Полинуклеотиды и полипептиды фага φ-mru, и их применение

Полинуклеотиды и полипептиды фага φ-mru, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке США № 60/975104, поданной 25 сентября 2007, заявке США № 60/989840, поданной 22 ноября 2007, и заявке США № 60/989841, поданной 22 ноября 2007, содержания каждой из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям и способам доставки ингибирующих молекул в микробные клетки, в частности метанопродуцирующие клетки. В особенности настоящее изобретение относится к новому фагу φmru, в том числе к индукции фага, фаговым частицам и фаговому геному, а также полипептидам фага, также как и полинуклеотидам, которые кодируют эти полипептиды. Настоящее изобретение также относится к векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для получения этих полипептидов. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам определения направленной доставки и ингибирования микробных клеток, в особенности метанопродуцирующих клеток, с использованием описанного фага, полипептидов, полинуклеотидов, векторов экспрессии и клеток-хозяев.

Предпосылки к созданию изобретения

В Новой Зеландии сельскохозяйственная деятельность является причиной большинства выбросов парниковых газов. Следовательно, уменьшение сельскохозяйственного выброса парниковых газов является важным для соблюдения обязательств Новой Зеландией Киотского протокола. В соответствии с этим протоколом требуется сократить парниковые газы до уровней 1990 к концу первого периода обязательства (2008-2012). К концу этого срока группы аграрного сектора и правительство Новой Зеландии утвердили исследовательский консорциум по парниковым газам (Pastoral Greenhouse Gas Research Consortium (PGGRC)) для установления способов уменьшения выбросов парниковых газов сельского хозяйства Новой Зеландии.

Важной частью деятельности PGGRC было исследование в отношении уменьшения выбросов метана с новозеландских пастбищ. Уменьшение выбросов метана от жвачных животных представляет коммерческий интерес по двум причинам. Во-первых, не соблюдение обязательств по Киотскому протоколу заставит правительство приобретать квоты на выброс углерода. В настоящее время стоимость этого оценивается в 350 миллионов $. Во-вторых, образование метана приводит к потере 8-12% общей энергии, производимой в рубце. Эта энергия могла быть использована вместо этого для улучшения продуктивности жвачного животного.

Метан продуцируется в рубце микроорганизмами, называемыми метанопродуцентами, которые являются частью таксономического типа Euryarchaeota в царстве Archaea. Большинство метаногенов растут в CO₂ и H₂, как единственных источниках энергии, но некоторые могут использовать для роста ацетат или метильные соединения. В рубце существует несколько различных родов метанопродуцентов archaea, но виды рода Methanobrevibacter, в особенности M. ruminantium и M. Smithii, считаются преобладающими метанопродуцентами у жвачных животных Новой Зеландии. M. ruminantium в настоящее время является предметом проекта секвенирования генома, финансируемого PGGRC. Этот проект представляет собой первое секвенирование генома метанопродуцентов рубца, и его целью является улучшение понимания биологии Methanobrevibacter для обнаружения мишеней для ингибирования образования метана.

Для уменьшения продукции метана в рубце требуется ингибирование метанопродуцентов или инактивация их пути образования метана. Способом ингибирования образования метана является доставка специфических ингибирующих молекул в клетки метанопродуцентов. Это может достигаться, например, путем применения таких средств, как бактериофаг, который специфически направлен на метанопродуценты. Были охарактеризованы некоторые фаги для метанопродуцентов нежвачных животных, но не было опубликованных сообщений о способности фага инфицировать или лизировать метанопродуценты рубца. Следовательно, было бы очень предпочтительным идентифицировать фаг, который обладает способностью инфицировать клетки метанопродуцентов и/или доставлять ингибиторы.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к выделенному фагу φmru, в том числе фаговой частице и/или фаговому геному, полученному целиком или частично, а также к выделенным полинуклеотидам и полипептидам этого фага, описанным подробно в настоящей заявке.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полипептиду, содержащему по меньшей мере одну фаговую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69. В отдельном аспекте, этот полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-5 и 62-68. В дополнительном аспекте этот полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:63. В другом аспекте, этот полипептид представляет собой фрагмент, например, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, продолжающуюся от остатков 32-186 последовательности SEQ ID NO:63.

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему кодирующую последовательность по меньшей мере одного фагового полипептида. В одном аспекте, этот полинуклеотид содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69. В особом аспекте, полинуклеотид содержит кодирующую последовательность для последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-5 и 62-68. В дополнительном аспекте этот полинуклеотид содержит кодирующую последовательность для SEQ ID NO:63. В другом аспекте, полинуклеотид содержит фрагмент кодирующей последовательности, например по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, продолжающуюся от остатков 32-186 последовательности SEQ ID NO:63.

В дополнительном аспекте, настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты фага, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:74-142. В особом аспекте, этот полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:75-78 и 135-141, или в частности представляет собой SEQ ID NO:136. В другом аспекте, полинуклеотид представляет собой фрагмент или олигонуклеотид, содержащий, например, последовательность нуклеиновой кислоты, протяженностью от нуклеотидов 94-558 последовательности SEQ ID NO:136. Кроме того, изобретение охватывает выделенный полинуклеотид или его фрагмент, который гибридизируется с любой из последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:74-142. Настоящее изобретение дополнительно охватывает выделенный полинуклеотид, содержащий комплементарную, обратно комплементарную, обратную последовательность или их фрагменты, любой из последовательностей нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид, содержащий кодирующую последовательность по меньшей мере одного фагового полипептида. В одном аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1-69. В особом аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2-5 и 62-68. В дополнительном аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности SEQ ID NO:63. В другом аспекте, вектор экспрессии содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, протяженностью от остатков 32-186 последовательности SEQ ID NO:63.

В качестве особого аспекта, настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, который продуцирует фаг φmru, целиком или частично, как подробно описано в настоящей заявке. В частности, вектор экспрессии может продуцировать фаговые частицы, фаговый геном или модифицированный фаг, содержащий любые его изменения, производные, варианты или фрагменты.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, например микробной клетке-хозяину, содержащей по меньшей мере один вектор экспрессии.

Настоящее изобретение в частности относится к антителу, индуцируемому в отношении полипептида, или полинуклеотида, описанного в настоящей заявке. В определенных аспектах, это антитело направлено по меньшей мере на одну полипептидую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69 или его модифицированной последовательности. В альтернативных аспектах, антитело индуцировано в отношении по меньшей мере фрагмента полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO:74-142, или его комплементарной или модифицированной последовательности. В другом аспекте, антитело содержит один или несколько слияний или конъюгатов по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, антимикробными пептидами и другими антибиотиками, описанными подробно в настоящей заявке.

Настоящее изобретение дополнительно относится к модифицированным фаговым полипептидам, например по меньшей мере одному из SEQ ID NO:1-69, включая биологически активные изменения, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящей заявке. Настоящее изобретение дополнительно относится к модифицированным антителам, например, направленным по меньшей мере на одну из последовательностей SEQ ID NO:1-69, включая биологически активные изменения, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящей заявке. Также описаны полинуклеотиды, кодирующие эти модифицированные полипептиды, а также изменения, фрагменты, варианты и производные описанных полинуклеотидов, векторы экспрессии, содержащие эти полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие эти векторы. В особых аспектах, в композициях и способах по изобретению используются эти модифицированные полинуклеотиды, или полипептиды, или соответствующие векторы экспрессии, или клетки-хозяева.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фаговым полипептидам, например по меньшей мере к полипептиду SEQ ID NO:1-69 или его модифицированным последовательностям, которые включают слияния или конъюгаты по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, антимикробными пептидами и другими антибиотиками, описанными подробно в настоящей заявке.

Изобретение относится к композиции, содержащей выделенный полипептид, например по меньшей мере полипептид SEQ ID NO:1-69, или его модифицированную последовательность. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей антитело, например, направленное по меньшей мере на одну из SEQ ID NO:1-69, или их модифицированную последовательность. Также описана композиция, содержащая выделенный полинуклеотид, например по меньшей мере один из SEQ ID NO:74-142, или их комплементарную или модифицированную последовательность. Дополнительно описана композиция, которая содержит вектор экспрессии, или клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии, в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может содержать любые биологически активные изменения, фрагменты, варианты и производные, описанные в настоящей заявке. Композиции могут содержать по меньшей мере один клеточный ингибитор (например, в виде слияния или конъюгата), и могут быть получены, например, в виде фармацевтических композиций или в виде добавок к пище, в частности компонентов кормов для жвачных животных.

Изобретение также относится к композиции по изобретению как части набора для направленной доставки, и/или ингибирования микробных клеток, в особенности клеток метанопродуцентов, в соответствии с описанными способами. Эти наборы содержат: a) по меньшей мере одну композицию, описанную в настоящей заявке; и b) необязательно, инструкции по применению, например, по направленной доставке в клетки или ингибированию клеточного роста, или репликации для метанопродуцентов или других микроорганизмов.

Настоящее изобретение относится к способу получения фага, указанный способ предусматривает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который содержит по меньшей мере часть фагового генома в условиях, подходящих для получения этого фага; и b) извлечение этого фага из культуры. В особых аспектах, этот фаг содержит по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69, или их модифицированные последовательности. В дополнительных аспектах, этот фаг содержит по меньшей мере один полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:74-142, или их модифицированных последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к способу получения фагового полипептида, указанный способ предусматривает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который содержит по меньшей мере часть кодирующей последовательности по меньшей мере одного фагового полипептида в условиях, подходящих для экспрессии этого полипептида; и b) извлечение этого полипептида из культуры. В особых аспектах, этот полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69, или их модифицированных последовательностей.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения фагового полипептида, например по меньшей мере одного из SEQ ID NO:1-69, который содержит слияние или конъюгат по меньшей мере с одним клеточным ингибитором, например соединениями против образования метана (например, бромэтансульфоновой кислотой), антителами и фрагментами антител, литическими ферментами, пептид-нуклеиновыми кислотами, противомикробными пептидами и другими антибиотиками, подробно описанными в настоящей заявке. Такой способ предусматривает: a) культивирование вектора экспрессии или клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, который содержит кодирующую последовательность по меньшей мере одного фагового полипептида в условиях, подходящих для экспрессии полипептида; b) образование фагового слияния или конъюгата (например, путем экспрессии слитой последовательности или химического конъюгата с клеточным ингибитором); и c) извлечение слияния или конъюгата. В особых аспектах, этот полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69, или их модифицированные последовательности.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования (например, роста или репликации) микробной клетки, в частности клетки метанопродуцента, предусматривающему: a) необязательно, получение или выделение по меньшей мере одного фагового полипептида; и b) контактирование клетки с фаговым полипептидом. В особом аспекте, полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-69, или ее модифицированную последовательность.

В качестве дополнительного признака настоящее изобретение также охватывает способ ингибирования (например, ингибирования роста или репликации) микробной клетки, в частности клетки метанопродуцентов, предусматривающий: a) необязательно, получение или выделение по меньшей мере одного фагового полипептида, который дополнительно содержит по меньшей мере один клеточный ингибитор; и b) контактирование клетки с фаговым полипептидом. В особом аспекте, полипептид содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-69, или ее модифицированной последовательности.

Настоящее изобретение также относится к способу определения и/или измерения уровней фага или соответствующего фагового полипептида или полинуклеотида, предусматривающему: 1) контактирование образца, полученного от индивида, с антителом, индуцированным в отношении фагового полипептида (например, по меньшей мере, одного из SEQ ID NO:1-69, или их модифицированных последовательностей) или соответствующего полинуклеотида; и 2) определение наличия или уровней антительного комплекса, образованного с полипептидом или полинуклеотидом в образце. Такие способы также могут быть использованы для определения и/или измерения уровней микробных клеток, в частности клеток метанопродуцентов.

Настоящее изобретение также относится к способу определения и/или измерения уровней фага или соответствующего фагового полинуклеотида (например, кодирующей последовательности фага), предусматривающему: 1) контактирование образца, полученного от индивида, с комплементарным полинуклеотидом (например, последовательностью, комплементарной любой из последовательностей SEQ ID NO:74-142, или их модифицированным последовательностям); и 2) определение наличия или уровней гибридизационного комплекса, образованного с фаговым полинуклеотидом в этом образце. Такие способы также могут быть использованы для определения и/или измерения уровней микробных клеток, в частности клеток метанопродуцентов.

В особых аспектах, в способах по изобретению используются in vivo или in vitro компоненты экспрессии. В других аспектах, в способах используются полипептиды, продуцируемые рекомбинантными, синтетическими или полусинтетическими способами, или полипептиды, продуцируемые эндогенными способами.

Другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже.

Краткое описание чертежей

Настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты его осуществления и со ссылкой на чертежи.

ФИГ. 1A-1B. M. ruminantium профаг φmru, демонстрирующий предполагаемые последовательности сайта интеграции attL и attR (ФИГ. 1A), прогнозируемые функциональные модули фага и генная структура (ФИГ. 1B).

Фиг. 1C: Индукция фага с помощью стерильного воздуха (окислительный стресс).

Фиг. 1D: Начальная индукция фага с использованием митомицина C.

Фиг. 1E: Агарозный гель-электрофорез ПЦР ампликонов индуцированного (кислородный стимул) и неиндуцированного M. ruminantium. Дорожки 2 и 4: 1 k.b. лестничный ДНК маркер от Invitrogen. Дорожки 1 и 3 представляют ПЦР с использованием пары праймеров R1F-L2R на ДНК, выделенной из индуцированных и неиндуцированных культур M. ruminantium, соответственно.

ФИГ. 2. Открытая рамка считывания профага φmru, пояснения и комментарии.

ФИГ. 3. Открытая рамка считывания профага φmru, пояснения, прогнозируемая функция и комментарии.

ФИГ. 4A-4B. M. ruminantium профаг φmru, информация о последовательности, включая кодирующие последовательности фага φmru (ФИГ. 4A), и аминокислотные последовательности фага φmru (ФИГ. 4B).

ФИГ. 5. Выравнивание последовательностей фага φmru ORF 2058 с PeiP из M. marburgensis и PeiW из M. wolfeii.

ФИГ. 6: Белковая последовательность logo последовательностей сигнального пептида из M. ruminantium, полученная с помощью LogoBar, демонстрирующая коровый консенсусный сигнал.

ФИГ. 7: Ингибирующее действие ORF 2058 на оставшиеся клетки M. ruminantium.

ФИГ. 8: Ингибирующее действие ORF 2058 на рост клеток M. ruminantium и продукцию метана.

Подробное описание изобретения

Определения

«Измененные» последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие фаговые полипептиды, в контексте настоящего изобретения, включают последовательности с делециями, вставками или заменами различных нуклеотидов, приводящие в результате к полинуклеотиду, который предпочтительно кодирует те же или функционально эквивалентные полипептиды. Кодируемый полипептид или антитело также может быть «измененным» и содержать делеции, вставки или замены аминокислотных остатков, которые дают молчащее изменение и приводят к функционально эквивалентному полипептиду. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть сделаны на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности, и/или амфипатической природы остатков, при условии сохранения биологической активности (например, ассоциации с клеткой или проникновения в клетку или лизиса клетки), или иммунологической активности (например, одного или нескольких антителосвязывающих сайтов) этого полипептида. Например, отрицательно заряженные аминокислоты могут включать аспарагиновую и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты могут включать лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, имеющими сходные значения гидрофобности, могут включать лейцин, изолейцин и валин, глицин и аланин, аспарагин и глутамин, серин и треонин, и фенилаланин и тирозин.

«Аминокислотная последовательность» в контексте настоящего изобретения, относится к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности, или любым их фрагментам, и к природным, рекомбинантным, синтетическим или полусинтетическим молекулам. Последовательности по изобретению содержат по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 5-10, от 10-20, от 20-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-150, 150-200, или 200-250, или 250-4000 аминокислот, и предпочтительно сохраняют биологическую активность (например, ассоциацию с клеткой, проникновение в клетку или лизис клетки) или иммунологическую активность (например, один или несколько сайтов связывания с антителом) исходной последовательности. В тех случаях, когда «аминокислотная последовательность», цитируемая в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности молекулы природного полипептида, считается, что аминокислотная последовательность и подобные термины не ограничивают аминокислотную последовательность до полной, исходной аминокислотной последовательности, связанной с полноразмерной молекулой.

«Амплификация» в контексте настоящего изобретения относится к получению дополнительных копий последовательности нуклеиновой кислоты и в основном проводится с помощью методик полимеразной цепной реакции (ПЦР), хорошо известных из уровня техники (Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).

Термин «антитело» следует понимать в самом широком смысле и предполагается включение интактных моноклональных антител и поликлональных антител. Этот термин также охватывает фрагменты и производные антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность. Антитела охватывают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов (Ig), т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммунологически взаимодействует) с антигеном. Антитела включают, но не только, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Fc, Fab, Fab', и Fab₂ фрагменты и экспрессионную библиотеку Fab.

Молекулы антитела относятся к любому из классов IgG, IgM, IgA, IgE, и IgD, которые отличаются друг от друга природой тяжелой цепи, находящейся в молекуле. Эти молекулы также включают подклассы, такие как IgG1, IgG2, и другие. Легкая цепь может представлять собой каппа цепь или лямбда цепь. Ссылка в настоящем описании на антитела включает ссылку на все классы, подклассы и типы. Также включены химерные антитела, например моноклональные антитела или их фрагменты, которые специфичны более чем к одному источнику, например одной или более, последовательностям мыши, человека или жвачного животного. Дополнительно включены антитела верблюдовых или нанотела. Будет понятно, что каждая ссылка на «антитела» или любой подобный термин в настоящем описании включает интактные антитела, а также любые их фрагменты, измерения, производные или варианты.

Термины «биологически активный» или «функциональный», в контексте настоящего описания, относятся к полипептиду, сохраняющему одну или несколько структурных, биологических или биохимических функций (например, ассоциацию с клеткой, проникновение в клетку или лизис клетки) последовательности.

Термины «клеточный ингибитор» или «ингибитор», в контексте настоящего писания, относятся к средствам, которые снижают или блокируют рост или репликацию микробных клеток, в особенности клеток метанопродуцентов. Клеточный ингибитор может действовать для снижения или блокировки, например, клеточного деления. Ингибитор может снижать или блокировать, например, синтез ДНК, синтез РНК, синтез белка, или посттрансляционные модификации. Ингибитор также может снижать или блокировать активность ферментов, вовлеченных в каскад образования метана. Ингибитор может делать мишенью клетку для распознавания компонентами иммунной системы. Ингибирование клетки также включает уничтожение клетки и клеточную гибель, например, в результате лизиса, апоптоза, некроза, и т.д. Подходящие ингибиторы включают, но не только, соединения против образования метана (например, бромэтансульфоновую кислоту), антитела и фрагменты антител, лизирующие ферменты, пептид-нуклеиновые кислоты, антимикробные пептиды и другие антибиотики, подробно описанные в настоящей заявке.

Термины «комплементарный» или «комплементарность», в контексте настоящего изобретения, относятся к природному связыванию полинуклеотидов в пермиссивных солевых и температурных условиях путем спаривания оснований. Для последовательности A-G-T комплементарной последовательностью является T-C-A, обратно комплементарная последовательность представляет собой A-C-T, и обратная последовательность представляет собой T-G-A. Комплементарность между двумя одноцепочечными молекулами может быть частичной, при которой только некоторые из нуклеиновых кислот связываются, или может быть полной, когда существует абсолютная комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот оказывает существенные воздействия на эффективность и прочность гибридизации между цепями нуклеиновых кислот. Это имеет особое значение в реакциях амплификации, которые зависят от связывания между цепями нуклеиновых кислот, и в создании и применении молекул ПНК.

Термин «производное» в контексте настоящего изобретения относится к химической модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей фаговый полипептид, или нуклеиновой кислоты, комплементарной ей. Такие модификации включают, например, замену водорода алкилом, ацилом, или аминогруппой. В предпочтительных аспектах, производное нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, который сохраняет биологическую или иммунологическую функцию природной молекулы. Производный полипептид представляет собой полипептид, который модифицирован путем гликозилирования, пэгилирования или любым аналогичным способом, который сохраняет одну или несколько биологических функций (например, ассоциацию с клеткой, проникновение в клетку или лизис клетки) или иммунологическую функцию последовательности, производным которой он является.

Термин «гомология» в контексте настоящего изобретения относится к степени комплементарности. Гомология может быть частичной (т.е. идентичность менее 100%) или полной (т.е. 100% идентичность). Частично комплементарную последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию идентичной последовательности с целевой нуклеиновой кислотой, называют с использованием функционального термина «по существу гомологичная». Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с целевой последовательностью может быть исследовано с помощью гибридизационного анализа (Саузерн или нозерн блот, гибридизация в растворе и подобное) в условиях низкой жесткости. По существу гомологичная последовательность или гибридизационный зонд будет конкурировать за связывание или ингибировать связывание полностью гомологичной последовательности с целевой последовательностью в условиях низкой жесткости. Нельзя сказать, что условия низкой жесткости таковы, что допускается неспецифическое связывание; условия низкой жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей друг с другом было специфичным (т.е. селективным) взаимодействием.

Термин «гибридизация» в контексте настоящего изобретения относится к любому процессу, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты связывается с комплементарной цепью посредством спаривания оснований.

«Вставка» или «добавление» в контексте настоящего изобретение относится к изменению в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, приводящему к добавлению одного или нескольких аминокислотных остатков или нуклеотидов, соответственно, по сравнению с природной молекулой.

«Метанопродуцент» в контексте настоящего изобретения относится к микроорганизмам, которые продуцируют газ метан, которые включают Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, и Methanosarcina. Характерные метанопродуценты включают, но не только, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanobrevibacter acididurans, Methanobrevibacter thaueri, Methanobacterium bryantii, Methanobacterium formicicum, Methanothermobacter marburgensis, Methanothermobacter wolfeii, Methanosphaera stadtmanae, Methanomicrobium mobile, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanococcoides burtonii, и Methanolobus taylorii. Все рода и виды метанопродуцентов охватываются этим термином.

«Микробные» клетки в контексте настоящего изобретения относятся к природным или генетически модифицированным микробным клеткам, в том числе архебактериям, таким как метанопродуценты, галофилы и термоацидофилы, и эубактериям, таким как цианобактерии, спирохеты, протеобактерии, а также грамположительным и грамотрицательным бактериям.

Термин «модифицированная» относится к измененным последовательностям и к фрагментам, вариантам и производным последовательностей, описанных в настоящем изобретении.

«Последовательность нуклеиновой кислоты» или «нуклеотидная последовательность» в контексте настоящего изобретения относится к последовательности полинуклеотида, олигонуклеотида или их фрагментам, и к ДНК или РНК природного, рекомбинантного, синтетического или полусинтетического происхождения, которая может быть односпиральной или двухспиральной, и может представлять смысловую или антисмысловую цепь, и кодирующие или некодирующие области. Последовательности по настоящему изобретению наиболее предпочтительно включают последовательности, кодирующие полипептид, которые содержат по меньшей мере 12, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 300, 450, 600, 750 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 15-30, 30-60, 60-90, 90-120, 120-150, 150-300, 300-450, 450-600, или 600-750 нуклеотидов, или по меньшей мере 1000 нуклеотидов, или по меньшей мере 1500 нуклеотидов. Будет понятно, что каждая ссылка на «последовательность нуклеиновой кислоты» или «нуклеотидную последовательность» в настоящем изобретении будет включать исходную полноразмерную последовательность, а также любые ее комплементнарные последовательности, фрагменты, изменения, производные или варианты.

Термин «олигонуклеотид» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 15, 18, 21, 25, 27, 30 или 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 12 до 36 нуклеотидов, или по меньшей мере от 15 до 30 нуклеотидов, которая может быть использована, например, в ПЦР амплификации, секвенировании или гибридизационных анализах. В контексте настоящего изобретения олигонуклеотид по существу является эквивалентным терминам «амплимеры», «праймеры», «олигомеры», «олиги» и «зонды», как обычно определено в данной области.

«Полипептид» в контексте настоящего изобретения относится к выделенным полипептидам по изобретению, полученным из любых видов, предпочтительно микробных, из любого источника, природного ли, синтетического, полусинтетического или рекомбинантного. В особенности фаговый полипептид может быть получен из клеток метанопродуцентов, таких как клетки Methanobrevibacter, в частности клеток M. ruminantium, или M. smithii. Для рекомбинантного получения полипептид по настоящему изобретению может быть получен из микробных или эукариотических клеток, например, Escherichia, Streptomyces, Bacillus, Salmonella, дрожжей, клеток насекомых, таких как Drosophila, клеток животных, таких как клетки COS и CHO, или клеток растений. Будет понятно, что каждая ссылка на «полипептид» в контексте настоящего изобретению будет включать исходную, полноразмерную последовательность, а также любые ее изменения, производные или варианты.

Термин «полинуклеотид», используемый в единственном или множественном числе, в основном относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, например любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые могут представлять собой немодифицированную РНК или ДНК, или модифицированную РНК или ДНК. Этот термин включает, без ограничения, одноцепочечную и двухцепочечную ДНК, ДНК, содержащую односпиральные и двухспиральные области, односпиральную и двухспиральную РНК и РНК, содержащую односпиральные и двухспиральные области, гибридные молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть односпиральными или, чаще, двухспиральными, или содержат односпиральные и двухспиральные области. Также включены РНК или ДНК, содержащие трехспиральные области, или как РНК, так и ДНК. В особенности включены мРНК, кДНК и геномные ДНК, и любые их фрагменты. Этот термин включает ДНК и РНК, которые содержат одно или несколько модифицированных оснований, таких как оснований, меченых тритием, или необычных оснований, таких как инозин. Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут охватывать кодирующие или некодирующие последовательности, или смысловые или антисмысловые последовательности, или iРНК, такие как siРНК. Будет понятно, что каждая ссылка на «полинуклеотид» или подобный термин в контексте настоящего изобретения будет включать полноразмерные последовательности, а также любые их комплементарные последовательности, фрагменты, измерения, производные или варианты.

«Пептид-нуклеиновая кислота» или «ПНК» в контексте настоящего изобретения относится к антисмысловой молекуле, или противогенному средству, которая содержит основания, связанные через пептидный скелет.

Термин «жвачное животное» в контексте настоящего изобретения относится к животным, у которых имеется рубец как особый тип пищеварительного органа. Жвачные животные включают, но не только, крупный рогатый скот, овец, коз, быков, лосей, карибу и оленей.

Термины «условия жесткости» или «жесткость» в контексте настоящего изобретения относятся к условиям гибридизации, определяемым нуклеиновой кислотой, солью и температурой. Эти условия хорошо известны из уровня техники и могут быть изменены в порядке для идентификации или выявления идентичных или родственных полинуклеотидных последовательностей. Смотри, например, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY. Многочисленные эквивалентные условия, предусматривающие либо низкую, либо высокую жесткость, зависят от таких факторов, как длина и природа последовательности (ДНК, РНК, нуклеотидный состав), природы мишени (ДНК, РНК, нуклеотидный состав), окружающих условий (в растворе или иммобилизованы на твердом субстрате), концентрации солей или других компонентов (например, формамида, декстран сульфата и/или полиэтиленгликоля), и температуры реакций (в пределах интервала примерно от 5°C ниже температуры плавления зонда примерно до 20°C-25°C ниже температуры плавления). Один или несколько факторов могут быть изменены для создания условий либо низкой, либо высокой жесткости, отличных от перечисленных выше условий, но эквивалентных им.

Термин «индивид» включает людей и животных, не относящихся к людям. Животные, не относящиеся к людям, включают, но не только, птиц и млекопитающих, таких как жвачные животные, и, в частности, мышей, кроликов, кошек, собак, свиней, овец, коз, коров и лошадей.

Термины «по существу очищенный» или «выделенный» в контексте настоящего изобретения относится к последовательностям нуклеиновых или аминокислот, которые выделены из их клеточной, рекомбинантной или синтетической среды, и по меньшей мере на 60% свободны, предпочтительно на 75% свободны, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% свободны или по меньш