Инъекционная лекарственная форма для лечения болезни паркинсона, способ ее приготовления и применение

Инъекционная лекарственная форма для лечения болезни паркинсона, способ ее приготовления и применение

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии и фармацевтике, и касается жидкой формы новой фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества - N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид (гимантан; патент СССР №1825499, «Гидрохлорид N-(2-адамантил)-гексаметиленимина, обладающий антикаталептической активностью», Бюл. «Изобретения. Полезные модели» №4, 2011 г.), для лечения болезни Паркинсона, в том числе острых форм паркинсонического синдрома.

Болезнь Паркинсона - одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, основным проявлением которого являются нарушения двигательного акта, сопровождающиеся акинезией, тремором, ригидностью. Общая распространенность паркинсонизма в Европе среди людей старше 65 лет составляет 1,6-1,8 случая на 100 человек. Из-за старения населения ожидается, что значение паркинсонизма как проблемы здравоохранения будет возрастать (Литвиненко И.В. Болезнь Паркинсона. М.: «Миклош», 2010. 216 с.; Handbook of Parkinson's disease / edited by Rajesh Pahwa, Kelly E. Lyons. 4th ed. 2007. 501 p.). Продолжающийся рост заболевания, инвалидизания вследствие заболевания, ухудшение качества жизни пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, недостаточно эффективное лечение заболевших создают серьезную социальную проблему.

Особую сложность при лечении болезни Паркинсона представляют острые формы паркинсонического синдрома, в частности акинетические кризы, которые требуют применение препарата в инъекционной лекарственной форме. До настоящего времени в мире единственным препаратом для лечения острых форм паркинсонического синдрома является ПК-Мерц (амантадин, мидантан) в инъекционной лекарственной форме. Однако существенными недостатками ПК-Мерц является недостаточная эффективность и широта действия, а также наличие существенных побочных эффектов со стороны нервной и сердечно-сосудистой системы.

Лекарственный препарат, действующим веществом которого является N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид, является оригинальным отечественным препаратом из группы производных адамантана и обладает высокой активностью и широким спектром антипаркинсонических эффектов.

Ранее была разработана фармацевтическая композиция (Патент РФ 2423981, Публикация: Бюл. №20; 20.07.2011 г.), содержащая эффективные дозы N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида для перорального применения в виде таблеток, которая может применяться для лечения больных, страдающих болезнью Паркинсона.

Описана антипаркинсоническая эффективность субстанции N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида. Установлено, что N-2-адамантил-гексаметиленимина гидрохлорид ослабляет основные проявления экспериментальною МФТП-индуцированого паркинсонического синдрома у мышей линии C57B1/6 и крыс - олигокинезию, ригидность, тремор. N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид обладает дофаминпозитивным действием, имеет свойства низкоаффинного неконкурентного блокатора ионного канала глутаматных рецепторов NMDA подтипа, обратимого ингибигора моноаминооксидазы МАО-В, проявляет умеренную антирадикальную и иммунотропную активность (Вальдман Е.А. Разработка фармакологического средства патогенетической терапии паркинсонизма на основе анализа механизмов действия производных аминоадамантана // Автореферат диссертации на соискание ученой степени д.м.н. Москва, 2001. 44 с.). Доказаны преимущества N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида по сравнению с рядом имеющихся противопаркинсонических препаратов. На модели МФТП-индуцированного паркинсонизма активность N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида проявляется при использовании меньших доз, по сравнению с мидантаном. При устранении нейролептической каталепсии действие N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида сопоставимо с эффектами L-ДОФА и циклодола и превосходит таковое мидантана. В противоположность мидантану N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид эффективно устраняет дрожательные проявления на моделях тремора, вызванного оксотреморином и ареколином, не уступая по выраженности эффекта циклодолу (Вальдман Е.А. Разработка фармакологического средства патогенетической терапии паркинсонизма на основе анализа механизмов действия производных аминоадамантана // Автореферат диссертации на соискание ученой степени д.м.н. Москва, 2001, 44 с.). ЭЭГ анализ показал, что эффект N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в отношении поведенческих проявлений паркинсонического синдрома, индуцированного нейротоксином МФТП и МФП+, коррелирует с нормализацией биоэлектрической активности структур головного мозга крыс (Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н., Воронина Т.А. Оценка защитного эффекта нового потенциального противопаркинсонического средства гимантана от нейротоксического действия МФТП // Эксперим. и клинич. фармакология. 2004. Т 67, №1. С.7-10; Неробкова Л.Н., Вальдман Е.А, Воронина Т.А., Маркина Н.В., Шаркова Л.М. Влияние нового производного аминоадамантана А-7 на проявления паркинсонического синдрома, вызванного системным введением нейротоксина МФТП //Эксперим. и клинич. фармакология. 2000. Т.63, №3. С.3-6).

Сущность изобретения заключается в разработке фармацевтической композиции в жидкой форме N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида, которая при парентеральном введении на моделях паркинсонического синдрома обеспечивает быстрое наступление эффекта, что определяет возможность его применения у больных с острыми формами паркинсонического синдрома, в том числе при акинетических кризах, когда требуется внутривенное введение препарата, и у больных, в силу тяжести состояния которых применение пероральной формы препарата невозможно, а также разработке на основе этой композиции жидких лекарственных форм, обладающих высокой биологической доступностью и отвечающих требованиям Государственной Фармакопеи (табл.1-4).

1. Фармацевтическая композиция на основе N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида

Фармацевтическая композиция выполнена в виде жидкой лекарственной формы, содержащей в качестве действующего вещества N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в терапевтически эффективном количестве, а также в качестве вспомогательных веществ воду для инъекций и/или физиологический раствор (раствор натрия хлорида 0,9% в воде для инъекций).

Были разработаны два варианта композиции. В первом случае фармацевтическая композиция для лечения паркинсонизма на основе N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида содержит терапевтически эффективное количество действующего вещества и в качестве растворителя воду для инъекций или физиологический раствор. Соотношение компонентов на одну ампулу, %:

N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид	0,25-5,00
вода для инъекций или физиологический раствор	остальное

Фармацевтическая композиция выполнена в жидкой лекарственной форме, в виде инъекционного раствора, содержащей 0,005-0,100 г N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида. Лекарственную форму получают прямым растворением N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в воде для инъекций или физиологическом растворе.

Второй вариант фармацевтической композиции на основе N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида содержит терапевтически эффективное количество действующего вещества и в качестве растворителя - физиологический раствор (раствор натрия хлорида 0,9% в воде для инъекций) при следующем соотношении компонентов (%) на один флакон:

N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид	0,005-0,15
натрия хлорид	0,9
вода для инъекций	остальное

Фармацевтическая композиция выполнена в жидкой форме, в виде раствора для инфузий, содержащего 0,005-0,150 г действующего вещества. Лекарственную форму получают путем прямого растворения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в воде для инъекций с добавлением натрия хлорида.

Следующие примеры иллюстрируют способ изготовления фармацевтической композиции.

Пример 1. Предварительно просеянные 50,0 г N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида (5,00 мас./об.%) помещают в мерную колбу. Добавляют воду для инъекций до 1000 мл. Тщательно перемешивают до полного растворения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида. Полученный раствор с помощью перистальтического насоса фильтруют через мембранный предварительно простерилизованный фильтр Millipor с размером пор 0,22 мкм, помещенный в фильтродержатель Sartorius. Первые порции фильтрата - 5 мл отбрасывают, профильтрованный раствор собирают в простерилизованную емкость для фильтрата на 1000 мл и закрывают простерилизованной крышкой. Ампулы промывают теплой и холодной деминерализованной водой, просушивают горячим воздухом и стерилизуют (прерывисто при температуре 180°C, 2 ч, непрерывно при 350°C в течение 10 мин). Очищенные и стерилизованные таким образом ампулы для инъекций асептически газируют азотом для вытеснения воздуха, заполняют раствором гидрохлорида N-адамант-2-ил-гексаметиленимина и дополнительно газируют азотом, после чего осуществляют запайку ампул. Ампулы стерилизуют в стерилизаторе ВК-30 паровом при 120°C в течение 8 минут.

Пример 2. Предварительно просеянные 0,5 г N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида (0,05 мас./об.%). 9,0 г натрия хлорида помещают в мерную колбу. Добавляют воду очищенную до 1000 мл. Тщательно перемешивают до полного растворения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гндрохлорида.

Флаконы помещают в емкость для мойки, заливают водой очищенной (так чтобы все флаконы находились под водой) и кипятят по 20 минут 3-4 раза. Вымытые флаконы помещают на поддон для сутки и сушат в сушильном шкафу при температуре 200°C в течение 30-40 минут до полного высыхания, далее помещают на стальной лоток и прокаливают в муфельной печи при температуре 900°C в течение 3 минут и укладывают в стерильный бюкс, обработанный 70% спиртом.

Полученный раствор с помощью перистальтического насоса фильтруют через мембранный предварительно простерилизованный фильтр Millipor с размером пор 0,22 мкм, помещенный в фильтродержатель Sartorius. Первые порции фильтрата - 5 мл отбрасывают, профильтрованный раствор собирают в простерилизованную емкость для фильтрата на 1000 мл и сразу же закрывают простерилизованной крышкой. Розлив раствора N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида производят с помощью дозатора автоматического поршневого медицинского во флаконы вместимостью 100 мл. Укупорку проводят резиновой пробкой под обкатку. Заполненные флаконы стерилизуют в стерилизаторе ВК-30 паровом при 120°C в течение 8 минут.

Пример 3. Предварительно просеянные 5,0 г N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида (1,00 мас./об.%) помещают в мерную колбу. Добавляют воду для инъекций до 500 мл. Тщательно перемешивают до полного растворения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида. Стерильную фильтрацию раствора, очистку и стерилизацию ампул, наполнение, закрывание и конечную стерилизацию проводят соответственно примеру 1.

Пример 4. Предварительно просеянные 1,0 г N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида (0,10 мас./об.%) и 9,0 г натрия хлорида помещают в мерную колбу. Добавляют воду очищенную до 1000 мл. Тщательно перемешивают до полного растворения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида. Стерильную фильтрацию раствора, очистку и стерилизацию флаконов и пробок, наполнение, закрывание и конечную стерилизацию проводят соответственно примеру 2.

Таким образом, разработана новая фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующего вещества N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид, а также достаточное количество вспомогательных веществ, что позволило получить стабильную при хранении лекарственную форму, легко высвобождающую активное вещество и обеспечивающую его высокую биодоступность и эффективность.

2. Фармакологическая эффективность N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме

Факт, что N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме при парентеральном, в том числе и внутривенном введении, обладает выраженной антипаркинсонической активностью, иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение эффективности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме на модели ареколинового тремора.

Эксперименты проводили на белых беспородных мышах массой 24-28 г с использованием методики ареколинового тремора (Воронина Т.А., Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению антипаркинсонической активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (ред. Р.У. Хабриев), изд. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Москва, 2005, С.295-305), Ареколин (специфический холинергический агонист, Serva Company) вводили подкожно в дозе 25 мг/кг. Исследуемые вещества вводили за 30 мин до введения ареколина, кроме случаев внутривенного введения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида, который вводили за 10 мин до ареколина. Регистрировали латентный период наступления и продолжительность генерализованного мелко- и среднеамплитудного тремора тела животного.

У контрольных животных под влиянием ареколина наблюдается выраженный тремор всего тела продолжительность 15, 13 минуты (табл.5). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме вводили внутрибрюшинно в дозах 5, 10 и 20 мг/кг или внутривенно в дозах 2,5 и 5 мг/кг. При внутрибрюшинном введении N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в дозах 5, 10 и 20 мг/кг вызывал достоверное уменьшение продолжительности ареколинового тремора, с максимальным эффектом в дозе 20 мг/кг, когда длительность тремора была в 1,78 раза меньше, чем в контрольной группе. При внутривенном введении эффект N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида значительно усиливался. В частности, одинаковый эффект наблюдался при использовании N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в дозе 10 мг/кг при внутрибрюшинном введении и в дозе 2,5 мг/кг при его введении внутривенно.

Антитреморный эффект N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида, являясь дозозависимым, усиливался при увеличении дозы препарата. Препарат сравнения мидантан (амантадин гидрохлорид) в дозе 20 мг/кг при внутрибрюшинном введении не обладал антитреморным действием на модели ареколинового тремора. Более того, после введения мидантана отмечалась тенденция к увеличению продолжительности тремора.

Таким образом, N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме при различных путях парентерального введения (внутрибрюшинно, внутривенно) обладает выраженным антитреморным действием, продемонстрированным на модели ареколинового тремора, и значительно превосходит по активности мидантан.

Пример 2. Изучение эффективности инъекционной лекарственной формы N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида на модели галоперидоловой каталепсии.

Исследования проводили на беспородных и C57BL/6 мышах-самцах массой 22-26 г. в тесте галоперидоловой каталепсии (Воронина Т.А., Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению антипаркинсонической активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (ред. Р.У. Хабриев), изд. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохрания и социального развития. Москва, 2005, С.295-305; Marti М., Mela F., Fantin M., Zucchini S., Brown J.M., Witta J., Di Benedettol M. Neurobiology of Disease Blockade of Nociceptin/Orphanin FQ Transmission Attenuates Symptoms and Neurodegeneration Associated with Parkinson's Disease. The Journal of Neuroscience, October 19, 2005. 25 (42): 591-9601). В каждой группе использовали по 10 животных.

2.1. В первом варианте опытов каталепсию вызывали внутрибрюшинным введением галоперидола в дозе 1 мг/кг. Исследуемые вещества вводили одновременно с галоперидолом. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду.

Антагонизм с галоперидолом оценивали по способности исследуемых веществ уменьшать время каталептогенного состояния у животных. Продолжительность каталепсии измеряли через 60 и 120 мин после введения веществ. Мышь располагали у горизонтального стержня, закрепленного на высоте 4 см диаметром 0,5 см таким образом, что она опиралась на стержень обеими передними лапками (поза лектора). Попытки придать животному нужную позу продолжали не более 1 мин. Фиксировали время пребывания животного в неподвижном состоянии - позе лектора. Максимальное время наблюдения составляло 2 мин.

Галоперидол в дозе 1 мг/кг (в/б) вызывал каталепсию у 100% мышей (табл.6). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной форме при внутрибрюшинном введении в дозе 10 мг/кг значительно снизил каталептогенный эффект галоперидола, уменьшив время нахождения мышей в неудобной позе в 2,4 раза и в 1,57 раза через 60 и 120 мин после введения нейролептика соответственно.

При введении N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг эффект препарата снижался. Антикателептогенное действие N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме при внутривенном введении было более выражено по сравнению с его внутрибрюшинном введением (табл.6). Мидантан уступал по активности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлориду при их внутрибрюшинном введении.

2.2. Во втором варианте опыта для получения каталепсии мышам C57BL/6 галоперидол вводили в малой дозе 0,1 мг/кг (внутрибрюшинно) через 48 часов после острого введения нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина гидрохлорида (МФТП, 30 мг/кг, внутрибрюшинно). Каталепсию оценивали методом, описанным выше. Данная модель с введением галоперидола в малой дозе (не приводящей к развитию каталепсии у интактных животных) мышам C57RL/6 с паркинсоническим синдромом, индуцированным однократным введением нейротоксина МФТП (Weihmuller F.B., Hadjiconstantinou M., Bruno J.P., Neff N.H. Administration of GM1 ganglioside eliminates neuroleptic-induced sensorimotor deficits in MPTP-treated mice // Neuroscience Letters, 92 (2), 207-212, 1988) может рассматриваться в качестве модели акинетического криза.

В клинической практике к развитию акинетических кризов при болезни Паркинсона могут приводить факторы, связанные с нарушением программы фармакотерапии, в частности назначение пациентам препаратов, блокирующих дофаминовые рецепторы (Федорова Н.В., Чигирь И.П., Кулуа Т.К. Алгоритм лечения развернутых стадий болезни Паркинсона // Атмосфера. Нервные болезни, №1, с.20-26, 2006).

Установлено, что введение галоперидола в малой дозе 0,1 мг/кг на фоне нейротоксина МФТП вызывает выраженную каталепсию у всех животных. N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в дозе 5 мг/кг внутривенно достоверно уменьшает время застывания мышей в позе лектора, особенно через 120 мин после введения галоперидола (табл.7), что указывает на его выраженный антикаталептогенный эффект и подтверждает возможность использования при акинетических кризах.

Таким образом, N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме при внутрибрюшинном и внутривенном введении обладает выраженным антикаталептогенным действием на модели галоперидоловой каталепсии и на модели акинетического криза, вызываемого введением малой дозы галоперидола животным с МФТП-индуцированным паркинсоническим синдромом.

Пример 3. Изучение эффективности инъекционной лекарственной формы N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида на модели паркинсонического синдрома, вызванного введением нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП).

Базисным методом, широко применяемым в России и за рубежом, для оценки действия противопаркинсонических средств является модель паркинсонического синдрома, вызванного введением животным нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина гидрохлорида (МФТП) (Воронина Т.А., Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению антипаркинсонической активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (ред. Р.У. Хабриев), изд. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохрания и социального развития, Москва, 2005, С.295-305; Przedborski S., Vila M. The 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropiridine mouse model. A tool to explore the pathogenesis of Parkinson's disease / Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V.991. P.189-198; Watanabe Y., Himeda T., Araki T. Mechanisms of MPTP toxicity and their implications for therapy of Parkinson's disease / Med. Sci. Monit. 2005. №11 (1). P.17-23). Нейротоксин МФТП оказывает влияние на центральное патогенетическое звено развития паркинсонического синдрома, а именно вызывает избирательное повреждение дофаминергических нейронов черной субстанции. Исследования проводили в опытах на мышах самцах линии C57BL/6 массой тела 24-26 г. МФТП (Sigma-Aldrich Company) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг. В каждой группе использовали 10-12 животных. Исследуемые вещества вводили за 30 минут (внутрибрюшинно) или за 10 минут (внутривенно) до введения МФТП. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду.

Эффективность N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме оценивали по его способности ослаблять основные проявления паркинсонического синдрома, вызываемого введением МФТП, - ригидность и олигокинезию.

3.1. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на ригидность мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом.

Ригидность измеряли через 15 минут после введения нейротоксина МФТП (однократно, внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг). Оценку выраженности ригидности проводили по длине шага животного (Stride Length Test) (Tillerson J.L., Miller G.W. Grid performance test to measure behavioral impairment in the MPTP-treated-mouse model of parkinsonism. J Neurosci Methods. 2003; 123 (2): 189-200). С этой целью передние и задние лапы животного окрашивали нетоксичными красками разных цветов и затем опускали его в узкий пенал (высота стенок 8 см, ширина 8 см, длина 50 см), пол которого выстлан белой бумагой. Измеряли расстояние (по прямой) между следами передней и задней лапок в 5 шагах животного. Шаги в начале и в конце аллеи не учитывали.

Ригидность определяли также по изменению мышечного тонуса задних лап мышей по сопротивлению пассивной флексии в голеностопном суставе и по симптому "горбатости", выраженность которого определяется по укорочению расстояния от шеи до основания хвоста за счет сгорбленности животного.

N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме вводили внутрибрюшинно в дозах 5, 10 за 30 минут до введения МФТП и внутривенно в дозе 5 мг/кг за 10 минут до МФТП. Мидантан вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг за 30 минут до введения МФТП.

Установлено, что через 10-15 минут после введения МФТП у мышей появлялись ретро- и/или латеропульсия и отчетливая ригидность. Это выражалось в нарушениях походки, напряжении передних и задних конечностей, изменении длины шага и появлении «горба».

На фоне МФТП длина шага достоверно уменьшалась по сравнению с группой интактного контроля, что свидетельствовало о развитии у животных ригидности (табл.8).

Под влиянием N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной форме в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно отмечалось снижение ригидности, что выразилось в достоверном увеличении длины шага на 1,14 раза по сравнению с группой животных, получавших только МФТП. Выраженный эффект наблюдался и при внутривенном введении N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме (табл.8). Мидантан оказывал достоверное влияние на ригидность мышей в дозе 20 мг/кг (табл.8).

Полученные результаты свидетельствуют о способности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме при внутрибрюшинном и внутривенном введении уменьшать ригидность, вызванную нейротоксином МФТП.

3.2. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на олигокинезию мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом.

Олигокинезия при паркинсоническом синдроме, вызванном введением нейротоксина МФТП, включает уменьшение как количества, так и качества двигательной локомоторной активности животных. Для оценки олигокинезии, возникающей после введения МФТП, использовали 4 методики: методику «Открытое поле», актометр (Opto-varimex, Columbia instruments USA), тест вращающегося горизонтального стержня (Rota Rod test, Ugo Basile, Италия) и тест вертикального стержня (Pole test).

3.2.1. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на олигокинезию мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом в тесте «Открытого поля».

«Открытое поле» представляет собой квадратный ящик размером 40×40 см и высотой 20 см, разделенный на 25 квадратов со стороной 8 см. Мышь помещали в центр открытого поля и затем в течение 3-х минут осуществляли регистрацию двигательной активности (число горизонтальных и вертикальных перемещений). Регистрацию активности животных в «Открытом поле» проводили через 90 минут после введения нейротоксина МФТП в дозе 30 мг/кг (однократно, внутрибрюшинно). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме вводили внутрибрюшинно в дозах 5, 10 и 20 мг/кг за 30 минут до начала регистрации эффекта. Внутривенное введения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида проводили за 10 минут до введения нейротоксина. Мидантан в дозе 20 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 30 минут до МФТП.

Исследования в тесте «Открытое поле» показали, что через 90 минут после введения нейротоксина МФТП у животных отмечалась высокая степень олигокинезии, которая выражалась в снижении горизонтальной и вертикальной двигательной активности (табл.9). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме, введенный внутрибрюшинно в дозах 5, 10 и 20 мг/кг, вызывал повышение горизонтальной двигательной активности мышей с паркинсоническим синдромом в 2,86, 3,00 и 3,84 раза соответственно по сравнению с группой животных, получавших только МФТИ. Кроме того, после виутрибрюшинного введения N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в дозе 10 мг/кг у мышей с паркинсоническим синдромом достоверно повышался уровень вертикальной активности.

При внутривенном введении N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в дозе 5 мг/кг также наблюдалось достоверное повышение горизонтальной двигательной активности животных. Достоверный эффект на горизонтальную двигательную активность оказывал и препарат сравнения - мидантан, вводимый в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно (табл.9).

Полученные результаты свидетельствуют о способности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме при внутрибрюшинном и внутривенном введении уменьшать олигокинезию, вызванную нейротоксином МФТП и регистрируемую в тесте «Открытое поле».

3.2.2. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на олигокинезию мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом в актометре Opto-Varimex.

Оценку олигокинезии у мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом осуществляли в специальном актометре Opto-varimex. Уровень олигокинезии оценивали по числу горизонтальных перемещений в актометре в течение 3 последовательных минут с ежеминутной регистрацией выводимых параметров двигательной активности. Тестирование в актометре проводили через 90 минут и через 7 суток после введения нейротоксина МФТП (30 мг/кг внуфибрюшинно, однократно). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме вводили внутрибрюшинно в дозах 5 и 10 мг/кг за 30 минут до введения МФТП.

Установлено, что нейротоксин МФТП через 90 минут после введения вызывает выраженную олигокинезию, что выражается в резком уменьшении (почти в 10 раз по сравнению с контролем) числа горизонтальных перемещений в актометре (табл.10). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно достоверно повышал (более чем в 2 раза), нарушенный МФТП, уровень двигательной активности (табл.10), что свидетельствует о способности препарата уменьшать олигокинезию. При регистрации горизонтальной двигательной активности через 7 суток после введения МФТП наблюдалось уменьшение олигокинезии по сравнению с показателями, полученными через 90 минут после введения нейротоксина. N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме в дозе 5 мг/кг (внутривенно) в 1,2 раза увеличивал число горизонтальных перемещений в актометре.

Полученные результаты свидетельствуют о способности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме при внутрибрюшинном и внутривенном введении уменьшать олигокинезию, вызванную нейротоксином МФТП и регистрируемую в актометре OptoVarimex.

3.2.3. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на олигокинезию мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом в тесте вращающегося горизонтального стержня.

Для оценки моторного (неврологического) дефицита и степени нарушения координации движений использовали тест вращающегося стержня (Rota Rod test, Ugo Basile). Животных помещали на горизонтальный стержень диаметром 3 см. Эксперименты проводили в 2-х вариантах. В первом варианте - через 2 часа после введения нейротоксина МФТП (30 мг/кг внутрибрюшинно), - стержень вращали с постоянной скоростью 10 оборотов в минуту и регистрировали время удерживания животных на вращающемся стержне (максимально в течение 200 с). Во втором варианте опытов, проводимом через 7 суток после введения нейротоксина МФТП, стержень вращали с нарастающей скоростью: начальная скорость вращения барабана равнялась 5 оборотам в минуту, а конечная - 30 оборотов в минуту. Каждые 7 секунд скоростью вращения увеличивали на 1 оборот. Регистрировали время удерживания животного на вращающемся стержне (максимально в течение 200 с).

Нейротоксин МФТП через 2 часа после введения вызывал выраженный неврологический дефицит, который выражался в нарушении координации движений и уменьшении (в 7,5 раза) времени удерживания на стержне, вращающемся с постоянной скоростью. N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме при его внутривенном введении в дозе 5 мг/кг улучшал координацию движений и достоверно увеличивал (в 1,7 раза) время удерживания мышей на вращающемся стержне по сравнению с животными, получившими нейротоксин (табл.11).

Нейротоксин МФТП через 7 суток после однократного введения в дозе 30 мг/кг (внутрибрюшинно) вызывал нарушение координации движений и уменьшение (в 2,2 раза) времени удерживания мышей на стержне, вращающемся с ускорением (табл.12). N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме при внутрибрюшинном введении в дозах 10 и 20 мг/кг и при внутривенном введении в дозе 5 мг/кг улучшал координацию движений и достоверно увеличивал время удерживания мышей на вращающемся стержне по сравнению с животными, получившими только нейротоксин (табл.12). Мидантан в дозе 20 мг/кг (внутрибрюшинно) оказывал сходный с N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлоридом эффект на олигокинезию в тесте вращающегося стержня.

Полученные данные свидетельствуют о способности N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме при виутрибрюшинном и внутривенном введении уменьшать олигокинезию, вызванную нейротоксином МФТП и регистрируемую в тесте вращающегося стержня.

3.2.4. Влияние N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида в инъекционной лекарственной форме на олигокинезию мышей C57BL/6 с МФТП-вызванным паркинсоническим синдромом в тесте вертикального стержня (Pole-test).

Для оценки олигокинезии в тесте вертикального стержня (Pole-test) (Ogawa N., Hirose Y., Ohara S., Ono Т., Watanabe Y. A simple quantitative bradykinesia test in MPTP-treated mice. Res Commun Chem Pathol Pharmacol, 1985; 50 (3); 435-41) мышь помещали на вершину деревянного стержня (50 см высотой и 1 см в диаметре, обернутого бинтом с пробковым набалдашником диаметром 1,5 см) носом вверх и замеряли время необходимое животному для ориентирования - поворота головой вниз (t-поворота) и спуска вниз по стержню (t-спуска). Перед тестированием животных обучали в течение 2 дней (предъявляя по 5 проб в день). В день тестирования также осуществляют 5 посадок на вершину стержня и по полученным данным вычисляли среднее время: t-поворота и t-спуска.

Нейротоксин МФТП в дозе 30 мг/кг (внутрибрюшинно) достоверно увеличивал время поворота и время спуска мышей по вертикальному стержня (табл.9 и табл.10).

N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид в инъекционной лекарственной форме в дозе 20 мг/кг внутрибрюшинно и в дозе 5 мг/кг внутривенно достоверно уменьшал время поворота и время спуска мышей в тесте вертикального стержня через 2 часа после введения нейротоксина, время поворота через 7 дней после введения МФТП (табл.13). При оценке влияния N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида на олигокинезию мышей через 21 день после введения МФТП установлено, что N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид (20 мг/кг) при внутрибрюшинном введении уменьшал только время поворота, а при внутривенном введении (5 мг/кг) как время поворота, так и время спуска (табл.14).

Таким образом, N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид при различных способах парентерального введения оказывает отчетливое противопаркинсоническое действие на модели Pole-test, и при внутривенном введении активность препарата значительно выше.

Пример 4. Эффективность инъекционной лекарственной формы N-(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорида на модели паркинсонического синдрома, вызванного внутримозговым введением нейротоксина 1-мeтил-4-фeнилпиpидиния⁺ (МФП⁺).

Токсический эффект нейротоксина МФТП на нейроны черной субстанции обусловлен его конечным продуктом окисления - МФП^+, который обладает высоким сродством к дофаминергическим нейронам (Pettifer K.М., Jiang S., Bau С., Ballerini P., D'Alimonte I., Werstiuk E.S., Rathbone M.P. MPP⁺-induced cytotoxicity in neuroblastoma cells: Antagonism and reversal by guanosine Purinergic Signal. 2007 September; 3 (4): 399-409). Введение МФП⁺ непосредственно в черную субстанцию мозга крыс вызывает выраженную дегенерацию дофаминергических нейронов черной субстанции, снижение стриатного дофамина и двигательные нарушения, характерные для паркинсонического синдрома.

Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах 9-10-месячного возраста, массой 280-300 г по методу, описанному ранее (Воронина Т.А., Вальдман Е.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению антипаркинсонической активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (ред. Р.У. Хабриев), изд. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохрания и социального развития, Москва, 2005, С.295-305). Животным под наркозом по координатам стереотаксического атласа в компактную зону черной субстанции билатерально имплантировали специальные металлические канюли. Через 7-8 дней после операции с помощью микрошприца Гамильтона в каждое ядро черной субстанции через канюлю однократно вводили 10 мкг МФП⁺ в 2 мкл физиологического раствора. Животным контрольной группы в каждое ядро черной субстанции вводили по 2 мкл физраствора. Исследуемые вещества вводили на фоне развернутой картины паркинсонического синдрома. Тестирование проводили на 7 день после введения нейротоксина МФП⁺ в черную субстанцию мозга крыс. Эффекты веществ оценивали по степени изменения олигокинезии в тесте открытого поля и моторного дефицита в тесте вращающегося стержня. Установка «открытое поле» представляет собой круглую арену диаметром 1 метр и высотой стенок 30 см. Пол разделен на сектора. На пересечение линий находятся отверстия диаметром 2 см (16 отверстий). Крысу помещают в открытое поле и на протяжении 3-х минут регистрируют: горизонтальную двигательную активность по количеству пересеченных секторов, вертикальную двигательную активность по числу стоек, исследовательскую активность по числу обследованных отверстий.

Для оценки моторного (неврологического) дефицита и степени нарушения координации движений использовали тест вращающегося стержня (Rota Rod test. Ugo Basile). Животных помещали на горизонтальный стержень диаметром 5 см, вращающийся с постоянной скоростью 10 оборотов в минуту. Регистрировали время удерживания животных на вращающемся стержне (максимально в течение 200 с).

В гру