Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа ii в сочетании с ингибитором протеасом

Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа ii в сочетании с ингибитором протеасом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего опухолей, экспрессирующих CD20, в комбинации с ингибитором протеасом.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264 (19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и сохраняется до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson K.C. и др., Blood, 63 (6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973- 979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или α- или β-цепей антигенов гистосовместимости класса II, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег. №NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur; J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существуют два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, обладают цитотоксичностью, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидном слое	CD20 не локализованы в липидном слое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после связывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Протеасома 26S, которая также относится к мультикаталитическому комплексу протеиназ, является необычно высокомолекулярным комплексом (26S), который найден в цитоплазме и ядре многих типов эукариотических клеток. Протеасома включает центральное каталитическое ядро (20S) и два регуляторных кэпа (19S). Регуляторные кэпы (19S) присутствуют на каждом конце бочкообразного комплекса (20S) и регулируют поступление субстратов в центральное каталитическое ядро. Кэпы 19S выполняют функцию узнавания субстратов, меченных молекулами полипептида убиквитина (8,5 кДа) и предназначенных для деградации (см., например, обзор Coux О., Tanaka К, и Goldberg A., Ann. Rev. Biochem., 65, 801-847 (1996), Voges D., Annu. Rev. Biochem., 68, (1999) 1015-1068 (1999) и Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001)). После отделения от субстрата молекул убиквитина кэп 19S стимулирует денатурацию белка-субстрата для его введения в центральное каталитическое ядро.

Протеасома 26S высококонсервативна эволюционно, присутствует во всех известных эукариотических клетках и может составлять до 1,0% общего белка гомогенатов ткани. Протасома присутствует в цитоплазме и ядре клетки, что свидетельствует о ее функциональной роли в указанных отделах клетки (Tanaka К. и др., J. Cell Physiol., 139, 34-41 (1989), Amsterdam А. и др., Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 90, 99-103 (1993)).

В предшествующих исследованиях в протеасоме установлена локализация пяти различных протеолитически активных участков, каждый из которых ассоциируется с определенным компонентом комплекса (Wilk S. и Орловский М., J. Neurochem., 35 1172-1182 (1980), Wilk S. и Орловский М., J. Newochem., 40, 842-849 (1983), Орловский М. и Wilk S., Biochem. Biophys. Res. Comm., 101, 814-822 (1981)). Три основных протеазы по специфичности подобны химотрипсину, пепсину и пептидилглутамилпептидазе. Две другие пептидазы предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные карбоксильной группой аминокислот с разветвленной боковой цепью и аминогруппой нейтральных аминокислот с короткой боковой цепью (Орловский М., Biochemistry, 29, 10289-297 (1990)).

В настоящее время установлено, что протеасома является главной экстрализосомной протеолитической системой, принимающей участие в протеолитических путях, существенных для выполнения разнообразных функций клетки, таких как деление клеток, процессинг антигена и деградация коротко-живущих регуляторных белков, таких как онкобелки, факторы транскрипции и циклины (Ciechanover A., Cell, 79, 13-21 (1994), Palombell V.J., Rando O.J., Goldberg A.L. и Maniatis Т., Cell, 78, 773-785 (1994)). Поскольку протеасома играет ключевую роль в упорядоченной деградации циклинов в процессе клеточного цикла, она принимает участие в делении клеток. В дополнительных исследования было установлено, что нарушение любого из 12 из 13 генов, кодирующих субъединицы протеасомы дрожжей, приводит к остановке клеточной пролиферации или к неспособности осуществлять деградацию белков, что также свидетельствует о важной роли протеасомы в клеточном росте (Fujiwara Т. и др., J. Biol. Chem., 265, 16604-1613 (1990), Beynon, Int. Committee on Proteolysis News Letter (1994, 1-2, январь)). Следовательно, ингибирование протеасомы можно использовать для лечения заболеваний, вызванных аномальным делением клеток, таких как опухолевые заболевания.

Тот факт, что убиквитин-опосредованный протеасомный протеолиз играет решающую роль в активации NFkB, можно использовать в медицине благодаря применению ингибиторов протеасомы. Для образования активной формы NFkB необходим протеасома-опосредованный протеолиз р105, неактивных предшественников NFkB.

Кроме того, процессированная форма NFkB (р65/р50) сохраняется в цитозоле в качестве неактивного комплекса, связанного с ингибирующим белком IkB. NFkB активируется различными факторами благодаря стимулированию сигнального пути, который приводит к протеасома-опосредованной деградации IkB. Аномальная активация NFkB за счет стимуляции синтеза цитокинов наблюдалась во множестве воспалительных и инфекционных заболеваний. Активация NFkB также является существенным фактором в процессах ангиогенеза и экспрессии факторов адгезии, следовательно, ингибиторы протеасомы можно также использовать при лечении заболеваний, ассоциированных с сосудистой системой.

Известны различные ингибиторы протеасомы, описанные, например, в литературе, такой как Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001), WO 2004/004749 и Joazeiro С. и др. Раk Res., 66 (16), 7840-7842 (2006), которые все обладают свойством ингибировать активность протеасомы 26S. Такими ингибиторами протеасомы являются, например, производные пептидов, такие как альдегиды пептидов (например, MG132, MG115, СЕР-1615 или PSI), боронаты пептидов (например, бортезомиб (PS-341) или DFLB), эпоксикетоны пептидов (например, эпоксомицин, дигидроэпонемицин или производное эпоксомицина PR-171), или пептидные винилсульфоны (например, NLVS) и непептидные соединения, такие как салиноспорамид A (NPI-0052), производные салиноспорамида А, лактацистин или производные лактацистина (например, кластолактацистин-L-лактон (омуралид) или PS-519) (см. Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001), WO 2004/004749 и Joazeiro С. и др., Раr Res., 66 (16), 7840-7842 (2006)).

В статье Smolewski P. и др. (Leukemia Research, 30, 1521-1529 (2006)) описано дополнительное цитотоксичное действие in vitro бортезомиба и ритуксимаба, антител анти-CD20 типа I. В статье Wang M. и др. (Leukemia, 22, 179-185 (2008)) описано действие тройной комбинации бортезомиба, ритуксимаба и циклофосфамида in vitro на модели ксенотрансплантата одной клетки лимфомы коры головного мозга.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

Предпочтительно указанный ингибитор протеасомы характеризуется величиной IC₅₀ 5 мкМ или менее.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II характеризуются соотношением связывающих активностей с CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) по сравнению с ритуксимабом от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Ly1.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно указанный ингибитор протеасомы выбирают из группы, включающей альдегиды пептидов, боронаты пептидов, эпоксикетоны пептидов или салиноспорамид А.

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов линии зародышевых клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген легкой цепи иммуноглобулина человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методом рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами "химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. Biotechnol., 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют методами рекомбинантной ДНК, такие как антитела, выделенные из клеток хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL линии зародышевых клеток человека, не содержатся в нативном мотиве линии зародышевых клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает специфичное связывание антител с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной K_D 10^-8 мол./л или менее, предпочтительно 10^-9 мол./л или менее (например, 10^-10 мол./л), более предпочтительно величиной K_D 10^-10 моль./л или менее (например, 10^-12 мол./л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как анализ графика Скатчарда (например, Biacore®) на клетках, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (АЗКОЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, обозначает каждую легкую и тяжелую цепь, которая принимает непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют собой еще один объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антител", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" (участков CDR). "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антител включают (в направлении от N- до С-концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано в работе Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивациии CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукции апоптоза, АЗКОЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Bp35, BM5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа, тип I и тип II (см. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др.. Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
антитела анти-CD20 типа I	антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
CD20 локализованы в липидном слое	CD20 не локализованы в липидном слое
Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1)	Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1)
Полная емкость связывания	Пониженная емкость связывания
Гомотипическая агрегация	Повышенная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после связывания	Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (B1 IgG2a), гуманизированные антитела B-Ly1 IgG1 (химерные гуманизированные антитела IgG1, описанные в WO 2005/044859), 11В8 IgG1 (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела B-Ly1 (описанные в WO 2005/044859).

В отличие от анти-CD20 типа II соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ЕСАСС, гибридома. Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgG1 (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанные в WO 2004/056312).

«Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) с использованием указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Cy5, и ритуксимаба, конъюгированного с Cy5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) с использованием клеток Raji (АТСС, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС. №CCL-86) =

С И Ф   ( C y 5 / а н т и т е л а   а н т и − C D 20 ) С И Ф   ( C y 5 / р и т у к с и м а б ) × д о л я   C y 5   ( C y 5 / р и т у к с и м а б ) д о л я   C y 5   ( C y 5 / а н т и т е л а   а н т и − C D 20 )

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "доля Cy5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Cy5-в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих емкостей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Ly1, обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной АЗКОЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известным способом анализа АЗКОЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые, как известно, экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антител,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием обычного центрифугирования в градиенте плотности и осадок суспендируют в культуральной среде RPMI с плотностью 5×10⁶ клеток/мл,

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи ^5lCr^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10⁵ клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (МР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки- эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки отбирают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антител рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МР)/(МР-ПР)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антител, МР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в МР контроле (см. п.3.5), а ПР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в ПР контроле (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень АЗКОЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител. Превышение АЗКОЦ по сравнению с цитотоксичностью, измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, которые продуцируются теми же клетками хозяина (при использовании стандартных методов очистки, получения и хранения антител, известных специалисту в данной области), но которые не продуцируются клетками хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную АЗКОЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, описанной в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченных ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа II изотипа IgG1 обладают характерной КЗЦ. Антитела анти-CD20 типа II (изотипа IgG1) обладают пониженной КЗЦ по сравнению с антителами типа I. Предпочтительно антитела анти-CD20 типа II являются изотипами IgG1.

Антитела "ритуксимаб" (контрольные антитела, например анти-CD20 типа I) представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен антител мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, CD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (Reiff M.E. и др., Blood, 83 (2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность при измерении антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКОЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Ly1" обозначает гуманизированные антитела В-Ly1, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Ly1 (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO:1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO:2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgG1 человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Ly1" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Ly1" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3-SEQ ID No.20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No.3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и В-HL13, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Ly1" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированные антитела В-Ly1 предпочтительно являются антителами IgG1. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Ly1 гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875. Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Ly1 обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются бисекционными.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature BiotechnoL, 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Cumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature BiotechnoL, 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО). Наряду с приданием пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки NSO- и SP2/0-мышиной миеломы. Кроме того, в последнее время исследуется возможность продуцирования антител с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol,, 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S.L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в полигликозилированных формах. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и при выращивании данной клеточной линии в различных условиях культивирования проявляются даже самые незначительные различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5 (8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и, возможно, исключения значительного нежелательного побочного действия антител при сохранении простого способа получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgG1, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенные к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995), Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазы 111 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает АЗКОЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированными клетками СНО (см. публикации Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но являются практически непригодными для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что АЗКОЦ можно существенно повысить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "протеасома" обозначает протеасому 26S, описанную, например, в статьях Соих О., Tanaka К. и Goldberg A., Ann. Rev. Biochem., 65, 801-847 (1996), Voges D., Annu. Rev. Biochem., 68, 1015-1068 (1999) или Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001).

Термин "ингибитор протеасомы", используемый в описании заявки, обозначает агенты, которые ингибируют активность 26S протеасомы. Такие ингибиторы протеасомы включают, например, производные пептидов, такие как альдегиды пептидов (например, MG132, MG115, СЕР-1615, PSI или иммунопротеасома-специфичный ингибитор IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO=N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь, см. US 2006/0241056), боронаты пептидов (например, бортезомиб (PS-341) или DFLB), эпоксикетоны пептидов (например, эпоксомицин, дигидроэпонемицин или производное эпоксомицина карфилзомиб (PR-171), или пептидные винилсульфоны (например, NLVS) и непептидные с