Способы и применения, включающие гемсвязывающий белок 1

Способы и применения, включающие гемсвязывающий белок 1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу скрининга на модулятор экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), способу диагностирования сердечно-сосудистого заболевания у индивида, применению HEBP1 для идентификации лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболевания, связанного с дисфункцией eNOS, в частности сердечно-сосудистого заболевания, применению HEBP1 для обнаружения компонента передачи сигнала при экспрессии eNOS и применению HEBP1 для регуляции активности промотора eNOS.

Синтазы оксида азота (EC 1.14.13.39; NOS) были открыты в 1998, и в то время физиологическое значение их продукта, оксида азота (NO), который является самой маленькой биоактивной молекулой млекопитающих, было неизвестно. Между тем было установлено, что NO является важным мессенджером в регуляции сосудистого тонуса сердечно-сосудистой системы, служит вторичным мессенджером центральной нервной системы и обладает защитным механизмом против бактериальных и опухолевых клеток. В 1989 Нобелевская премия по медицине была присуждена Robert Furchgott, Ferid Murad и Luis J. Ignaro, которые идентифицировали NO в качестве мессенджеров клеток млекопитающих.

NOS являются членами семейства родственных ферментов, кодируемых отдельными генами. NOS является одним из самых регулируемых ферментов биологии. Существует три известных изоформы, две из них являются конститутивными (cNOS), а третья - индуцибельной (iNOS). Клонирование ферментов NOS показало, что гены cNOS включают гены, конститутивные как в головном мозге (NOSl, nNOS или нейронной NOS), так и в эндотелии (NOS3, eNOS, cNOS или эндотелиальной NOS), ген третьей изоформы является индуцибельным геном (NOS2, iNOS или индуцибельной NOS).

В головном мозге nNOS является растворимым ферментом с молекулярной массой 161 кДа и представляет собой самую большую изоформу NOS. Эта изоформа конститутивно экспрессируется в основном в нейронах и в головном мозге и синтезирует лишь малые количества NO. Регуляция ферментативной активности опосредуется Ca²⁺ через кальмодулин. Однако на ферментативную активность также оказывает влияние фосфорилирование посредством зависимой от Ca²⁺-кальмодулина протеинкиназы 2, а также протеинкиназы A, C и G. В головном мозге NO важен для регуляции передачи сигнала в синапсе. Периферические кровеносные сосуды и гладкомышечные клетки часто иннервируются нервами, которые вырабатывают NO и действуют антагонистически по отношению к симпатической нервной системе. Кроме того, большие количества nNOS были обнаружены в скелетной мышце, в которой NO контролирует мышечную сократимость и локальный кровоток.

Индуцибельная NOS экспрессируется в макрофагах, но также в других клетках после индукции бактериальным LPS или цитокинами. Как и nNOS, iNOS является по большей части растворимым белком, имеющим молекулярную массу 131 кДа, который вырабатывает огромные количества NO. iNOS регулируется на транскрипционном уровне различными стимулами. После индукции ее экспрессии выработка NO проходит по цитотоксическому принципу макрофагов при разрушении микроорганизмов и паразитов, а также опухолевых клеток. Однако NO может разрушать здоровые клетки организма и вызывать повреждения окружающей ткани. Большая часть воспалительных и аутоиммунных заболеваний характеризуется присутствием огромных количеств активированных макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов. Кроме того, iNOS также важна в патологии септического шока, который характеризуется резким расширением артериальных сосудов, гипотонией и повреждениями микрососудов.

Наконец, эндотелиальная NOS ответственна за большую часть синтезируемого в сосудах NO, который защищает от артериосклероза и тромбоза. Интактная eNOS является главным переключателем при физиологическом поддержании сосудистого гомеостаза и играет ключевую роль в патофизиологии сердечно-сосудистой системы. Выработка NO ферментом eNOS в сосудистом эндотелии опосредуется в основных условиях стимуляцией ряда агонистов рецепторов, таких как брадикинин, ацетилхолин и гистамин, а также гемодинамическим давлением протекающей крови. NO приводит к расширению всех типов кровеносных сосудов в результате стимуляции растворимой гуанилилциклазы и увеличения концентрации cGMP в гладкомышечных клетках. Соответственно, NO эндотелиальных клеток является важной эндогенной вызывающей расширение сосудов ответной частью на вазоконстрикцию под действием симпатической нервной системы или ренин-ангиотензиновой системы.

Помимо своего сосудорасширяющего свойства эндотелиальный NO имеет ряд сосудозащитных и антисклеротических свойств. Высвобождаемый в просвет сосудов NO является сильным ингибитором агрегации тромбоцитов и их адгезии к сосудистой стенке. Помимо защиты от тромбоза ингибируется выброс факторов роста, которые могли бы стимулировать пролиферацию гладкомышечных клеток. Было установлено, что у кроликов и мышей генетическое или фармакологическое ингибирование eNOS приводит к прогрессирующему артериосклерозу. Кроме того, эндотелиальный NO может модулировать экспрессию генов, вовлеченных в артериогенез. Это особенно отчетливо видно в случае хемотаксического белка из моноцитов (MCP1), молекул клеточной поверхности, таких как CD11/CD18, P-селектина, адгезивной молекулы 1 сосудистых клеток - VCAM-1 и внутриклеточной адгезивной молекулы - ICAM 1. Соответственно, предотвращается адгезия и инфильтрация липоцитов в сосудистую стенку, предохраняя, тем самым, от ранней фазы артериогенеза. Кроме того, NO ингибирует синтез ДНК, митогенез и пролиферацию сосудистых гладкомышечных клеток. Предполагается, что антипролиферативные эффекты опосредуются cGMP. Кроме того, NO может оказывать прямые эффекты посредством S-нитросилации белков, такие как антиапоптозный эффект в эндотелиальных клетках в результате нитросилации каспазы 3.

Ряд сердечно-сосудистых заболеваний был связан с недостатком биодоступного NO вследствие снижения синтеза и/или увеличения деструкции NO. Другие классические симптомы и заболевания включают гипохолестеринемию, сахарный диабет, гипертонию и неблагоприятные эффекты, опосредованные курением. Как подробно описано выше, патология различных сердечно-сосудистых заболеваний обычно основана на недостатке NO в результате эндотелиальной дисфункции. Недостаток биоактивности NO может быть обусловлен снижением экспрессии и/или активности eNOS, разрывом связей с eNOS, увеличением деструкции NO или ослаблением ответной реакции эффекторных систем для NO.

Консервативная терапия с использованием органических нитратов имеет большое число недостатков из-за выработки огромных количеств NO. В частности, при длительном лечении наблюдается значительное уменьшение эффекта нитрата, которое называют «толерантностью к нитратам». Составляющий 6-8 часов период без нитратов необходим для получения полного эффекта нитрата. Кроме того, обычными неблагоприятными эффектами нитрата являются головная боль, покрасневшая кожа («прилив крови») и риск сильного снижения кровяного давлении с рефлекторной тахикардией. Соответственно, идентификация новых лекарственных средств для долговременной терапии, которые могут индуцировать экспрессию функциональной eNOS и которые могли бы постоянно увеличивать количество биодоступного NO в отличие от нитрата, является интересной и чрезвычайно важной целью исследования. Вследствие своей важной физиологической и патофизиологической функции в организме животного (в том числе человека) важно выявить новые способы модуляции активности eNOS.

Соответственно, целью настоящего изобретения было выявление альтернативных механизмов модулирования активности eNOS.

Неожиданно было обнаружено, что гемсвязывающий белок 1 (HEBP1) вовлечен в активацию экспрессии eNOS. В частности, было установлено, что активность промотора eNOS значительно уменьшена при выключении HEBP1, используя РНК-технологии.

Соответственно, средства и способы взаимодействия с HEBP1 могут быть использованы для регуляции или изменения активности промотора eNOS и/или экспрессии eNOS.

Поэтому в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга на модулятор экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), который предусматривает

- наличие тест-системы, содержащей гемсвязывающий белок 1 (HEBP1) или его функционально активный вариант,

- приведение тест-системы в контакт с агентом и

- выявление эффекта агента на тест-систему, идентифицируя, тем самым, агент как модулятор экспрессии eNOS.

Как подробно описано выше, eNOS, также известная как синтаза 3 оксида азота (NOS3), синтезирует NO в кровеносных сосудах и вовлечена в регуляцию функционирования сосудов. Этот фермент, в частности, экспрессируется в различных типах эндотелиальных клеток артерий и вен. Однако также было устанолено, что eNOS экспрессируется в плаценте человека, в эпителиальных клетках почечных канальцев и клетках ободочной кишки кролика, и иммунная реакция с участием eNOS была также обнаружена в нейронах гиппокампа и в других областях головного мозга кролика. eNOS конститутивно экспрессируется и вырабатывает малые количества NO по сравнению с iNOS.

Фермент eNOS присутствует в виде гомодимера, причем каждый мономер составлен из нескольких субъединиц (схематическая иллюстрация iNOS представлена в Forstermann and Monzen, 2006, Circulation 113: 1708-1714). C-концевой редуктазный домен связывает никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), флавинмононуклеотид (FMN) и флавинадениндинуклеотид (FAD) и связан с кальмодулинсвязывающим доменом с оксигеназным доменом. Оксигеназный домен имеет простатическую гемовую группу и связывает 6(R)-5,6,7,8-тетрагидробиоптерин (BH₄), молекулярный кислород и L-аргинин. Редуктазный домен мономера связан с N-концевым оксигеназным доменом второго мономера. Все изоферменты NOS катализируют флавин-опосредованный электронный перенос со связанного с C-концом NADPH на гем в N-концевом домене. Электронный перенос в редуктазном домене с NADPH на флавин, а также с редуктазного домена на гем оксигеназного домена увеличивается при кальций-индуцированном связывании кальмодулина с NOS. В гемовой группе электроны используются для восстановления и активации молекулярного кислорода. Окисление L-аденина в L-цитролин происходит благодаря двум последовательным реакциям моноокисления, продуцирующим N^ω-гидрокси-L-аденин (NOHLA) в качестве промежуточного продукта, синтезируя, тем самым, NO.

Как подробно описано выше, дисфункция эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) связана с рядом заболеваний. Можно было подтвердить, что экспрессия eNOS уменьшена при различных заболеваниях, включающих сердечно-сосудистые заболевания, такие как сердечная недостаточность и инфаркт миокарда. Как ни удивительно, было установлено, что гемсвязывающий белок 1 (HEBP1) является фактором модуляции экспрессии eNOS, в частности, посредством взаимодействия с промотором eNOS. Этот факт можно использовать для выявления модулятора экспрессии eNOS, который составляет возможное терапевтическое средство для лечения заболевания, характеризующегося измененной экспрессией eNOS.

Заявленный способ скрининга на модулятор включает обеспечение тест-системы, включающей HEBP1. Как показано в контексте настоящего изобретения, HEBP1 является белком, взаимодействующим с промотором eNOS и, тем самым, изменяющим экспрессию eNOS. HEBP1 также называют гемсвязывающим белком 1, HBP, HEBP или p22HBP. Предполагается, что HEBP1 может связывать свободные порфиногены, которые могут присутствовать в клетке, и, таким образом, способствовать удалению этих потенциально токсичных соединений. Он связывается с высоким сродством с одной молекулой гема или порфиринов, при этом он обладает схожим сродством к металлопорфиринам, свободным порфиринам и N-метилпротопорфирину.

Аминокислотная последовательность белка человека состоит из 189 аминокислот и доступна в PubMed под входящим № NP 057071. Однако белок HEBP1 может также происходить из любого другого вида, и уже была опубликована последовательность белков HEBP1 других видов. Примеры включают Mus musculus (входящий № NP 038574, упоминаемый как Hebpl), Pan Troglodytes (входящий № XP_528742, упоминаемый как LOC473371), Gallus gallus (входящий № NP 001025925, упоминаемый как RCJMB04_2k3), Canis familiaris (входящий № XP_534884, упоминаемый как NOC477690) и Rattus norwegicus (входящий № XP_342776, упоминаемый как HEBP1_предсказанный).

Помимо любого природного варианта HEBP1, такого как видовой вариант или вариант сплайсинга, также могут использоваться модифицированные белки HEBP1. Следует отметить, что модифицированный белок HEBP1 или вариант HEBP1 является функционально активным вариантом в том отношении, что у варианта сохраняется его биологическая функция, заключающаяся во взаимодействии с промотором eNOS и модулировании экспрессии eNOS. Предпочтительно, определяют сохранение биологической функции, например регуляции экспрессии eNOS, составляющее по крайней мере 50%, предпочтительно по крайней мере 60%, более предпочтительно по крайней мере 70%, 80% или 90%, еще предпочтительнее 95% модуляторной активности природного HEBP1. Биологическую активность можно определить как описано в примерах, в частности в примерах 1, 2, 3 или 4 (например, используя линию клеток с геном репортера, находящимся под контролем промотора eNOS, такую как EA.crs03, или меченные биотином энхансеры транскрипции, такие как A012 или A013, или ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК, такой как мРНК для eNOS, или гашение триптофановой флуоресценции, или поляризации флуоресценции, или модели на животных).

Вариантом может быть молекула с доменом, состоящим из природного белка HEBP1, и по крайней мере один дополнительный компонент. Например, белок может быть соединен с маркером, таким как метка, используемая для очистки (например, метка в виде 6 His (или гексаHis), Strep-метка, HA-метка, метка в виде c-myc или метка в виде глутатион-S-трансферазы (GST)). В случае необходимости, например, в высокой степени очищенного белка или варианта HEBP1 могут использоваться два или множество маркеров (например, комбинация вышеуказанных маркеров или меток). В этом случае белки очищают с использованием двух или более отдельных хроматографических стадий, в каждом случае используя сродство первой, а затем второй метки. Примерами таких двойных или сдвоенных меток являются GST-His-метка (глутатион-S-трансфераза, слитая с полигистидиновой меткой), 6xHis-Strep-метка (6 остатков гистидина, слитых с Strep-меткой), 6xHis-маркер100-метка (6 остатков гистидина, слитых с 12-аминокислотным пептидом MAP-киназы 2 млекопитающего), 8xHis-HA-метка (8 остатков гистидина, слитых с меткой в виде эпитопа гемагглютинина), His-MBP (His-метка, слитая со связывающим мальтозу белком), FLAG-HA-метка (FLAG-метка, слитая с меткой в виде эпитопа гемагглютинина) и FLAG-Strep-метка. Маркер мог бы использоваться для обнаружения белка с меткой, при этом могли бы использоваться специфические антитела. Подходящие антитела включают антитела против HA (такие как 12CA5 или 3F10), против 6 His, против c-myc и против GST. Кроме того, белок HEBP1 можно было бы соединить с маркером отличного класса, таким как флуоресцентный маркер или радиоактивный маркер, который позволяет обнаружить HEBP1. В другом варианте осуществления HEBP1 мог бы быть частью гибридного белка, в котором вторая часть, такая как белковый компонент, обладающий ферментативной активностью, могла бы использоваться для обнаружения.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариантом HEBP1 мог бы быть фрагмент HEBP, который сохраняет способность взаимодействовать с промотором eNOS и регулировать экспрессию eNOS. Он может включать белки HEBP1 с короткими C- и/или N-концевыми делециями (например, делециями самое большее 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоты). Кроме того, фрагмент HEBP1 может быть, кроме того, модифицированным, как подробно описано выше в отношении белка HEBP1.

Альтернативно или дополнительно, белок HEBP1 или его вариант, описываемый выше, может содержать одну или несколько аминокислотных замен, в частности, в областях, не участвующих во взаимодействии с промотором eNOS и регулировании экспрессии eNOS. Однако предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены, при которых аминокислоту замещают химически подобной аминокислотой. Характерные консервативные замены находятся в группе алифатических аминокислот, в группе аминокислот, имеющих боковые цепи с алифатическими гидроксильными группами, в группе аминокислот, имеющих кислотные остатки, в группе амидных производных, в группе аминокислот с основными остатками или в группе аминокислот, имеющих ароматические остатки. Белок или фрагмент HEBP1 или его вариант с заменой может быть модифицирован, как подробно описано выше в отношении белка, или фрагмента, или варианта HEBP1. Ниже в описании настоящего изобретения все детали, приведенные в отношении белка HEBP1, также относятся к его функционально активным вариантам, кроме случаев, оговоренных особо.

Однако наиболее предпочтительно, если белком HEBP1 является природный белок HEBP1, еще предпочтительнее природный белок HEBP1 человека.

Как подробно описано выше, тест-система содержит белок HEBP1 или его функционально активные варианты. Тест-система может также включать дополнительные элементы, такие как средства для выявления эффекта модулятора на тест-систему для идентификации агента в качестве модулятора экспрессии eNOS. Подходящие средства для выявления эффекта модулятора подробно описываются по всему описанию настоящего изобретения. Тест-система может находиться в клеточной системе или бесклеточной системе в зависимости от преобладающих условий.

В случае способа настоящего изобретения тест-систему, содержащую HEBP1 или его функционально активный вариант, приводят в контакт с агентом. Агентом, исследуемым с помощью способа настоящего изобретения, может быть любое исследуемое вещество или исследуемое соединение любой химической природы. Он может быть уже известен в качестве лекарственного средства для заболевания. Альтернативно, он может быть известным химическим соединением, но для которого неизвестно, обладает ли оно терапевтическим эффектом, в другом варианте осуществления, и соединением может быть новое или пока неизвестное химическое соединение. Агентом может быть также смесь исследуемых веществ или исследуемых соединений.

В одном из вариантов осуществления способа скрининга по настоящему изобретению исследуемое вещество находится в виде библиотеки химических соединений. Библиотеки химических соединений включают множество химических соединений и были составлены из любого из множества источников, в том числе химически синтезированных молекул или природных продуктов, или были созданы с помощью способов комбинаторной химии. Они особенно подходят для высокомасштабного скрининга и могут быть составлены из химических соединений конкретной структуры или соединений конкретного организма, такого как растение. В контексте настоящего изобретения библиотекой химических соединений, предпочтительно, является библиотека, включающая белки и полипептиды или небольшие органические молекулы. Предпочтительно, размер небольшой органической молекулы, в частности, растворимого, неолигомерного, органического соединения составляет менее 500 Д.

В контексте настоящего изобретения тест-систему приводят в контакт с агентом в период времени и в условиях, подходящих для модулирования экспрессии eNOS и его выявления. Подходящие условия включают подходящую температуру и раствор во избежание, например, денатурации включенных белков или для поддержания жизнеспособности клеток, в случае их присутствия. Подходящие условия будут зависеть от конкретной выбранной тест-системы, и квалифицированный специалист способен выбрать такие условия, основываясь на свои общие знания.

После приведения тест-системы в контакт с агентом выявляют эффект агента на тест-систему. В последующем ряд различных систем выявления будет описан подробнее. Однако следует понимать, что они являются примерами, и могут быть также подходящими другие тест-системы.

Если агент оказывает специфический и значительный эффект на тест-систему, агент идентифицируют как модулятор экспрессии eNOS. Модулятор экспрессии eNOS в контексте настоящего изобретения означает агент, изменяющий, либо увеличивающий, либо уменьшающий, экспрессию eNOS. Предпочтительно, экспрессия eNOS увеличивается. В контексте настоящего изобретения экспрессия eNOS является модифицированной, т.е. уменьшенной или предпочтительно увеличенной, по сравнению с контролем, если экспрессия eNOS в соответствующей клетке, приведенной в контакт с модулятором, значительно ниже или выше, соответственно, экспрессии eNOS в контроле (т.е. той же самой клетке, не приведенной в контакт с модулятором). Квалифицированному в данной области специалисту известны статистические способы оценки того, являются две величины статистически отличными друг от друга, такие как проверка по критерию Стьюдента или проверка по критерию хи-квадрат.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессия eNOS составляет по крайней мере 110%, предпочтительно по крайней мере 125%, более предпочтительно по крайней мере 150%, 160%, 170%, 180% или 190%, еще предпочтительнее по крайней мере 200% и наиболее предпочтительно по крайней мере 300% от контроля.

Однако для способа по настоящему изобретению не требуется, чтобы эффект модулятора на экспрессию eNOS определялся в этом способе. Следует отметить, что способ скрининга может включать или может не включать стадию, на которой измеряется экспрессия eNOS. Альтернативно измерению экспрессии eNOS, могут использоваться способы выявления, свидетельствующие о модуляции экспрессии eNOS. Особенно в случае высокомасштабного скрининга предпочтительным могло бы быть использование очень легкой и надежной системы выявления, которая включает минимальное количество компонентов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тест-система может лишь включать белок HEBP1 (или его функционально активный вариант) и средство для выявления связывания агента/модулятора с белком в отсутствие дополнительных компонентов передачи сигнала, в которую вовлечены HEBP1 и eNOS. Такой системой может быть, например, система, в которой либо исследуемый агент, либо белок HEBP1 или его функционально активный вариант иммобилизован на носителе. Связывание агента с белком HEBP1 или его функционально активным вариантом можно выявить, в силу чего неиммобилизованный партнер по связыванию метят поддающимся обнаружению маркером. Подвергаемый иммобилизации компонент может быть иммобилизован на одном материале или на множестве различных материалов, которые способны к связыванию биомолекулы или ряда биомолекул, исходя из их физических характеристик. Такие материалы включают, но ими не ограничиваются, материалы для анионообменной хроматографии, материалы для катионообменной хроматографии, металлохелаты, пептиды, антитела, полимеры (синтетические или природные), бумагу и т.д.

Иммобилизованный компонент можно привести в контакт с мобильным (т.е. неиммобилизованным) возможным партнером по связыванию, при этом несвязанный мобильный партнер по связыванию удаляют по истечении периода времени, достаточного для создания возможности для связывания. Связывание мобильного и иммобилизованного компонентов можно обнаружить по присутствию маркера мобильного партнера по связыванию в месте иммобилизации иммобилизованного партнера. Например, ряд различных агентов, таких как белки, можно было бы иммобилизовать в многолуночном планшете и можно было бы проинкубировать с меченым белком HEBP1. В тех лунках, в которых обнаруживается маркер, произошло связывание между агентом и белком HEBP1. Соответствующий агент можно идентифицировать как потенциальный модулятор экспрессии eNOS.

Компонент, в частности белок, можно пометить рядом способов, для того чтобы создать возможность для адекватного выявления или очистки. Обычные способы мечения могут использоваться для мечения одной или более функциональных групп на поверхности компонента. В случае белка ими могли бы быть, например, первичные аминогруппы, присутствующие на N-конце каждой полипептидной цепи и в боковой цепи остатков лизина; сульфгидрильные группы, присутствующие на остатках цистеина, сделанные доступными посредством обработки дисульфидных связей восстанавливающим агентом или сделанные имеющимися в наличии посредством модификации остатков лизина с помощью такого реагента, как SATA; или углеводные группы, обычно присутствующие в Fc-области антител, которые могут быть подвергнуты окислению с созданием активных альдегидов для соединения. Компонент или белок можно пометить с использованием ряда различных агентов, таких как биотин (в случае реакции авидина с биотином), ферменты, активированные флуоресцентные красители для мечения аминов, сульфгидрильных или других функциональных групп, например, FITC, флуоресцеином, родамином, синими красителями или Alexa Fluos. Также может использоваться радиоактивная метка, такая как ³H, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I или ¹⁴C, а также обычные ферментативные метки, включающие пенициллиназу, пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу.

В случае способа настоящего изобретения может использоваться любой подходящий способ выявления. Подходящие способы можно выбрать в зависимости от характеристик тест-системы и исследуемых агентов. Как подробно описано выше, HEBP1 вовлечен в передачу сигнала при экспрессии eNOS. Соответственно, можно определить взаимодействие агентов с HEBP1 (или его вариантом) или компонентом, предшествующим HEBP1 при передаче сигнала. Взаимодействие можно определить непосредственно или опосредованно. «Непосредственно» означает, что определяют связывание агента с HEBP1 (например, используя меченый маркер для выявления комплексов HEBP1/агент). «Опосредовано» означает, что определяют эффект передачи сигнала от HEBP1 (например, активность промотора eNOS, уровень мРНК для eNOS или количество белка eNOS). Подходящие способы подробно описаны, например, в примерах.

В первом случае определяют взаимодействия агента с белком. В данной области известен ряд анализов, в которых может использоваться тест-система и к которым может быть приспособлена тест-система. Это могут быть гетерогенные или гомогенные анализы. Как используется в настоящем описании, гетерогенным анализом является анализ, который включает одну или более стадий промывки, тогда как в гомогенном анализе такие стадии промывки не нужны. Реагенты и соединения только смешивают и измеряют.

В варианте осуществления анализом является ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), DELFIA (усиленный диссоциацией лантанидный флуоресцентный иммуноанализ), SPA (сцинтилляционный анализ сближения), анализ с использованием системы FlashPlate, анализ с использованием FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции), анализ с использованием TR-FRET (резонансного переноса энергии флуоресценции с временным разрешением), анализ на основе FP (поляризации флуоресценции), ALPHA (усиленный люминесцентный гомогенный анализ сближения), анализ на основе EFC (комплементации фрагментов фермента), двугибридный скрининг или анализ коиммунопреципитации.

Анализы на основе ELISA (иммуноферментного твердофазного анализа) предлагаются различными компаниями. Он представляет собой биохимический способ, используемый для обнаружения присутствия антитела или антигена в образце. Выполнение ELISA включает использование по крайней мере одного антитела со специфичностью в отношении конкретного антигена (например, сегмента первого или второго белка). Обычно на поверхности иммобилизуют неизвестное количество антигена в образце. Затем всю поверхность заливают конкретным антителом. Это антитело связано с ферментом, который создает поддающийся обнаружению сигнал, такой как изменение цвета или флуоресценция. Например, образец с неизвестным количеством антигена подвергают иммобилизации на твердой подложке (обычно титрационном микропланшете) либо неспецифически (с помощью адсорбции к поверхности), либо специфически (с помощью улавливания другим антителом, специфичным в отношении этого же антигена, в «сэндвич»-ELISA). После иммобилизации антигена добавляют предназначенное для обнаружения антитело, образующее комплекс с антигеном. Предназначенное для обнаружения антитело может быть ковалентно связано с ферментом или само может выявляться с помощью второго антитела, которое связано с ферментом благодаря биоконъюгации. В промежутках между всеми стадиями планшет обычно промывают слабым раствором детергента для удаления любых белков или антител, которые связались неспецифически. После конечной стадии промывки планшет проявляют посредством добавления субстрата для фермента с созданием видимого сигнала, который указывает на количество антигена в образце. В более ранних ELISA используются хромогенные субстраты, хотя в более новых анализах применяются флуорогенные субстраты с намного большей чувствительностью.

Анализы на основе DELFIA (усиленного диссоциацией лантанидного флуоресцентного иммуноанализа) являются твердофазными анализами. Антитело обычно метят европием или другим лантанидом и флуоресценцию европия выявляют после вымывания несвязанных меченных европием антител.

В SPA (сцинтилляционном анализе сближения) и в анализе с использованием системы FlashPlate обычно используются взаимодействия биотин/авидин для улавливания меченных радиоактивным изотопом субстратов. Обычно реакционная смесь включает киназу, биотинилированный пептидный субстрат и γ-[³³P]ATP. После реакции биотинилированные пептиды улавливаются стрептавидином. При выявлении с использованием SPA стрептавидин связан с содержащими сцинтиллятор бусинками, тогда как при выявлении с использованием FlashPlate стрептавидин связан с внутренней частью лунки содержащих сцинтиллятор микропланшетов. После иммобилизации меченный радиоактивным изотопом субстрат находится достаточно близко к сцинтиллятору для стимуляции излучения света.

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) характеризует перенос энергии между двумя хромофорами без излучения. Хромофор-донор в своем возбужденном состоянии может переносить энергию с помощью механизма безызлучательного дальнодействующего диполь-дипольного взаимодействия на флуорофор-акцептор в непосредственной близости (обычно <10 нм). Поскольку обе молекулы являются флуоресцентными, перенос энергии часто называют «резонансным переносом энергии флуоресценции», хотя на самом деле энергия не переносится с помощью флуоресценции. FRET является способом, подходящим для выявления и количественного анализа взаимодействий белок-агент, взаимодействий белок-белок, взаимодействий белок-ДНК и белок-конформационные изменения. Для анализа связывания белка с агентом, одного белка с другим белком или белка с ДНК одну из молекул метят донором, а другую - акцептором и эти меченные флуорофорами молекулы смешивают. Если они присутствуют в несвязанном состоянии, эмиссия донора выявляется после его возбуждения. После связывания молекул донор и акцептор сближаются, и преимущественно отмечается эмиссия акцептора вследствие межмолекулярного FRET от донора к акцептору. Подходящие соседние элементы для FRET известны в данной области, и квалифицированный специалист сможет выбрать подходящую комбинацию меток для обоих антител. Как используется в настоящем описании в отношении донора и соответствующего акцептора, «соответствующий» относится к акцепторной флуоресцентной составляющей, имеющей спектр эмиссии, который перекрывается со спектром возбуждения донора. Однако оба сигнала должны быть разделимыми друг от друга. Соответственно, максимум для длины волны в спектре эмиссии акцептора должен предпочтительно превышать на по крайней мере 30 нм, более предпочтительно по крайней мере 50 нм, например, по крайней мере 80 нм, по крайней мере 100 нм или по крайней мере 150 нм максимум для длины волны в спектре возбуждения донора (смотри также пример 3.1).

Характерные донорные флуоресцентные составляющие, которые могут использоваться с различными акцепторными флуоресцентными составляющими в технологии FRET, включают флуоресцеин, люцеферовый желтый, B-фикоэритрин, 9-акридинизотиоцианат, люцеферовый желтый VS, производные 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоты, 7-диэтиламино-3-(4'-изотиоцианатофенил)-4-метилкумарин, сукцинимдил-1-пиренбутират и производные 4-ацетамидо-4'-изотиоцианатостильбен-2,2'-дисульфокислоты. Характерные акцепторные флуоресцентные составляющие, зависящие от используемых донорных флуоресцентных составляющих, включают LC-Red 610, LC-Red 640, LC-Red 670, LC-Red 705, Cy5, Cy5.5, сульфонилхлорид лиссамин-родамина B, тетраметилродамин изотиоцианат, родамин x изотиоцианат, эритрозин изотиоцианат, флуоресцеин, диэтилентриаминпентаацетат или другие хелаторы ионов лантанидов (например, европия или тербия). Донорные и акцепторные флуоресцентные составляющие можно получить, например, от Molecular Probes (Junction City, OR) или Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Альтернативно, резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением (TR-FRET) может использоваться для тест-системы по настоящему изобретению. В TR-FRET объединены TRF (флуоресценция с временным разрешением) и принцип FRET. Это сочетание объединяет преимущества TRF, заключающиеся в низком уровне фона, и гомогенный формат анализа FRET. Тогда как FRET уже был описан выше, TRF использует преимущества уникальных свойств лантанидов или другого донора с длительной продолжительностью эмиссии. Подходящие для TR-FRET доноры включают, среди прочих, хелаторы лантанидов (криптаты) и некоторые другие металлолигандные комплексы, которые могут иметь продолжительность флуоресценции во временном диапазоне от микро- до миллисекунд и которые поэтому также создают возможность для того, что перенос энергии происходит в измерениях от микро- до миллисекунд. Испускающие флуоресценцию хелаторы лантанидов использовались в качестве доноров энергии в конце семидесятых. Часто используемые лантаниды включают самарий (Sm), европий (Eu), тербий (Tb) и диспрозий (Dy). По причине их специфических фотофизических и спектральных свойств комплексы лантанидов представляют большой интерес для применения флуоресценции в биологии. В частности, они имеют большой стоксов сдвиг и очень длительные продолжительности эмиссии (от микросекунд до миллисекунд) по сравнению с более традиционными флуорофорами.

Обычно органические хромофоры используются в качестве акцепторов. Они включают аллофикоцианин (APC). Соответствующие детали в отношении TR-FRET, а также акцепторов приведены в WO 98/15830.

Анализы на основе поляризации флуоресценции (FP) представляют собой анализы, в которых используется поляризованный свет для возбуждения флуоресцентных пептидов-субстратов в растворе. Эти флуоресцентные пептиды свободны в растворе и поворачиваются, что вызывает превращение излучаемого света в деполяризованный. Если пептид-субстрат связывается с более большой молекулой, то его скорость поворачивания значительно уменьшается, и излучаемый свет остается в высокой степени поляризованным (смотри также пример 4.3).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения тест-систему приспосабливают к усиленному люминесцентному гомогенному анализу сближения (ALPHA). ALPHA представляет собой анализ в растворе, который был первоначально разработан Packard BioScience. ALPHA является анализом сближения на основе люминесценции, в котором один партнер по взаимодействию присоединен к донорным бусинкам, тогда как другой партнер соединен с акцепторными бусинками, при этом диаметр обоих видов бусинок составляет лишь приблизительно 250 нм. Соединение фотосенсибилизатор внедрено в донорную бусинку. С помощью этого соединения после освещения лазерным светом при длине волны, составляющей приблизительно 680 нм, кислород окружающей среды превращается в богатый энергией, короткоживущий атомарный кислород. Если вблизи нет акцепторной бусинки, атомарный кислород затухает без создания сигнала. Если донорная и акцепторная бусинки сближены (приблизительно 250 нм) посредством биологического взаимодействия присоединенных биомолекул, атомарный кислород, высвобождаемый донорной бусинкой, вызывает каскад люминесценции/флуоресценции в соседней акцепторной бусинке, приводя к в высокой степени усиленному сигналу в 520-620 нм диапазоне. Люминесцентный сигнал выявляют в подходящем считывающем устройстве. Ради большего количества деталей, в отношении методов ALPHA смотри Ullman et al, 1994, Proc. N