Лечение свиней с помощью антигена pcv2

Лечение свиней с помощью антигена pcv2

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственную заявку

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США серийный номер 60/870311, поданной 15 декабря 2006 г., сущность и содержание которой включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Перечень последовательностей

В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Перечень последовательностей идентичен включенному в WO 06/072065.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции, которая содержит антиген, представляющий собой цирковирус свиней типа 2 (PCV2), которая предназначена для предупреждения, уменьшения серьезности клинических признаков, уменьшения количества случаев инфекции и/или клинических признаков и лечения нескольких клинических проявлений у животных, имеющих специфические в отношении PCV2 антитела. Предпочтительно указанные специфические в отношении PCV2 антитела представляют собой антитела, полученные от матери.

Описание известного уровня техники

Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый, не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный циклический геном. Последовательность PCV2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Однако в настоящее время установлено, что в отличие от PCV1, который, как правило, является невирулентным, заражение свиней PCV2 ассоциируется с рядом болезненных синдромов, которые в целом обозначают как ассоциированные с цирковирусом болезни свиней (PCVAD) (известные также как болезни свиней, связанные с цирковирусом (PCVD)) (Allan и др., IPVS Congress, 2006). Как правило, основным клиническим проявлением PCVAD считается синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PCVD) (Harding и др., Swine Health Prod; 5, 1997, c.201-203; Kennedy и др., J Comp Pathol; 122, 2000, c.9-24). PCVD поражает свиней возрастом 5-18 недель. C клинической точки зрения PCVD характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой новорожденных и желтухой. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов (Muirhead, Vet. Rec., 150, 2002, с.456). При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах (Allan и Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, cc.3-14). Обнаружена выраженная корреляция между количеством нуклеиновой кислоты или антигеном PCV2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений. Уровни смертности у свиней, пораженных PCV2, могут достигать 80%. Помимо PCVD с PCV2 связаны несколько других инфекций, включая псевдобешенство, репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS), болезнь Глассера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, колибактериоз отъемышей, связанный с кормом гепатоз и гнойную плевропневмонию. Однако к настоящему времени отсутствуют исследования, подтверждающие, что все эти клинические симптомы действительно являются непосредственным результатом заражения PCV2. Кроме того, пока не известно, можно ли какие-либо указанные клинические симптомы эффективно снижать или излечивать с помощью действующих веществ, оказывающих непосредственное воздействие на PCV2.

Подходы к лечению вызываемых PCV2 инфекций, основанные на применении ДНК-вакцины, описаны в US 6703023. В WO 03/049703 описано получение живой химерной вакцины, содержащей каркас PCV-1, в которой ген каркаса PCV-1 заменен на иммуногенный ген патогенных штаммов PCV2. В WO 99/18214 описано несколько штаммов PCV2 и процедуры получения убитой вакцины против PVC2. Однако отсутствуют данные об их эффективности. Эффективная субъединичная вакцина на основе ORF-2 (открытой рамки считывания 2) описана в WO 06/072065 и WO 2007/028823. Любая из указанных вакцин предназначена для применения с целью вакцинации/лечения свиней или молодых свиней (свиней, не достигших половой зрелости) старше 3 недель. Ни для одной из указанных вакцин не указана возможность применения на молодых поросятах возрастом меньше 3 или 2 недель.

Установлено, что полученный от матери иммунитет обеспечивает определенную степень защиты от вызываемой PCV2 инфекции и клинических состояний, связанных с PCV2-инфекцией. Установлено, что указанная защита зависит от титра антител: как правило, более высокие титры обеспечивают защитное действие, а при более низких титрах оно отсутствует (McKeown и др., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, 2005, c.1347-1351). Установлено, что среднее время полужизни антител у животных-отъемышей составляет 19,0 дней и окно распада связанных с пассивной иммунизацией антител к PCV2 в популяции является относительно широким (Opriessnig и др., J. Swine Health Prod. 12, 2004, c.186-191). Установлено, что при низких титрах распад антител к PCV2, присутствие которых у животных возрастом 10-12 дней связано с пассивной иммунизацией, происходит при достижении животными возраста примерно 4,9+1,2 недель, при средних титрах антитела распадаются при достижении возраста примерно 8,1+1,9 недель, а при высоких титрах антитела распадаются при достижении возраста примерно 11,1+2,5 недель (Opriessnig и др., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-й Ежегодный съезд американской ассоциации по ветеринарии свиней), 2006 г.). Обнаружена тесная корреляция между снижением титров антител и появлением первых клинических признаков PCVAD, которые возникают у поросят в возрасте примерно 5-12 недель (Allan и др., Vet. Diagn. Investigation, 12, 2000, c.3-14). Кроме того, PCV2 был выделен также из лимфатических узлов новорожденных поросят (Hirai и др., Vet. Record, 148, 2001, cc.482-484), что свидетельствует о том, что даже более молодые поросята могут поражаться PCVAD в отсутствие титров защитных материнских антител. Выраженная корреляция между титром антител и защитным действием установлена в опыте, проведенном в полевых условиях в Испании: поросята, имеющие низкие титры антител в 7-недельном возрасте (средний титр антител 1:100, диапазон от 0 до 1:320), отличались существенно более высоким коэффициентом смертности в течение следующих 5 недель, чем животные с более высокими титрами антител (Rodriguez-Arrioja и др., Am. J Vet. Res. 63, 2002, c.354-357).

Присутствие полученных от матери антител не только может обеспечивать определенную степень защиты от вирусной инфекции, что, однако, является непрогнозируемым, но так же, как известно, влияет на эффективность иммунизации. Например, более высокие титры полученных от матери антител к классическому вирусу лихорадки свиней (CSFV) ингибируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ на вакцину против CSFV, а при более низких титрах не обнаружено значительного воздействия (Suradhat и Damrongwatanapokin, Vet. Microbiol, 92, 2003, c.187-194). Кроме того, было высказано предположение, что живые вакцины против PCV2 должны работать более эффективно при их введении поросятам старше 7 или 8 недель, поскольку к этому времени материнские антитела в основном распадаются. На взаимодействие с материнскими антителами влияет тип вызываемого иммунного ответа (Th1 или Th2), который зависит (среди прочего) от типа вакцины, типа антигена, типа адъюванта, а также количества введенного антигена. Следовательно, можно предположить, что взаимодействие с материнскими антителами может быть различным для разных вакцин, даже если они защищают от одного и того же патогена. В целом, полученные от матери антитела к PCV2 могут обеспечивать определенную степень защиты от PCV2, но, с другой стороны, эти антитела могут влиять на эффективность любой вакцины против PCV2.

Защита животных путем активной иммунизации усложняется также тем обстоятельством, что а) время распада полученных от матери антител (MDA) варьируется от животного к животному и б) многие болезни возникают вскоре после распада антител. С учетом этой проблемы в нескольких стратегиях предусматривается применение двух режимов вакцинации путем впрыскивания для молодых животных: первую вакцинацию осуществляют на ранней стадии жизни для защиты животных с низкими титрами MDA. Считается, что эта первая вакцинация может не обладать эффективностью для животных с высокими титрами MDA из-за взаимодействия с антигеном вакцины. Для того чтобы осуществлять защиту также и этих животных, требуется вторая вакцинация, когда ожидается, что высокие титры MDA уже снизились. Этот тип схемы вакцинации применяют в случае вакцин для многих мелких животных (например, вакцин против парвовирусов кошек, гепатита кошек), вакцин для лошадей (например, вакцин против лошадиного гриппа) и вакцин для свиней (например, против Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis). Поскольку возникновение PCVAD у животных возрастом 5 недель или старше, вероятно, связано с распадом антител к PCV2, что, как известно, происходит у животных возрастом 4-11 недель, описаны некоторые основанные на применении вакцин подходы к защите от PCVAD, в которых применяют два режима вакцинации путем впрыскивания для того, чтобы избежать возможного взаимодействия с материнскими антителами.

В WO 2007/028823 описана вакцинация поросят, которые имеют полученные от матери антитела к PCV2, с использованием более 20 мкг антигена/дозу с помощью описанного режима двух вакцинаций путем впрыскивания. Начальную вакцинацию осуществляют в возрасте от 1 до 4 недель. Всех животных повторно вакцинируют через три недели после начальной вакцинации, когда полученные от матери антитела у животных с высокими титрами MDA в момент первой вакцинации должны снизиться или исчезнуть. Таким образом, пока отсутствует информация, касающаяся точного воздействия полученных от матери антител к PCV2 на степень защиты или взаимодействия. По этой причине рекомендовано не вакцинировать поросят возрастом до трех (3) недель с использованием по меньшей мере режима одной вакцинации путем впрыскивания. Вакцинация поросят возрастом менее 3 недель связана с некоторой степенью неопределенности касательно эффективности иммунизации. С другой стороны, поросята с более низкими титрами полученных от матери антител к PCV2, хотя к настоящему времени никому не известны точные значения указанных низких уровней, не имеют достаточной защиты от инфекции, вызываемой PCV2, в возрасте до 3 недель. Другими словами, стада, в которых животные имеют низкие титры MDA, если их не вакцинируют в возрасте до 3 недель, имеют постоянный риск заражения PCV2 из-за отсутствия достаточного иммунного статуса.

Кроме того, не описано, что такие вакцины обусловливают защитный иммунитет от заражения PCV2 или снижение, уменьшение серьезности, или исцеление любых клинических симптомов, ассоциированных с ними у молодых свиней, которые уже имеют антитела к PCV2, предпочтительно которые имеют материнские антитела к PCV2.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - уровни титров антител к PCV2 к моменту вакцинации;

на фиг.2 - сравнение живой массы тела у вакцинированных животных с низкими (<1:100) и высокими (>1:1000) титрами антител к PCV2;

на фиг.3 - различие в массе тела у вакцинированных (IVP) животных по сравнению с контрольными обработанными плацебо животными (СР).

Описание изобретения

Настоящее изобретение позволяет решить присущие прототипам проблемы, и оно обеспечивает выраженный прогресс в данной области техники. Основным объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2. При создании изобретения непредсказуемо и неожиданно было установлено, что присутствие антител к PCV2, полученных от матери, не влияет на эффективность вакцины, содержащей антиген PCV2.

Понятие «вакцина» или «иммуногенная композиция» (оба понятия являются синонимами) в контексте настоящего описания относится к любой фармацевтической композиции, которая содержит антиген PCV2, при этом композицию можно применять для предупреждения или лечения ассоциированного с заражением PCV2 заболевания или состояния у животного. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ на PCV2. Под это понятие подпадают как субъединичные иммуногенные композиции, описанные ниже, так и композиции, которые содержат убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция представляет собой субъединичную иммуногенную композицию, композицию, содержащую убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.

В контексте настоящего описания понятие «субъединичная иммуногенная композиция» относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, выведенные или являющиеся гомологами антигена PCV2. Такая композиция практически свободна от интактного PCV2. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают по меньшей мере из частично очищенных или фракционированных (предпочтительно практически очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV2, или их рекомбинантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединицу антигена или антигенов, представляющих интерес, которые практически свободны от других антигенов или полипептидов из PCV2, или являются фракционированными. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция содержит белок ORF-2 PCV2, описанный ниже. Наиболее предпочтительными являются иммуногенные субъединичные композиции, которые содержат любой из антигенов PCV2, представленных в WO 06/072065, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Понятие «иммунный ответ» относится, но не ограничиваясь только этим, к формированию в хозяине клеточно- и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает, но не ограничиваясь только ими, одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный ответ) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению уровня или серьезности, либо по отсутствию описанных выше симптомов, ассоциированных с заражением хозяина PCV2, замедлению появления вируса в крови (виремия), снижению персистентности вируса, снижению общей вирусной нагрузки и/или снижению вирусной экскреции.

Понятие «антиген» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Антиген в контексте настоящего описания включает полноразмерную последовательность любых белков PCV2, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает описанный выше иммунологический ответ. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn Е. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Например, линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, c.3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, c.709-715. Аналогично этому, конформационные эпитопы легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше).

Понятие включает также синтетические антигены, например полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие, полученные рекомбинантными или синтетическими методами антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, c.2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, c.3242-3249; Suhrbier A., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, c.402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня - 3 июля 1998 г.).

Следующим объектом изобретения является иммуногенная композиция, как она определена в контексте настоящего описания, которая наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ORF-2 PCV2, ДНК ORF-2 PCV2 и белок, которые применяют согласно изобретению для приготовления композиций и с помощью способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой высококонсервативный домен в изолятах PCV2 и поэтому согласно изобретению любая ORF-2 PCV2 должна быть эффективной в качестве источника ДНК ORF-2 PCV и/или полипептида. Предпочтительным белком ORF-2 PCV2 является белок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:11 в настоящем описании и в WO 06/072065. Другим предпочтительным полипептидом ORF-2 PCV является полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 в настоящем описании и в WO 06/072065. Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что последовательность может варьироваться в пределах 6-10% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, путем экспериментов по контрольному заражению, описанных в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, когда модифицированный антиген обусловливает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании и в WO 06/072065.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой антигенный белок ORF-2 PCV2, который обусловливает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании и в WO 06/072065. Предпочтительно белок ORF-2 PCV2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:5 в настоящем описании и в WO 06/072065.

В некоторых вариантах иммуногенные участки белка ORF-2 PCV2 применяют в качестве антигенного компонента в иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Понятие «иммуногенный участок» в контексте настоящего описания относится к укороченным и/или имеющим замены формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ORF-2 PCV2 соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF-2. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОRF-2. PCV. Две предпочтительные в этом плане последовательности представлены в виде SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в настоящем описании и в WO 06/072065. Следует понимать также, что указанные последовательности могут представлять собой часть более крупных фрагментов или укороченных форм.

Как указано выше, предпочтительным является также любой полипептид ОRF-2 PCV2, который кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Кроме того, как должно быть очевидно специалистам в данной области, эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. В некоторых вариантах укороченные или имеющие замены формы или фрагменты полипептида ORF-2 PVC2 применяют в качестве антигенного компонента в композиции. Предпочтительно такие укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.

Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к родству между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости между отрезками указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей легко можно рассчитывать с помощью известных методов, включая, но не ограничиваясь только ими, описанные в: Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A. N., изд-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H. G., изд-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во М. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей для рассматриваемых последовательностей. Примерами таких программ являются, но не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, c.403-410).

Программа BLASTX является доступной общественности от фирмы NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, c.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того, что получать наиболее высокий уровень идентичности последовательностей для рассматриваемой последовательности и референс-последовательности. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% с нуклеотидной референс-последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5'- или 3'-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности.

Аналогично этому под полипептидом, данная аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не относят к совместимым при определении идентичности последовательностей.

Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродуцируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95% гомологию последовательности с референс-последовательностью 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.

Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид, имеющий сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., в результате чего общая функциональность не изменяется существенно.

Понятие «выделенный» означает «измененный человеком» относительно его встречающегося в естественных условиях состояния, т.е., если он встречается в природе, то его изменяют или удаляют из естественного окружения, или осуществляют и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, встречающийся в естественных условиях в живом организме, не является «выделенным», но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материала, с которым он существует совместно в его естественном состоянии, является «выделенным» согласно применяемому в описании понятию.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где белок ORF-2 PCV2 представляет собой любой из указанных выше белков. Предпочтительно белок ORF-2 PCV2 представляет собой:

I) полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в настоящем описании или в WO 06/07065;

II) любой полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду, указанному в I),

III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в I) и/или II),

IV) иммуногенный фрагмент, указанный в III), который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, входящих в последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в настоящем описании или в WO 06/072065,

V) полипептид, который кодируется ДНК, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/072065.

VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду, указанному в V),

VII) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, которые кодируются полинуклеотидом, указанным в V) и/или VI),

VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, входящих в последовательности, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/072065.

Предпочтительно любой из указанных иммуногенных фрагментов имеет иммуногенные характеристики белка ORF-2 PCV2, кодируемого последовательностями, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в настоящем описании или в WO 06/07065.

Таким образом, согласно следующему объекту изобретения белок ORF-2 PCV2 содержится в иммуногенной композиции с таким уровнем включения антигена, который является эффективным для индукции требуемого иммунного ответа, а именно для снижения количества случаев, уменьшения серьезности или предупреждения или снижения одного или нескольких клинических симптомов, являющихся результатом заражения PCV2 или ассоциированных с ним. Предпочтительно уровень включения белка ORF-2 PCV2 соответствует по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.

Согласно еще одному объекту изобретения уровень включения антигена ORF-2 PCV составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ORF-2 PCV2, описанного выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу. При создании изобретения неожиданно было установлено, что уровень включения белка ORF-2 PCV2 (содержание антигена) из расчета 20 мкг/дозу, предпочтительно примерно от 0,5 до 18 мкг/дозу, может обусловливать иммунитет у молодых животных и/или у животных, позитивных в отношении антител к PCV2, в частности, которые являются позитивными в отношении полученных от матери антител. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заражения PCV2 или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у животных, которые имеют антитела к PCV2, прежде всего полученные от матери антитела к PCV2, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят менее 20 мкг/дозу, предпочтительно примерно от 0,5 до 18 мкг/дозу антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Указанный антиген PCV2 представляет собой любой из указанных в настоящем описании. Предпочтительно указанный антиген PCV2 представляет собой любой белок ORF-2 PCV2, предпочтительно любой белок ORF-2 PCV2, представленный в настоящем описании.

Полипептид ORF-2 PCV2, применяемый в иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать любым путем, включая выделение и очистку ORF-2 PCV2, ста