюкасла. Ослабленный штамм вируса кори продемонстрировал сильную противоопухолевую активность в ряде модельных систем (5) (6), (7), (8), (9), (10) (10), (11), (12) (13) (14), где использовали различные пути введения вируса (внутриопухолевый, внутривенный (в/в), интраперитонеальный (и/п) или интраплевральный) при однодозовой или мультидозовой схеме введения (5). У получавших лечение животных в опухолях наблюдали признаки, характерные для цитопатогенного действия, включая образование скоплений многоядерных клеток, за которыми следовала гибель опухолевых клеток, инфицированных вирусом кори.

Противораковая активность вируса Сендай.

В мировой практике противораковое действие вируса Сендай, также известного как вирус парагриппа мышей 1 типа, или гемагглютинирующий японский вирус, еще только начинают исследовать. Этот парамиксовирус (семейство Paramyxoviridae) принадлежит к роду Respirovirus. Геном вируса представлен минус цепью РНК длиной 15,3 Кб. Всего у вируса выявляется шесть генов, кодирующих белки. Из них два кодируют поверхностные гликопротеины HN и F, три кодируют нуклеокапсиды: белки NP, Р и L, и один негликозилированный внутренний белок М. вируса Сендай вызывает легко передающуюся инфекцию дыхательных путей у мышей, хомяков, морских свинок, крыс и иногда - у свиней (25). Вирус Сендай способен распространятся как через воздух, так и при непосредственном контакте. Его можно обнаружить в колониях мышей по всему миру, но считается, что он совершенно безопасен для людей (25). В США вирус Сендай был одобрен соответствующим агентством, ответственным за безопасность питания и лекарств (FDA), для проведения клинического испытания с участием людей для профилактики педиатрического заболевания, вызываемого вирусом парагриппа 1 типа. Испытание показало, что интраназальное введение вируса Сендай хорошо переносилось и продемонстрировало признаки иммуногенности против вируса парагриппа 1 типа (26).

Ряд работ, проведенных в Японии, показал, что ослабленный генно-инженерными методами непатогенный для грызунов вирус может интенсивно распространяться в опухолевых клетках, не затрагивая окружающие их нормальные клетки. Такое распространение часто приводит к ингибированию роста опухолей у мышей. Среди протестированных ксенотрансплантационных моделей опухолей человека были клетки фибросаркомы, панкреатической эпителиоидной карциномы и клетки рака толстой кишки (27). Также на мышиных моделях с применением другой конструкции вируса Сендай было продемонстрировано существенное подавление роста опухоли, и даже полное рассасывание сформировавшихся опухолей мозга (28). Сходные результаты были получены в случае ксенотрансплантации мышам клеток саркомы и рака простаты человека (29) (30). На крысиных ксенотрансплантационных моделях было показано, что рекомбинантный вирус Сендай с высокой частотой уничтожает человеческие опухоли меланомы, гепатоцеллюлярного рака, нейробластомы, плоскоклеточного рака и рака простаты (31). На мышиных сингенных моделях было показано, что даже после инактивации УФ вирус Сендай эффективен против карциномы толстой кишки (32) (33) и карцином почки (34). На мышиной ксенотрансплантационной модели человеческого рака простаты было также показано, что после инактивации УФ вирус Сендай может быть эффективен (35). Во всех указанных исследованиях вирус Сендай приводил к полной регрессии опухолей или к серьезному подавлению их роста.

Кратковременная ремиссия после внутривенной инъекции живого вируса Сендай была описана у пациента с острой лейкемией еще в 1964 году (36).

Механизмы противоракового действия вируса Сендай.

1. Прямое уничтожение злокачественных клеток:

а) Повреждение интерфероновой и апоптической систем клеток.

Хорошо известно, что по мере усиления прогрессии опухоли накапливаются мутации, способствующие повреждению интерфероновой и апоптической (апоптоз-запрограммированная клеточная гибель) систем клеток. В результате раковые клетки теряют способность отвечать на антипролиферативные сигналы, индуцированные интерфероном. Они также теряют способность уходить в апоптоз, несмотря на принимаемые клеткой сигналы. Эти нарушения ведут к прогрессии злокачественного образования и росту опухоли.

Те же самые клеточные нарушения, которые способствуют росту опухоли, вирус Сендай может использовать для собственной репликации, что приводит к более широкомасштабной гибели злокачественных клеток по сравнению с нормальными клетками.

б) Образование синцития из злокачественных клеток. У некоторых представителей парамиксовирусов, в частности у вируса Сендай, развился механизм распространения инфекции, который включает слияние инфицированных и неинфицированных клеток. Такое слияние приводит к образованию синцития, который представляет собой крупную многоядерную клеточную структуру. Инфицированные клетки могут сливаться и образовывать синцитий с 50-100 соседними клетками (5). Инфицирование новых клеток-хозяев путем их слияния делает возможным распространение вирусной инфекции без высвобождения вируса из инфицированных клеток. Следовательно, способность образовывать синцитий является одной из стратегий, используемых вирусом для избегания воздействия нейтрализующих антител хозяина, которые могли бы его инактивировать. В системе in vivo синцитий обычно существует не более 4-5 дней. В настоящее время предполагается, что способность некоторых вирусов индуцировать образование синцития и их онколитический потенциал взаимосвязаны. В поддержку этой гипотезы свидетельствуют следующие факты.

С помощью генной инженерии гены, которые кодируют белки слияния, необходимые для процесса образования синцития, можно перенести из вируса одного типа в другой. Показано, что такой перенос придает онколитический потенциал вирусам, которые до этого не обладали таким потенциалом (37) (38). Этот потенциал можно было дополнительно повысить с помощью аминокислотных замен, приводящих к созданию более активных белков с увеличенной способностью вызывать слияние клеток (39) (40). Даже плазмиды (41) (42) (43) или вирусные векторы (44) (45) (46), кодирующие мембранные гликопротеины со сходной функцией, были способны вызывать существенную регрессию опухолей.

2. Уничтожение злокачественных клеток посредством специфического противоопухолевого иммунитета:

а) Нейраминидаза (НА) парамиксовирусов удаляет сиаловые кислоты с поверхности злокачественных клеток. Многие опубликованные работы продемонстрировали, что повышенный уровень сиалирования мембран клеток связан с процессом их малигнизации: с клеточным инвазивным и метастатическим потенциалом (47) (48) (49) (50) (51) (52) (53).

Исследования, проведенные с использованием некоторых ингибиторов сиалирования, показали снижение злокачественности раковых клеток (54) (55). (56).

Возможно, сиалирование развилось как механизм, способствующий избеганию злокачественными клетками иммунологического надзора организма хозяина путем обеспечения клеточной поверхности толстой "оболочкой", которая скрывает раковые антигены. Было показано, что десиалирование опухолевых клеток снижает их потенциал роста посредством активации натуральных клеток-киллеров (НК). Более того, обработанные сиалидазой опухолевые клетки лучше активируют секрецию ИНФ-гамма НК-клетками. Показано, что активность и цитотоксичность НК-клеток зависит от экспрессии специфичных для поверхности опухолевых клеток сиаловых кислот (57).

Гемагглютинин-нейраминидаза (ГН) - это белок со способностью вызывать гемагглютинацию, а также с ферментативной активностью. Нейраминидазы (НА) - это часть молекулы ГН, которая является ферментом (сиалидазой) и расщепляет сиаловую кислоту на поверхности клетки. НА можно обнаружить у некоторых представителей онколитических парамиксовирусов: вируса болезни Ньюкасла, вируса Сендай и вируса эпидемического паротита (58), (59). НА распознает рецепторы на поверхности клетки, которые представляют из себя полимеры сиаловой кислоты. НА также способствует слиянию клеток, что помогает вирионам-потомкам распространяться, избегая взаимодействия с антителами хозяина. НА также способна удалять остатки сиаловой кислоты с поверхности злокачественных клеток (59), (60). Было показано, что такое удаление может приводить к существенному изменению способности клеток В-лимфомы стимулировать цитолитические Т-лимфоциты. Был проведен эксперимент с тремя различными типами сиалидаз, из них одна являлась НА вируса болезни Ньюкасла (60). Показано, что НА вируса болезни Ньюкасла может расщеплять 2,3- и 2,6- (61) и 2,8-связи между остатками сиаловой кислоты (62). Также было показано, что в системе in vitro не наблюдается существенного различия в специфичности по отношению к субстрату расщепления между вирусом болезни Ньюкасла, вирусом Сендай и вирусом эпидемического паротита (63). Данные наблюдения позволяют предположить, что злокачественные клетки становятся десиалированными после обработки опухоли вирусом Сендай и этот процесс вносит вклад в усиление противоопухолевого иммунологического надзора.

б) Предпочтительная высокая аффинность парамиксовирусов в отношении злокачественных, а не нормальных клеток. Полимеры сиаловых кислот являются клеточными рецепторами для некоторых парамиксовирусов, в том числе для вируса Сендай. Поскольку любой вирус связывается со своим рецептором с высокой аффинностью, присутствие сиаловых кислот на поверхности опухолевых клеток в большом количестве способствует предпочтительной ассоциации вируса со злокачественной, а не с нормальной клеткой, что приводит к более высокой концентрации вирусов в опухолях и метастазах по сравнению с нормальными тканями.

В настоящее время показано, что жизнеспособность двух типов клеток рака простаты человека, РСЗ и DU145, существенно подавляется инактивированным УФ вирусом Сендай. Апоптоз клеток РСЗ наблюдается через 24 ч после обработки вирусом Сендай, при этом ингибирования роста нормального эпителия простаты не наблюдается (35). Данное исследование, по мнению авторов, подтверждает, что чувствительность опухолевых клеток простаты к вирусу Сендай в значительной степени вызвана большим количеством содержащих сиаловую кислоту рецепторов к этому вирусу на поверхности этих клеток и, следовательно, его большей аффинностью к этим клеткам.

в) Стимуляция продукции интерферонов (ИФН) типа I и II. Показано, что в лейкоцитах периферической крови человека (ЛПКЧ) вирус Сендай является сильным стимулятором интерферона альфа (ИФН-альфа) (64). Он индуцирует секрецию по меньшей мере девяти различных видов ИФН-альфа: ИФН-альфа 1a, ИФН-альфа 2b, ИФН-альфа 4b, ИФН-альфа 7а, ИФН-альфа 8b, ИФН-альфа 10а, ИФН-альфа 14с, ИФН-альфа 17b и ИФН-альфа 21b. Среди них основным подтипом являлся ИФН-альфа 1а, который составлял примерно 30% суммарного лейкоцитарного ИФН-альфа (65). Вирус Сендай также способен стимулировать в ЛПКЧ продукцию ИФН-гамма (66). Вирус Сендай был выбран среди множества других вирусов для применения в производстве ИФН из лейкоцитов человека в промышленном масштабе (67).

Инактивированный УФ вирус Сендай может индуцировать секрецию ИФН-альфа и ИФН-бета в некоторых линиях опухолевых клеток (35). Такой инактивированный вирус также индуцирует секрецию ИФН I типа дендритными клетками мыши. Показано, что эта индукция происходит по независимому от слияния клеток механизму, однако, по-видимому, за этот эффект отвечает белок слияния F (68).

В настоящее время известно, что стимуляция интерферонов способствует онколитическому иммунонадзору несколькими способами. Интерфероны I типа и ИФН-гамма существенно повышают уровень представления антигенов, зависимых от главного комплекса гистосовместимости I (ГКГС I). ИФН-гамма значительно активирует ГКГС II-зависимое представление антигенов. Оба эти процесса вызывают повышение уровня представленности опухолеспецифичных антигенов злокачественными и специальными антиген-презентирующими клетками, что ведет к стимулированию пролиферации и активности противоопухолевых цитотоксичных Т-клеток. Интерфероны также способны ингибировать ангиогенез, изменяя стимулы, поступающие от опухолевых клеток, и подавляя размножение эндотелиальных клеток. Это ингибирование коррелирует с пониженной васкуляризацией опухоли и последующим замедлением роста опухоли (см. обзоры в (69) (70) (71)).

г) Вирус Сендай стимулирует продукцию других цитокинов. Показано, что вирус Сендай способен стимулировать в лейкоцитах периферической крови человека (ЛПКЧ) продукцию интерлейкина-2 (66), макрофагального воспалительного белка-1 альфа (MIP-1альфа), MIP-1бета, RANTES, интерлейкина-6 (IL-6), IL-8 и МСР-1 (64). Введение вируса Сендай животным показало, что как живой, так и облученный УФ вирус стимулирует высвобождение IL-6 (32). Было продемонстрировано, что в дендритных клетках за стимуляцию секреции IL-6 отвечал белок слияния F вируса Сендай (68). Инактивированный УФ вирус Сендай индуцировал экспрессию белка-10, индуцированного интерфероном гамма, после его инъекции в опухоли рака почки (Renca) (34).

д) Параминсовирусы способны стимулировать натуральные киллеры (НК). Активированные НК способны разрушать опухолевые клетки без предварительной стимуляции антигеном. Эти клетки являются частью важной ветви врожденной иммунной системы организма, действие которой запускается сразу после обнаружения патогена и не включает развития иммунологической памяти на антиген. У НК есть несколько рецепторов, ответственных за их активацию. Среди этих рецепторов - два белка, NKp46 и NKp44. Были получены свидетельства того, что НК активируются всего одним белком парамиксовирусов, а именно - ГН (72). Предполагается, что активация НК инактивированным действием УФ вирусом Сендай, которую наблюдали в исследовании (34), связана с взаимодействием белка ГН с NKp46 и/или NKp44. Вирусы способны внедрять молекулы ГН в поверхность опухолевых клеток, что может приводить к их гибели. Было показано, что эффективное связывание белков NKp46 и/или NKp44 с ГН приводит к лизису клетки, имеющей на своей поверхности белок ГН (73) (74) (75).

Исследование инактивированного УФ вируса Сендай показало, что НК играют важную роль в опосредованной вирусом регрессии роста опухоли. На модели рака почки у мыши противоопухолевое действие вируса было снижено при совместной инъекции антитела против GM1, которое снижает количество НК-клеток (34).

е) Индукция противоопухолевой цитотоксичесной активности Т-лимфоцитов. Показано, что вирус птичьей болезни Ньюкасла (ВПБН) усиливает опухолеспецифический цитотоксический ответ CD8 Т-клеток (CTL) и повышает активность CD4 Т-хелперных клеток в отсутствие антивирусного ответа Т-клеток (76). Инактивированный УФ вирус, который не способен реплицироваться, оказался таким же активным, как и интактный, способный к репликации, ВПБН в отношении стимуляции противоопухолевого CTL-ответа. По-видимому, влияние ВПБН на CTL-ответ вызвано внедрением функциональных молекул вирусного белка ГН в поверхность опухолевых клеток, а также стимуляцей нейраминидазной активности (76), так как белки ГН вирусов Сендая и ВПБН являются в высокой степени гомологичными. Эти данные позволяют утверждать, что белок ГН, независимо от того, происходит он от вируса Сендай или от ВПБН или от других родственных парамиксовирусов, активирует как НК-, так и ответы, связанные с цитотоксичными лимфоцитами.

ж) Стимуляция дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) являются специализированными антиген-презентирующими клетками, которые способны эффективно стимулировать как врожденные, так и приобретенные иммунные ответы против различных патогенов и опухолей. После обнаружения вируса или иного патогена в ДК запускается специальная программа развития, в результате чего ДК становятся компетентными к активации наивных Т-клеток.

Даже инактивированный УФ вирус Сендай вызывает интенсивную инфильтрацию опухоли дендритными клетками (ДК) (32), при этом ex vivo инфекция ДК рекомбинантным вирусом Сендай индуцирует созревание и активацию ДК всего за один час (77). Обработка с применением активированных ДК, несущих различные варианты рекомбинантных вирусов Сендай, существенно повышает выживание животных, привитых клетками злокачественных меланом (78) (79), карциномы толстой кишки (80), плоскоклеточной карциномы (81) гепатоцеллюлярного рака, нейробластомы и рака простаты (31). Введение таких ДК перед инокуляцией опухолевых клеток продемонстрировало способность эффективно предотвращать образование легочных метастазов клетками нейробластомы (82) и аденокарциномы простаты (83).

з) Подавление регупяторных клеток. Эксперименты на животных моделях показали, что некоторые штаммы даже инактивированного УФ вируса Сендай подавляют регуляторную, опосредованную Т-клетками иммуносупрессию посредством секреции IL-6 зрелыми ДК (32).

Таким образом, в настоящее время известен целый ряд механизмов, посредством которых может осуществляться онколитическое действие вируса Сендай. Степень онколитического действия и преобладающий механизм зависят от индивидуальных особенностей штамма. Вирус может напрямую убивать злокачественные клетки, реплицируясь в них. Вирус Сендай вызывает образование клеточного синцития. Клетки, слившиеся в синцитий, более не могут делиться и обречены на коллективную синхронную гибель. Кроме того, вирус вызывает опосредованное иммунной системой уничтожение злокачественных клеток, происходящее за счет сильной противоопухолевой активации натуральных киллеров, а также благодаря усилению противоопухолевой цитотоксической активности Т-клеток, стимуляции антигенпрезентирующих дендритных клеток и подавления иммуносупрессорной активности Т-клеток. Содержащийся в капсидной оболочке вируса фермент нейраминидаза способна отщеплять сиаловые кислоты с поверхности злокачественных клеток, демаскируя присутствующие на клеточной мембране раковые антигены. При этом раковые клетки становятся заметны для иммунной системы. Кроме того, вирусная нейраминидаза может обеспечивать большое специфическое сродство вируса к полимерам сиаловых кислот, присутствующим в избытке на мембранах раковых клеток. За счет этого увеличивается вирусная специфичность к клеткам первичных опухолей и метастазов по отношению к нормальным клеткам.

Раскрытие изобретения.

В середине 50-х годов из Японии академиком АМН В.М. Ждановым был получен штамм вируса Сендай, который в дальнейшем был использован в Институте Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в качестве модельного патогена (84) (85) (86). В конце 60-х годов из лаборатории В.М. Жданова данный штамм был передан авторам изобретения и получил название Московский штамм. Штамм в дальнейшем прошел примерно 30 пассажей в куриных яйцах в лаборатории Всесоюзного Онкологического Научного Центра (ВОНЦ) АМН. Известно, что длительное пассирование вируса в культуре клеток или тканей часто приводит к модификации вируса. Таким образом, были получены многие известные в настоящее время вакцинные штаммы. В данном случае длительное пассирование московского вируса Сендай привело к получению его модифицированного варианта. Его высокая безопасность для человека и животных делали его перспективным агентом для использования в терапии пациентов и животных, страдающих злокачественными опухолями.

Авторы изобретения разработали фармацевтическую иммуногенную композицию, состав которой основан на очищенном изолированном биологически активном вирусе и способ лечения пациентов, страдающих злокачественными солидными опухолями или нуждающимися в иммунотерапии против метастазов, посредством введения им данной композиции. При включении в состав композиции дополнительно клеток, полученных из опухолевого материала больного, достигается дополнительный терапевтический эффект за счет усиления вирусом иммунного ответа против аутологичных опухолевых клеток.

В предпочтительном воплощении в состав композиции должен вводиться живой вирус. Однако вирус может быть предварительно до введения в композицию инактивирован при помощи ультрафиолетового излучения. Вирус может быть размножен в куриных эмбрионах, либо может быть адаптирован к размножению в клеточной культуре. Вирус может представлять из себя исходный штамм или генно-инженерный конструкт, созданный на основе вируса Сендай. Вирусный материал может быть собран из аллантоисной жидкости или из клеточной среды. Вирус может быть введен в композицию в форме суспензии в аллантоисной жидкости либо лиофилизированным. Фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут быть использованы в композиции настоящего изобретения, являются (яичная аллантоисная жидкость) свежая аллантоисная жидкость эмбрионов кур, лиофилизированная аллантоисная жидкость, физиологический раствор или водные буферы, такие как PBS и т.п. Кроме того, композиция настоящего изобретения может содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.

Вирус вводят в организм пациента в очищенной форме в составе фармацевтической вакцинной композиции в сочетании с физиологическим раствором или другим фармацевтически приемлемым носителем. Композиция может быть введена в организм различными способами, в частности, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутрь опухоли. Наиболее предпочтительным является введение внутрь опухоли. Следующим по уровню предпочтения является внутрикожное введение. Вирус может входить в состав композиции в нативной или инактивированной форме. Наиболее предпочтительным является введение живого вируса.

Композиция может содержать также вирус в комбинации с инактивированными радиацией клетками, полученными дисперсией из опухолевого материала больного. Кроме того, композиция может быть введена в организм пациента в комбинации с инактивированными радиацией клетками, полученными из иммуногенных опухолевых клеточных линий. Композиция может быть введена в организм пациента в сочетании с клетками куриных эмбрионов, при этом возможна дополнительная репликация вируса в клетках куриных эмбрионов в теле пациента, что усиливает его терапевтическое действие.

Способ лечения включает, по меньшей мере, одно введение пациенту эффективного количества композиции по изобретению. В предпочтительном воплощении курс иммунотерапии включает 12 инъекций вакцинной композиции. Инъекции производятся с интервалом 7-10 дней. Предпочтительно вводить инъекционный материал небольшими дозами. Например, если необходимо ввести в опухоль 1 мл композиции, введение предпочтительно произвести в 10 точек по 100 мкл для достижения максимально равномерного распространения вируса внутри опухоли. Предпочтительно даже при отсутвии признаков прогрессии онкологического заболевания повторять курс иммунотерапии каждые 2-3 года.

При введении лиофилизированного препарата вируса титр вируса составляет обычно от 6 до 7, а при введении нативного (нелиофилизированного) варианта от 7 до 8 эмбриональной инфекционной дозы 50% (ЭИД 50%) на мл. Если по каким-либо причинам фармацевтическую композицию невозможно ввести внутрь опухоли, то ее преодпочтительно вводить внутрикожно. Введение предпочтительно произвести в 10 точек по 100 мкл для достижения максимально равномерного распространения вируса внутри кожи.

Раскрытый в изобретении способ лечения был успешно применен на практике в Москве и в Санкт-Петербурге в 80-90-х годах для лечения онкологических больных с солидными опухолями (карциномами и саркомами). В примерах 1-5 описаны краткие истории болезни пациентов, в примерах 6 и 7 описаны ветеринарные случаи. В примере 8 представлено заключение о результатах совместного оперативно-иммунного лечения онкологических больных с солидными опухолями III- IV стадии на базе Городской клинической больницы №26 г. Санкт-Петербурга. После операций все больные проходили в течение 3-4 месяцев курс иммунотерапии в соответствии с раскрытым в настоящем изобретении способом. Выживание без признаков онкозаболеваний наблюдалось у 11 из 12 больных после проведения радикальных операций и у 4 из 15 больных после туморредуктивных операций.

В настоящее время раскрытый в изобретении штамм Сендай-Москва депонирован для целей патентной процедуры в коллекцию клеточных культур АТСС, где ему присвоен номер РТА-13024.

Осуществление изобретения

Протокол наращивания вируса.

Для выращивания вируса Сендай применяют стандартную методику размножения вируса в амниотической полости эмбрионов оплодотворенных куриных яиц.

Вирус выращивали в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для инъекций пациентам вирус проверяли на стерильность.

Оплодотворенное яйцо 7-го дня эмбрионального развития инокулировали вирусным материалом. Для обеспечения асептики скорлупу стерилизовали 70% раствором этилового спирта, затем в скорлупе яйца проделывали отверстие, через которое в аллантоисную жидкость вводили шприцем 100 мкл вирусного материала. После инокуляции вируса это отверстие заклеивали расплавленным воском. Инкубацию зараженных яиц производили при температуре 37.5°С в течении трех суток. После инкубации из яиц через окно в скорлупе шприцем собирали аллантоисную жидкость. Выход составлял примерно 3 мл аллантоисной жидкости из каждого яйца. Аллантоисную жидкость центрифугировали 10 мин 1000g при 4°С, для избавления от кусочков, и далее расфасовывали на аликвоты. Хранение аллантоисной жидкости с суспендированным вирусным материалом производили при -80°С. Частично препарат с вирусом был лиофилизирован. Хранение лиофилизированного материала может производится при -20°С. Титр лиофилизированной части препарата составляет обычно от 6 до 7, а нелиофилизированной от 7 до 8 эмбриональной инфекционной дозы 50% (ЭИД 50%) на мл.

Приготовление клеточного материала для вакцинации

А. Приготовление клеток для дополнительной репликации вируса в теле пациента

Трех-пятидневные куриные эмбрионы собирают стерильно и диспергируют сначала мельчением ножницами и затем пипетированием в физрастворе, содержащем 10% сыворотку и антибиотики: пенициллин 100 IU/мл и стрептомицин 100 мкг/мл (ПС). В случае приготовления суспензии клеток куриных эмбрионов впрок к суспензии добавляют 10% DMSO и замораживают с контролируемой скоростью замерзания по стандартному протоколу. Суспензию хранят в аликвотах в жидком азоте или при -130°С. Всю работу с клетками куриных эмбрионов после размораживания следует проводить в холодной комнате и/или в ледяной бане. Отмывку от DMSO производят 10-кратным разведением содержимого размороженной аликвоты полным физраствором с 10% сыворотки и ПС с последующим центрифугированием.

После отмывки клетки ресуспендируют в 1 мл аллантоисной жидкости, содержащей вирус Сендай, и инкубируют 30 мин в ледяной бане для адсорбции вируса на поверхность клеток. Полученную композицию вводят больному внутрикожно, в несколько точек, примерно по 100 мкл в точку. Для проведения одной инъекции требуется использовать все количество клеток, полученное из 2-3 эмбрионов.

В случае доступности операционного опухолевого материала больного, суспензию эмбриональных клеток смешивают с суспензией инактивированных опухолевых клеток. Эту суспензию следует готовить заранее путем клеточной дисперсии опухолевого материала. Для проведения одной инъекции требуется около 5-20 млн. живых опухолевых клеток. Вирус может пролиферировать, правильно прцессироваться и в культурах клеток млекопитающих. Такие клетки, обезвреженные радиацией тоже можно вводить пациентам.

Б. Приготовление собственного опухолевого материала без высадки в культуру.

После операции опухолевый материал разделяют на две части. Одну часть используют для патологогистологической идентификации, другую часть сохраняют при 4°С, поместив в культуральную среду или полный физраствор с 10% сывороткой и ПС, для последующего приготовления материала вакцины. Крайне желательно последующую обработку опухоли производить в течение первых часов после хирургической операции. В 1 г опухолевого материала содержится примерно 1 млрд. клеток, но эта оценка сильно варьирует для разных опухолей.

Для приготовления аутологичной вакцины опухолевый материал подвергают механической дисперсии и последующей энзиматической обработке. Стерильными острыми ножницами опухоль размельчают до кусочков размером 2-3 мм в чашке Петри. Полученные фрагменты опухоли обрабатывают ферментами. Для этого размельченный ножницами опухолевый материал заливают раствором 0.2% коллагеназы и 10 мг/мл ДНКазы в полной среде с 10% сывороткой (вместо среды можно использовать полный физраствор) с ПС. Полученную смесь инкубируют 15 мин при 37°С или ночь при 4-8°С. После инкубации с ферментами, для дальнейшей клеточной дисперсии, материал подвергают неинтенсивному осторожному пипетированию. После пипетирования смесь центрифугируют 1 мин. при 1000g для удаления кусочков опухоли, плохо подвергшихся дисперсии. Для достижения той же цели клеточную суспензию можно подвергать фильтрованию через нейлоновую сетку с размером пор 40 p~m. После удаления кусочков опухоли, плохо подвергшихся дисперсии, в клеточную суспензию добавляют проназу (0.1%) для переваривания мертвых клеток. При короткой инкубации проназа переваривает погибшие клетки, а при более длительной начинает переваривать живые, поэтому обработка проназой должна быть очень короткой. Суспензию инкубируют с ферментами 2 мин при комнатной температуре и дальше подвергают центрифугированию на холоде в течение 5 мин для осаждения клеток. В случае последующего использования свежеполученных опухолевых клеток для приготовления вакцины клетки после центрифугирования ресуспендируют в культуральной среде или полном физрастворе с добавлением 10% сыворотки и ПС. Жизнеспособность клеток после процесса дисперсии оценивают с помощью раствора красителя трипанового синего. На одну вакцинацию необходимо использовать 5-20 млн. живых опухолевых клеток.

В случае последующего замораживания клеток после центрифугирования их ресуспендируют в полной среде с 15% сывороткой и 10% DMSO. После добавления DMSO суспензию клеток замораживают с контролируемой скоростью замерзания по стандартному протоколу. Суспензию хранят в аликвотах в жидком азоте или при -130°С. Отмывку клеток от DMSO проводят в 10-кратном объеме культуральной среды или полного физраствора с добавлением не менее 10% сыворотки и ПС. Инактивацию клеточной способности к пролиферации производят с помощью гамма-облучения (200 Gy). Можно облучать клетки до и после замораживания, в последнем случае клетки транспортируют к источнику радиации в сухом льду и облучают замороженными. Жизнеспособность клеток после процесса дисперсии оценивают с помощью раствора красителя трипанового синего. Тест на жизнеспособность клеток должен выявлять не менее 75% живых клеток. На одну вакцинацию необходимо использовать 5-20 млн. живых опухолевых клеток.

В. Приготовление иммуногенных клеточных линий

Целями высадки клеток в культуру являлись: 1) избавление от поврежденных и мертвых клеток и получение одноклеточной суспензии живых клеток; 2) пролиферация опухолевых клеток для получения большего их количества. Для приготовления иммуногенных клеточных композиций опухолевый материал самого больного или материал больных с опухолями сходного гистогенеза подвергают механической дисперсии и последующей энзиматической обработке по протоколу, приведенному выше в пункте Б.

После диспергирования ткани опухоли опухолевые клетки помещали в культуральные матрасы с полной культуральной средой (RPMI, DMEM), 10% сыворотки и антибиотиками (ПС). Клетки растили в культуральных условиях 2-3 суток. Затем клетки снимали с матрасов трипсином по стандартной методике. Подсчет клеток производили под микроскопом после окраски трипановым синим. На одну вакцинацию использовали 5-20 млн. живых, но инактивированных радиацией опухолевых клеток. Инактивацию клеточной способности к пролиферации производят с помощью гамма-облучения (200 Gy).

Варианты введения фармацевтичечских композиций

1. Фармацевтическую композицию можно вводить внутрь опухоли (см.примеры 2, 6, 7)

2. Фармацевтическую композицию можно вводить внутрикожно (см примеры 1, 3-5, 8)

3. Первый и второй способы введения фармацевтической композиции являются предпочтительным, однако эту композицию можно вводить и другими парентеральными способами, в частности подкожно, внутримышечно и, вероятно, внутривенно. Способ внутривенной инъекции высокоочищенного вируса может быть разработан на основе фармацевтической композиции, включающей высокоочищенный вирус Сендай в дозировках, сходных с дозировками введения вируса болезни НьюКастла, ранее описанными в литературе. Соответствующие клинические испытания ранее были проведенны с штамом вируса НьюКастла PV101 http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/NDV/HealthProfessional/page2

Оценка развивающейся иммунной реакции к собственным раковым клеткам по мере вакцинации

Для оценки развивающейся иммунной реакции к собственным раковым клеткам по мере вакцинации использовалась реакция замедленной гиперчувствительности. Для. этого пациентам вводились гамма-облученные опухолевые клетки (200 Gy) без вируса. Диаметр образовавшейся после введения клеток эритемы измерялся через 24 часа после инъекции. Реакция считалась позитивной, если диаметр эритемы был больше 7 мм. По мере увеличения чипа вакцинаций, проведенных для каждого пациента, и соответственно регулярной стимуляции иммунного ответа к раковым клеткам эритема должна увеличиваться.

Примеры терапевтического действия вируса Сендай

Ниже приведены примеры значительного положительного эффекта, полученного после применения заявленного способа для лечения неинкурабельных онкологических больных.

Пример 1.

Больной К.В., 1922 г.р. В I-1989 г. больному был поставлен диагноз - аденокарцинома предстательной железы. У него был выявлен метастаз в позвоночник с началом компрессии L-1. Больной был полностью обездвижен из-за непереносимых болей в позвоночнике, тазовых костях и правом голеностопном суставе на протяжении 3-х месяцев. Выписан из больницы на наркотиках как безнадежный. Прошел курс иммунотерапии согласно изобретению со II-1989 по V-1989. К концу лечения боли полностью исчезли, больной приобрел нормальную физическую подвижность. Через 3 месяца после окончания иммунотерапии прошел обследование в Онкологическом Научном Центре (ОНЦ) АМН. По результатам обследования на VIII-IX-1989 ни опухоли, ни признаков метастазов не обнаружено. На рентгенограмме найдена деструкция позвонка L-1. Через 5 лет пос