Косметическая композиция, содержащая культивированные клетки из камбия или прокамбия тисса(taxus)

Косметическая композиция, содержащая культивированные клетки из камбия или прокамбия тисса(taxus)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антиоксидантной, противовоспалительной или противовозрастной композиции, содержащей какую-либо одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus), их экстракт, лизат и культуральную среду.

Уровень техники

Старение - это функциональный, структурный и биохимический процесс, происходящий непрерывно на протяжении жизни любого живого существа, включая человека. Старение осуществляется на всех уровнях (клеточном, тканевом и проч.) организма, проявляясь снижением интенсивности обмена веществ, повышением заболеваемости, ухудшением приспособляемости и др.; в конечном итоге оно приводит к гибели клеток и тканей организма, например человеческого. Теоретические объяснения процессов и причин старения подразделяются на генетические (см., например, Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992) и теории износа (Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992). Теории износа полагают, что клетки живого организма утрачивают свои функции с течением времени или из-за накопления вредных веществ. Среди этих объяснений наиболее правдоподобной представляется теория свободных радикалов, согласно которой свободные радикалы, образующиеся в организме в метаболических процессах, вследствие воздействия радиации, вирусов, тяжелых металлов и загрязнителей воздуха, вызывают возникновение высокотоксичных веществ, тем самым способствуя старению и приводя к различным связанным с возрастом заболеваниям.

Свободные радикалы - это соединения, несущие неспаренный электрон на внешней орбите; они очень нестабильны и, стремясь обрести недостающий электрон, высоко реакционноспособны. В частности, кислородные свободные радикалы, содержащие атом кислорода с неспаренным электроном, которые называются также активными формами кислорода (ROS), взаимодействуют с белками, липидами, углеводами и другими компонентами организма, приводя к перекисному окислению липидов, повреждению ДНК, окислению белков и прочим негативным явлениям, тем самым вызывая нарушение внутриклеточных структур и, в конечном счете, гибель клетки.

Так, эти активные формы кислорода усугубляют атеросклероз, болезнь Альцгеймера и, образуясь при повышенном уровне гомоцистеина в крови, инициируют воспалительные процессы, ведущие к старению сосудов.

Содержащие кислород токсичные вещества в организме человека называют активными формами кислорода (ROS). Примеры этих веществ включают свободные радикалы, как, например, супероксид-радикал, гидроксильный, пероксильный, алкоксильный и гидропероксильный радикалы, и несвободные радикалы, как, например, перекись водорода, хлорноватистая кислота, озон, синглетный кислород и пероксинитрит.Из числа активных форм кислорода наиболее изучены супероксидные свободные радикалы, которые играют весьма важную роль (Fridovich L., Science, 201:175, 1978).

В процессе старения в митохондриях клетки образуются ROS, которые становятся средоточием окислительного повреждения (Lesnefsky, E.J. & Hoppel, C.L. Arch. Biochem.Biophys 420, 287, 2003). Неоднократно сообщалось, что согласно теории свободных радикалов, внутриклеточные свободные радикалы имеют прямое отношение к связанному с возрастом окислительному стрессу и обусловленным им возрастным заболеваниям (Finkel, Т. & Holbrook, N.J., Science 408; 239, 2000). Сообщалось также, что такой окислительный стресс играет важную роль в причинах и инициировании старения (Chen Q. etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. May 9; 92(10):4337, 1995; Packer L. & Fuehr K., Nature, 267(5610):423, 1977). Термин «окислительный (оксидативный) стресс» употребляется для описания повреждения клеток, вызываемого окислением макромолекул при возрастающем уровне активных форм кислорода и пониженных резервах антиоксидантов (Thomas С. & Squier, Experimental Gerontology, 36;1539, 2001).

В старых клетках, в которых ухудшаются процессы репликации, ROS образуются в большем количестве и с большей скоростью, чем в молодых клетках; кроме того, старые клетки в ходе рутинного обмена веществ производят токсичные побочные продукты, например надперекись (суперокид), перекись водорода, гидроксильный радикал и др. Экспериментальные данные свидетельствуют, что у старых людей и животных в тканях накапливаются окислительные повреждения ДНК, белков и липидов (Chen, Ann. N. Y. Acad. Sci., 908:111, 2000). Активные формы кислорода, в частности гидроксильный радикал, воздействуют на ДНК так, что образуются 8-оксо-2'-дезоксигуанозин и другие сильные мутагенные агенты; содержание активных форм кислорода у каждого вида живых организмов связано с продолжительностью жизни, свойственной данному виду, а это означает, что уровень ROS является решающим фактором в определении скорости старения и развития различных связанных со старением заболеваний (Finkel & Holbrook, Nature, 408(6809): 239, 2000).

В 1961 г.Хейфлик (Hayflick) и Морхед (Moorhead) впервые сообщили о том, что репликативный потенциал молодых клеток в культуре снижается по мере увеличения числа клеточных делений, так что в конце концов клетки теряют способность к размножению, имея «предел удвоения», за которым клеточный рост прекращается. С тех пор ROS используются для определения связанных со старением молекулярных изменений человеческих клеток в качестве экспериментальных моделей старения in vitro и внутриклеточного старения человеческих фибробластов. (HAYFLICK L. & MOORHEAD P.S., Exp.Cell Res., 25:585, 1961).

Все аэробные организмы, включая человека, изначально обладают защитными механизмами против повреждения активными формами кислорода, неизбежно происходящего в ходе метаболических процессов энергообмена с использованием кислорода; когда образование активных форм кислорода превышает защитные возможности тканей, начинают развиваться различные возрастные заболевания, включая артрит, расстройства сердечно-сосудистой системы и слабоумие (Halliwell et al.. Drugs, 42:569, 1991; Fukuzawae/ al., J. Act. oxyg. Free Pad, 1:55, 1990).

Активные формы кислорода, которые нередко называют вредными, включают супероксид-анион (О^2-), представляющий собой синглетный кислород, образующийся в результате окисления-восстановления наиболее стабильного, триплетного кислорода (3O₂); перекись водорода (Н₂О₂), гидроксильный радикал (ОН); содержат неспаренный электрон, эти свободные радикалы вызывают болезни, повреждая компоненты иммунной системы - ферменты и другие белки, ДНК, Т-клетки (Regnstrom et al., Lancet., 16:1183, 1992; Gey etal., Am. Ac. J. Cm. Nutr., 53:326, 1991).

По этой причине активно изучалось формирование антиоксидантов и в результате теперь известно множество соединений с антиоксидантными свойствами, включая ферменты, например супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу, природные антиоксиданты, например витамины Е и С, каротиноиды и глутатион, и синтетические антиоксиданты, например /ирети-бутил-4-гидроксианизол (ВНА) и 3,5-(трет-бутил)-4-гидрокситолуол (ВНТ). Однако с возрастом у людей ослабевает способность антиоксидантных ферментов противостоять активным формам кислорода, а синтетические антиоксиданты, как выяснилось, обладают токсичностью и мутагенностью. Поэтому настоятельно необходимо разработать более стабильные и мощные естественные антиоксиданты (Hatano et al., Natural Medicines, 49:359, 1995; Masaki et al., Biol. Pharm. Bull, 18:162, 1995).

Заметим между тем, что воспаление представляет собой местную реакцию, возникающую в участке повреждения для ликвидации проникших патогенных агентов и/или поврежденных тканей. Несмотря на свою положительную роль, воспаление является одним из основных механизмов патогенеза заболеваний человека. Образование окиси азота (NO) в активированных моноцитах и макрофагах дает начало мощной вопалительной реакции и представляется наиболее важным в инициации иммунного ответа на бактериальные патогенные агенты (Bogdan С., Nat. Immunol., 2:907, 2001).

Повреждение ткани (клетки) или проникновение в организм чужеродного агента (например, бактерий, грибов, вирусов, различных аллергенных веществ) обычно вызывает воспалительную реакцию, проявляющуюся рядом сложных физиологических процессов, например активацией ферментов, секрецией медиаторов воспаления, перемещением и скоплением тканевой жидкости, миграцией клеток и разрушением тканей, что связано с различными опосредующими воспаление факторами и иммунокомпетентными клетками в крови и лимфе в сосудах в участке повреждения и в тканевой жидкости; внешне воспалительная реакция проявляется покраснением, отеком, гипертермией и болью. У здоровых людей воспалительная реакция ликвидирует проникшие в организм инфекционные агенты, восполняет поврежденные ткани и восстанавливает нарушившееся функционирование организма; но если антиген остался в организме или если из-за каких-либо внутренних факторов воспалительная реакция избыточна или неадекватно продолжительна, она приводит к повреждению слизистых оболочек и в результате в некоторых случаях вызывает заболевание, например рак. Соответственно, существует потребность в разработке естественных противовоспалительных агентов, которые способны предотвращать избыточную непрекращающуюся воспалительную реакцию, не вызывая негативных побочных эффектов.

Поэтому авторы настоящего изобретения предприняли попытки разработать композиции на основе природных компонентов, обладающие высокой антиоксидантной и противовоспалительной активностью и сводящие к минимуму побочные эффекты по сравнению с существующими антиоксидантными и противовоспалительными агентами. В результате этих усилий авторы настоящего изобретения обнаружили, что линии клеток, происходящие из камбия и прокамбия тисса (Taxus), и их экстракты обладают превосходной способностью подавлять воспаление и тормозить старение, в чем и состоит настоящее изобретение.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является композиция на основе естественных субстанций, которая сводит к минимуму побочные эффекты по сравнению с существующими антиоксидантными и противовоспалительными агентами и проявляет антиоксидантную и противовоспалительную активность, предотвращая и задерживая старение.

Для достижения указанной цели настоящее изобретение предоставляет антиоксидантную, противовоспалительную или противовозрастную композицию, содержащую какую-либо одну (или более) линию клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus) (или их экстракт, лизат и культуральную среду) и обладающих следующими свойствами:

(a) клетки недифференцированные;

(b) культура клеток стабильна, причем скорость роста выше, чем у линий клеток, происходящих из других тканей Taxzis; и

(c) морфологически характеризуется числом вакуолей.

Настоящее изобретение предоставляет также противовозрастную косметическую композицию, содержащую какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.

Настоящее изобретение предоставляет также отбеливающую косметическую композицию, содержащую какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.

Настоящее изобретение предоставляет также антиоксидантный функциональный пищевой продукт, содержащий какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.

Настоящее изобретение предоставляет также противовозрастной продукт функционального питания, содержащий какую-либо одну (или более) из указанных линий клеток, их экстракт, лизат и культуральную среду.

Другие признаки и воплощения настоящего изобретения прояснятся полнее в нижеследующем описании осуществления изобретения и прилагающейся формуле изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет серию фотографий, демонстрирующих процесс формирования линии клеток по данному изобретению, показывающих внешний вид камбия и прокамбия после выделения, а также позволяющих сравнить дедифференцированные клетки и клетки, происходящие из камбия и прокамбия Taxus.

Фиг.2 изображает схему последовательных этапов экстракции активных субстанций из клеток линии по данному изобретению.

Фиг.3 представляет в сравнении графики, характеризующие количество активных форм кислорода (ROS), и изображения флуоресценции DCFH, которые демонстрируют антиоксидантную активность экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном Н₂О₂ (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.4 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии p-ERK1/2 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном обработкой перекисью водорода (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.5 представляет серию фотографий, демонстрирующих индукцию экспрессии MnSOD под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при старении диплоидных фибробластов человека (HDF), вызванном обработкой перекисью водорода (P-WE - водный экстракт прокамбиальных клеток; C-WE - водный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.6 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии IL-1(3 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.7 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ММР-9 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.8 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ММР-2 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ - метанольный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.9 представляет серию фотографий, демонстрирующих подавление экспрессии ICAM-1 под действием экстрактов культивированных клеток по данному изобретению при обработке диплоидных фибробластов человека (HDF) липополисахаридом (LPS) для индукции воспаления (Р-МЕ - метанольный экстракт прокамбиальных клеток; С-МЕ -метанольный экстракт камбиальных клеток).

Фиг.10 представляет диаграмму, показывающую результаты определения жизнеспособности фибробластов, обработанных экстрактом культивированных клеток по данному изобретению (диметилсульфоксидным экстрактом культуры клеток, происходящих из камбия Taxus).

Фиг.11 представляет диаграмму, показывающую влияние экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению на ликвидацию активных форм кислорода, образовавшихся под действием ультрафиолетового излучения.

Фиг.12 представляет диаграмму, показывающую подавление образования ММР-1, вызванного ультрафиолетовым излучением, под влиянием экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению.

Фиг.13 представляет диаграмму, показывающую подавление меланогенеза в меланомных клетках В-16 под влиянием экстракта культивированных клеток и культуральной среды по данному изобретению.

Осуществление изобретения

Все технические и научные термины употребляются в настоящем документе в своих общепринятых, известных специалистам в данной области техники значениях, если не оговорено иного. Как правило, в настоящем документе используется общепринятая номенклатура, известная в данной области техники.

Основные термины, употребляемые при описании осуществления данного изобретения, определяются следующим образом.

Пучковый сосудистый камбий представляет собой латеральную меристему, расположенную цилиндрическим слоем между корой и глубже лежащей древесиной. За счет деятельности камбия происходит рост стебля в толщину; существуют гигантские растения, насчитывающие 11 000 лет судя по кольцам роста на поперечном срезе ствола. В процессе индивидуального развития растения пучковый сосудистый камбий происходит из прокамбия, так что одна и та же меристема постепенно дифференцируется, сохраняя свою непрерывность. В силу меристематического единства камбия и прокамбия в настоящем изобретении полагается, что использование камбия и прокамбия дает одинаковый эффект.

В настоящем документе термин «лизат» относится к лизату клеток, получаемому путем их разрушения химическими средствами, например с помощью детергента, или же физическим путем. Термин «экстракт» клеточной линии относится к субстанции, получаемой путем смешивания культивированных клеток с растворителем и последующего отделения клеток; экстракт можно сконцентрировать путем перегонки или выпаривания. Также термин «культуральная среда» клеточной линии относится к жидкости, получаемой в результате отделения клеток от среды, в которой они культивировались.

Термин «изначально недифференцированные клетки» в настоящем документе означает, что клетки не стали недифференцированными в процессе дедифференцировки, а исходно пребывали в предифференцированном состоянии.

В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к антиоксидантной, противовоспалительной или противовозрастной композиции, содержащей какую-либо одну (или более) из линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия тисса (Taxus), их экстракт, лизат и культуральную среду.

Линии клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению характеризуются следующими свойствами: (а) эти клетки пребывают в изначально недифференцированном состоянии; (b) растут в культуре стабильно и со скоростью, превышающей таковую клеточных линий, происходящих из других некамбиальных тканей Taxus; (с) морфологичеки отличаются большим количеством вакуолей. Кроме того, линии клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, по данному изобретению характеризуются тем, что: (а) в суспензионной культуре клетки одиночные; (b) клетки обладают низкой чувствительностью к напряжению сдвига в ферментере по сравнению с линиями клеток, происходящих из других некамбиальных клеток Taxus.

Линии клеток по данному изобретению могут быть получены с помощью способа выделения, включающего следующие стадии: а) получение камбиальной или прекамбиальной ткани Taxus; b) культивирование полученной камбиальной или прекамбиальной ткани Taxus для образования слоя камбия или прокамбия путем пролиферации камбиальных или прокамбиальных клеток и аморфного каллусного слоя путем пролиферации некамбиальных тканей; (с) отделение камбиального или прекамбиального слоя от каллусного слоя и сбор линии клеток камбиального или прекамбиального происхождения из слоя камбия или прокамбия.

По данному изобретению линию клеток предпочтительно дополнительно культивируют в среде, содержащей 3-5% (масса/масса) неочищенного сахара или сахара и по меньшей мере одной субстанции, выбираемой из группы, состоящей из метилжасмоната, грибного экстракта, бактериального экстракта, дрожжевого экстракта, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахидоновой кислоты, STS, N-бензоилглицина мевалоната, АВА, SNP, IPP, ВНТ, ССС, этефона, гиппуровой кислоты, церий-аммоний-нитрата, AgNO₃, ванадилсульфата, пара-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия. Содержание метилжасмоната предпочтительно составляло 10~100 мкМ.

В данном изобретении экстракты получали предпочтительно используя растворитель, выбираемый из группы, состоящей из дистиллированной воды, этилового спирта, ацетона, диметилсульфоксида (DMSO) и их смесей.

В настоящем изобретении диплоидные фибробласты обрабатывали экстрактом культивированных клеток по данному изобретению вместе с перекисью водорода, и оказалось, что клеточный экстракт подавлял образование активных форм кислорода и экспрессию p-ERK1/2, вызывая при этом экспрессию MnSOD; это позволяет полагать, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению обладает антиоксидантной активностью. Также в настоящем изобретении диплоидные фибробласты обрабатывали экстрактом культивированных клеток по данному изобретению вместе с LPS, и оказалось, что клеточный экстракт по данному изобретению подавлял образование ICAM-1, MMP9, ММР2 и IL-1β; это позволяет полагать, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению обладает противовоспалительной активностью. А именно, было обнаружено, что экстракт культивированных клеток по данному изобретению блокировал указанные сигнальные вещества, когда указанные клетки-мишени обрабатывали клеточным экстрактом прежде, чем начинались старение и воспаление.

Кроме того, в другом Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению обладают способностью ликвидировать активные формы кислорода, образовавшиеся под действием ультрафиолетового излучения.

Соответственно, обнаружено, как отмечено выше, что экстракт клеток линии по данному изобретению обладает антиоксидантной, противовоспалительной и противовозрастной активностью. Таким образом, хотя в настоящем изобретении нет конкретного примера, демонстрирующего, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению проявляет антиоксидантную, противовоспалительную и противовозрастную активности, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению или их лизат, способны также проявлять антиоксидантную и противовоспалительную активности, и тем самым указанная композиция может предотвращать старение, а также предотвращать и ослаблять воспаление кожи.

Антиоксидантная, противовоспалительная или противовозрастная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента какую-либо одну (или более) из линий клеток по данному изобретению, их экстракт или лизат и культуральную среду, может быть предоставлена в виде фармацевтической композиции, содержащей один (или более) из указанных компонентов сам (сами) по себе либо в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, эксипиентом или разбавителем. Клетки линии по данному изобретению или их экстракт в фармацевтической композиции могут содержаться в фармацевтически эффективном количестве, зависящем от специфики и тяжести заболевания, возраста и пола пациента, его массы тела, общего состояния здоровья, способа введения препарата и периода лечения.

В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый» означает, что данная композиция физиологически приемлема для человека и ее введение не вызывает расстройства желудка, аллергических реакций, например желудочно-кишечных нарушений или головокружения, или подобных реакций. Примеры указанных носителей, эксипиентов или разбавителей включают, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, манит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, смолу акации, альгинат, желатинг, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может также содержать наполнители, агенты, предотвращающие агрегацию частиц и/или обеспечивающие скольжение, увлажняющие агенты, отдушки, эмульгаторы и консерванты. Кроме того, фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть составлена с помощью известных в данной области техники методов таким образом, что будет обеспечено быстрое, постоянное или продолжительное высвобождение активного ингредиента после ее введения в организм млекопитающего. Она может иметь форму порошка, гранул, таблеток, эмульсии, сиропа, аэрозоля, мягких или твердых желатиновых капсул, стерильных растворов или порошков для инъекций и проч.

Между тем в другом Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению проявляют превосходную способность подавлять образование матриксных металлопротеиназ-1 (ММР-1), сравнимым с действием экстракта Taxus и ретиноевой кислоты, которые известны своим отличным противовозрастным эффектом; это позволяет предполагать, что композиция, содержащая клетки линии по данному изобретению, их экстракт, лизат или культуральную среду, подавляют деградацию коллагена, тем самым предотвращая старение кожи и сокращая морщины. Таким образом, композиция по данному изобретению весьма полезна в качестве противовозрастной косметической композиции. Соответственно, в этом аспекте настоящее изобретение относится к противовозрастной косметической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента какую-либо одну (или более) из линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракт, лизат и культуральную среду.

В еще одном Примере настоящего изобретения было обнаружено, что экстракт и культуральная среда клеток линии по данному изобретению обладают способностью подавлять меланогенез в меланомных клетках мышей; это позволяет предполагать, что композиция, содержащая экстракт клеток линии по данному изобретению или их культуральную среду, весьма полезна в качестве отбеливающей косметической композиции. Соответственно, в другом своем аспекте настоящее изобретение относится к отбеливающей косметической композиции, содержащей какую-либо одну (или более) линию клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракт, лизат и культуральную среду.

В настоящем документе термин «функциональный косметический продукт» означает косметический продукт, функциональность которого улучшена добавлением в него одной или более из линий клеток по данному изобретению, их экстракта, лизата и культуральной среды. Например, для получения функционального косметического продукта может использоваться противовозрастная композиция, содержащая культивированные клетки по данному изобретению или их экстракт.

Косметическая композиция по данному изобретению, помимо экстракта клеток линии по данному изобретению в качестве активного ингредиента, может содержать обычно используемые в косметической продукции ингредиенты. Например, косметическая композиция по данному изобретению может содержать обычно используемые в косметической продукции добавки, как то: растворители, стабилизаторы, солюбилизирующие агенты, эмульгаторы, витамины, красители, отдушки, а также носители.

Косметическая композиция по данному изобретению может быть приготовлена в формах, обычно используемых в данной области техники. Предпочтительно косметическая композиция по данному изобретению может быть приготовлена в форме, выбираемой из группы, состоящей из лосьона для кожи, питательного лосьона, питательного крема, массажного крема, питательной эссенции, маски, основы под макияж, масла для тела, масла для волос, шампуня и ополаскивателя.

Говоря о примерах косметических форм, отметим, что косметическая композиция по данному изобретению, содержащая одну или более линий клеток по данному изобретению, их экстракт, лизат и культуральную среду, обладает антиоксидантным действием и таким образом ликвидирует образующиеся в коже свободные радикалы и защищает внутриклеточные антиоксидантные системы. Соответственно, косметическая композиция по данному изобретению может предотвращать и задерживать старение кожи, обусловленное окислением под действием свободных радикалов, и может подавлять образование ММР-1, тем самым предотвращая старение кожи и сокращая морщины.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антиоксидантному функциональному пищевому продукту, содержащему в качестве активного ингредиента одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракта, лизата и культуральной среды.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к противовозрастному функциональному пищевому продукту, содержащему в качестве активного ингредиента одну или более линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus, их экстракта, лизата и культуральной среды.

В настоящем документе термин «функциональный пищевой продукт» относится к пищевому продукту, функциональность которого улучшена добавлением в него клеток одной или более из линий по данному изобретению или их экстракта.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение описывается более подробно с рассмотрением примеров. Следует отметить, что эти примеры приводятся лишь для иллюстрации и не могут считаться ограничивающими объем данного изобретения.

В частности, хотя антиоксидантный, противовозрастной и отбеливающий эффекты экстракта и культуральной среды клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus, подтверждаются приведенными ниже примерами, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что использование самих культивированных клеток может обеспечить такое же действие и результаты, как их экстракт или культуральная среда.

Пример 1. Получение линий клеток, происходящих из камбия или прокамбия Taxus.

(1) Получение растительного материала

Собрав ветви и стебли Taxus, их тотчас погружали в антиоксидантный раствор L-аскорбиновой кислоты (DUCHEFA, Нидерланды) в концентрации 100 мг/л, после чего транспортировали и хранили.

Растительный материал предварительно обрабатывали раствором, содержавшим 1% беномила (Dongbu Hannong Chemical, Корея), 1% даконила (Dongbu Hannong Chemical, Корея), 1% стрептомицина сульфата (DUCHEFA, Нидерланды) и 0,1% цефотаксима натрия (DUCHEFA, Нидерланды) в течение 24 часов, после чего промывали водопроводной водой в течение 30 минут, чтобы удалить фенольные соединения и остатки реактивов. Затем растительный материал подвергали поверхностной стерилизации в 70%-ном этиловом спирте (DC Chemical, Корея) в течение 1 мин, в 30%-ной перекиси водорода (LG Chemical, Корея) в течение 15 мин, в 1%-ном растворе CLOROX в течение 15 мин и в 3%-ном растворе CLOROX в течение 5 мин, после чего промывали 3-4 раза водой.

(2) Выделение камбиальной и прокамбиальной тканей из веток и стеблей. Наружные ткани веток и стеблей, прошедших поверхностную стерилизацию, как описано выше, легко счищались в продольном направлении. Счищенные ткани состояли из ксилемы, прокамбия или камбия, флоэмы, коры и эпидермиса; их культивировали таким образом, что самая внутренняя из счищенных тканей, а именно ксилема, контактировала со средой.

(3) Получение линии клеток, происходящих из камбия и прокамбия Taxus. На 4-7-е сутки в исходной культуре наблюдалось деление клеток из прокамбия и камбия; через 15 суток культивирования формировался аморфный каллус путем дедифференцировки, индуцированной слоем, состоящим из флоэмы, коры и эпидермиса. Однако в ксилеме на протяжении периода культивирования деления клеток не происходило, так что слой камбия естественным образом отделялся от ксилемы. Через 30 суток культивирования ткань начинала разделяться на слой камбия и содержащий флоэму верхний слой, а именно аморфный каллус ((а)А и (b)А фигуры 1). После того, как ткань естественным образом полностью разделялась на два слоя, эти слои культивировали по отдельности в разных чашках Петри ((а)В~С и (b)B~D фигуры 1). На фигуре 1(а)А показано выделение прокамбия: вверху - ткань, содержащая флоэму/кору/эпидермис, внизу - прокамбий. На фигуре 1(b), "А" показано выделение камбия: вверху - ткань, содержащая флоэму/кору/эпидермис, в середине - камбий, внизу - ксилема, поскольку культура формируется после удаления ксилемы. Стрелкой отмечен раздел между слоем камбий/прокамбий и тканью, содержащей флоэму/кору/эпидермис. На фигурах 1(а) и 1(b), "В" показывает линию клеток, происходящих из ткани, содержащей флоэму/кору/эпидермис, которая пролиферирует неравномерно из-за разницы в делении между вышеуказанными клетками; "С" показывает линию клеток, происходящих из камбия/прокамбия, которая пролиферирует с образованием однообразного клеточного слоя путем равномерного клеточного деления; "D" в 1(b) показывает ксилему, в которой клеточного деления не происходит. После того, как нужная ткань отделяется, как описано выше, берут ее белую рыхлую часть с хорошей скоростью роста и пересевают в такую же свежую среду, как индукционная среда, с интервалом 21 сутки.

Среда, использованная для индукции только линий клеток, происходящих из прокамбия и камбия, показана в приведенной ниже Таблице 1.

ТАБЛИЦА 1.
Индукционная среда для линий клеток Taxus spp.(среда 1)
	Компоненты	Содержание (мг/л)
Неорганические соли	KNO3	2500
(NH4)2SO4	134
MgSO4·7H2O	121,56
MnSO4·4H2O	10
ZnSO4·7H2O	2
CuSO4·5H2O	0,025
CaCl2·2H2O	113.23
KI	0.75
CoCl2·6H2O	0,025
NaH2PO4·H2O	130,44
Н3ВО3	3
Na2MoO4·2H2O	0,25
FeNaEDTA	36,7
Витамины	Миоинозитол	200
Тиамин-HCl	20
Никотиновая кислота	2
Пиридоксин-HCl	2
L-аскорбиновая кислота	50
Лимонная кислота	75
Аминокислоты	L-аспарагиновая кислота	133
L-аргинин	175
Глицин	75
Пролин	115
Гормоны	α-нафтилуксусная кислота	2
Сахароза		10000
Активированный уголь		100
Гельрит		2000

В эту среду добавляли ауксиновый регулятор роста (NAA или IAA) в концентрации 1-3 мг/л, предпочтительно 2 мг/л. Культуру держали в темной комнате при температуре 25±1°С.

Для сравнения стерилизовали и культивировали в среде, описанной в Таблице 1, эксплантаты зародышей и хвои Taxus. Этот растительный материал образовывал каллусную ткань путем дедифференцировки. Каллусы, возникшие из эксплантатов зародышей и хвои, имели неправильную форму вследствие разницы в скоростях клеточных делений различных клеток, как в случае тканей, содержащих флоэму; при этом скорость роста была непостоянной и каллусная ткань быстро приобретала коричневый оттенок. Побуревшая агрегированная каллусная культура, образовавшаяся из эксплантатов зародышей и хвои, росла с низкой скоростью из-за секретируемых фенольных соединений и в конце концов погибала. А именно, через 6 месяцев культивирования каллусы, возникшие из эксплантатов зародышей и хвои, с трудом удавалось сохранять и культивировать. А клетки, происходящие из прокамбия и камбия, напротив, долгое время - более 20 месяцев - стабильно культивировались без колебаний в скорости и характере роста и степени агрегированности; это позволяло полагать, что возможно получение культур таких клеток в больших масштабах.

(4) Фазы роста и свойства выделенных линий клеток.

Линии клеток, происходящих из прокамбия и камбия, помещали в колбы, содержащие жидкую среду, описанную в приведенной ниже Таблице 2. Клетки в колбах культивировали в темноте на переворачивающем шейкере с частотой вращения 100 об/мин при температуре 25±1°С. Интервал между пассажами составлял 2 недели, так что культивируемые клетки постоянно находились в состоянии высокой жизнеспособности в экспоненциальной фазе роста.

ТАБЛИЦА 2.
Суспензионная среда для Taxus spp.(среда 2)
	Компоненты	Содержание (мг/л)
Неорганические соли	Са(NО3)2	471,26
NH4NO3	400
MgSO4·7H2O	180,54
MnSO4·4H2O	22,3
ZnSO4·7H2O	8,6
CuSO4·5H2O	0,25
CaCl2-2H2O	72,5
K2SO4	990
Na2MoO4·2H2O	0,25
Н3ВО3	6,2
KH2PO4	170
FeNaEDTA	36,7
Витамины	Миоинозитол	200
Тиамин-HCl	20
Никотиновая кислота	2
Пиридо