Способ идентификации улучшенных вариантов белка

Способ идентификации улучшенных вариантов белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на связанные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет временных патентных заявок США №№ 60/933307, 60/933331 и 60/933312, поданных 6 июня 2007, включенных, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам конструирования белков с целью оптимизации их эффективности при определенных интересующих окружающих условиях. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности при конкретных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности и/или стабильности при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их стабильности при хранении, конкретно при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам изменения суммарного поверхностного заряда и/или распределения поверхностных зарядов ферментов (например, металлопротеаз) с целью получения вариантов фермента, которые проявляют улучшенную эффективность и/или стабильность в моющих составах по сравнению с начальным или родительским ферментом.

Предпосылки изобретения

Свойства белков, функционирующих вне их естественного окружения, часто являются субоптимальными. Например, ферменты (например, протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы и т.д.) часто используются для очистки материи от краски в детергентах для стирки, которые типично включают сложное сочетание активных ингредиентов. Фактически, большинство продуктов для очистки содержат систему поверхностно-активных веществ, отбеливатели, моющие компоненты, гасители мыльной пены, грязесуспендирующие компоненты, грязеотталкивающие компоненты, оптические отбеливатели, смягчители, дисперсанты, соединения, подавляющие перенос красителя, абразивы, бактерициды и отдушки, а также ферменты для очистки. Таким образом, несмотря на сложность современных детергентов, существует множество красок, удалить которые полностью сложно, отчасти из-за субоптимальной эффективности фермента. Несмотря на многие исследования, направленные на разработку ферментов, в данной области сохраняется потребность в способах создания белков для конкретных применений и условий. Фактически, в данной области сохраняется потребность в способах для быстрой и систематической адаптации электростатических свойств других с целью оптимизации их эффективности в коммерческих применениях. В частности, в данной области сохраняется потребность в способах создания промышленно пригодных ферментов, включая в качестве неограничивающих примеров липазы, амилазы, кутиназы, маннаназы, оксидоредуктазы, целлюлазы, пектиназы, протеазы и другие ферменты, для того, чтобы обеспечить улучшенную активность, стабильность и растворимость в очищающих растворах.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам конструирования белков с целью оптимизации их эффективности при конкретных интересующих окружающих условиях. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности при конкретных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности и/или стабильности при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их стабильности при хранении, конкретно при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам изменения суммарного поверхностного заряда и/или распределения поверхностных зарядов ферментов (например, металлопротеаз) с целью получения вариантов фермента, которые проявляют улучшенную эффективность и/или стабильность в моющих составах по сравнению с начальным или родительским ферментом.

Настоящее изобретение относится к способам производства улучшенных вариантов белков, содержащим: тестирование первого свойства множества вариантов белков с единичными заменами в первом тесте и второго свойства во втором тесте, где свойство родительского белка представляет собой заданное значение, равное 1,0, в каждом тесте, благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим 1,0, и чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,80 или в некоторых предпочтительных вариантах осуществления, приблизительно менее чем 0,60; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связана с благоприятным первым свойством и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным вторым свойством; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связаны с благоприятным вторым свойством и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным первым свойством; введение замены из предыдущей стадии в белок для получения варианта белка с множественными заменами. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно содержат тестирование варианта белка с множественными заменами в первом тесте и втором тесте, где улучшенный вариант белка достигает значения, превышающего 1,0, как в первом, так и во втором указанных тестах, или значения, превышающего 1,0, в первом тесте, и значения от 0,80 до 1,0 во втором тесте. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способы дополнительно содержат производство улучшенного варианта белка(ов). В некоторых вариантах осуществления первое и второе свойства обладают отрицательной корреляцией. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим приблизительно 1,2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,40. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, первое свойство представляет собой стабильность, и второе свойство представляет собой эффективность стирки. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, стабильность включает в себя стабильность в детергенте и эффективность стирки включает в себя эффективность отстирывания крови-молока-чернил (КМЧ) в детергенте. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, белок представляет собой нейтральную металлопротеазу. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, родительский белок представляет собой зрелую форму нейтральной металлопротеазы дикого типа, тогда как в других вариантах осуществления вариант получен из нейтральной металлопротеазы из семейства Bacillaceae. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, вариант получен из нейтральной металлопротеазы рода Bacillus. Еще в дополнительных вариантах осуществления эффективность стирки тестируют в порошке или жидком моющем составе, обладающем pH между 5 и 12,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления эффективность стирки тестируют в холодной воде с жидким детергентом, обладающим основным pH. Еще в дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1 или -2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное +1 или +2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе. Не планируется, что стадии ограничиваются точным перечисленным выше порядком, так как любой подходящий порядок находит применение в настоящем изобретении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, улучшенный вариант протеазы обладает изменением суммарного заряда, равным +1 или +2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе. Еще в дополнительных вариантах осуществления, замены находятся в позициях в родительской нейтральной металлопротеазе, обладающей доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 50%. В других дополнительных вариантах осуществления, одна или несколько позиций в родительской нейтральной металлопротеазе представляют собой позиции, обладающие доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 65%.

Настоящее изобретение относится к способам производства улучшенных вариантов протеазы, содержащим: тестирование первого свойства множества вариантов протеазы с единичными заменами в первом тесте и второго свойства во втором тесте, где свойство родительской протеазы представляет собой заданное значение, равное 1,0, в каждом тесте, благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим 1,0, и чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,80 или в некоторых предпочтительных вариантах осуществления приблизительно менее чем 0,60; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов протеазы с единичными заменами, которые связаны с благоприятным первым свойством и которые не связаны с чрезмерно неблагоприятным вторым свойством; идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов протеазы с единичными заменами, которые связаны с благоприятным вторым свойством и которые не связаны с чрезмерно неблагоприятным первым свойством; введение замены из предыдущей стадии в протеазу, чтобы получить вариант протеазы с множественными заменами. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно содержат тестирование варианта протеазы с множественными заменами в первом тесте и втором тесте, где улучшенный вариант протеазы достигает значения, превышающего 1,0, как в первом, так и во втором тестах, или значения, превышающего 1,0, в первом тесте, и значения от 0,80 до 1,0 во втором тесте. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, способы дополнительно содержат производство улучшенного варианта протеазы(з). В некоторых вариантах осуществления первое и второе свойства обладают отрицательной корреляцией. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, благоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно больше чем 1,2. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,40. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, первое свойство представляет собой стабильность, и второе свойство представляет собой эффективность стирки. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, стабильность содержит стабильность в детергенте и эффективность стирки содержит эффективность отстирывания крови-молока-чернил (КМЧ) в детергенте. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, протеаза представляет собой нейтральную металлопротеазу. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, родительская протеаза представляет собой зрелую форму нейтральной металлопротеазы дикого типа, тогда как в других вариантах осуществления вариант получен из нейтральной металлопротеазы семейства Bacillaceae. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, вариант получен из нейтральной металлопротеазы рода Bacillus. Еще в дополнительных вариантах осуществления эффективность стирки тестируют в порошке или жидком моющем составе, обладающем pH между 5 и 12,0. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, эффективность стирки тестируют в холодной воде с жидким детергентом, обладающим основным pH. Еще в дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1 или -2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе, тогда как в некоторых альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное +1 или +2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе. Не планируется, что стадии ограничиваются точным перечисленным выше порядком, так как любой подходящий порядок находит применение в настоящем изобретении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, улучшенный вариант протеазы обладает изменением суммарного заряда, равного +1 или +2 по отношению к родительской нейтральной металлопротеазе. Еще в дополнительных вариантах осуществления, замены находятся в позициях в родительской нейтральной металлопротеазе, обладающих доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 50%. В других дополнительных вариантах осуществления, одна или несколько позиций в родительской нейтральной металлопротеазе представляют собой позиции, обладающие доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 65%. Настоящее изобретение также относится к белкам с множественными заменами, произведенным с помощью способов, изложенных в настоящем документе. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к вариантам нейтральной металлопротеазы, произведенных способом, изложенным в настоящем документе. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к вариантам протеазы, содержащим замену в позиции остатка, соответствующей позиции остатка 83 нейтральной металлопротеазы Bacillus, приведенной как SEQ ID NO:3. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, замена содержит замену L83K. Также предоставлены варианты NprE, содержащие сочетания замен, выбранных из группы, состоящей из: i) 4K-45K-50R-54K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-269H-285R-296E; 45K-50R-59K-90K-1291-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-244S-265P-285R; 45K-59K-90K-129I-138L-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R; и 59K-90K-129I-179P-190L-199E-214Q-220E-265P-285R.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты протеазы, изложенные в настоящем документе. Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим полинуклеотид, изложенный в настоящем документе, в функциональном сочетании с промотором. В настоящем изобретении также предоставлены клетки-хозяева, трансформированные экспрессирующим вектором(ами), предоставленным в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям, содержащим варианты протеазы, произведенные с помощью способов по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится к способам производства улучшенных вариантов белков, содержащим: a) тестирование множества вариантов белков с единичными заменами в первом тесте первого свойства и второго свойства во втором тесте, где свойство родительского белка представляет собой заданное значение, равное 1,0, в каждом тесте, благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим 1,0, и чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,80; b) идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связана с благоприятным первым свойством и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным вторым свойством; c) идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связана с благоприятным вторым свойствам и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным первым свойством; и d) введение замены из стадии b) и замены из стадии c) в белок, чтобы получить вариант белка с множественными заменами. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно содержат стадию e) тестирования варианта белка с множественными заменами в первом тесте и втором тесте, где улучшенный вариант белка достигает значения, превышающего 1,0, как в первом, так и во втором тестах, или значения, превышающего 1,0 в первом тесте, и значения от 0,80 до 1,0 во втором тесте.

В некоторых вариантах осуществления белок представляет собой фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, амилазы, целлюлазы, полиэстеразы, эстеразы, липазы, кутиназы, пектиназы, оксидазы, трансферазы, каталазы и алкалазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой протеазу или амилазу. В некоторых вариантах осуществления первое и второе интересующие свойства содержат два или более свойства, выбранные из группы, состоящей из связывания субстрата, ингибирования фермента, экспрессии, стабильности в детергенте, тепловой стабильности; скорости реакции; степени завершенности реакции; тепловой активности; разжижения крахмала; разложения биомассы, осахаривания, гидролиза эфира, ферментативного отбеливания, эффективности стирки и модификации текстиля. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, способы дополнительно содержат производство улучшенного варианта белка. В некоторых вариантах осуществления первое и второе свойства обладают отрицательной корреляцией. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения благоприятные первое или второе свойство обладает значением приблизительно больше чем 1,2, и/или чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением менее чем приблизительно 0,60. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, первое свойство представляет собой стабильность, и второе свойство представляет собой эффективность стирки. В поднаборе этих вариантов осуществления, стабильность содержит стабильность в детергенте, и эффективность стирки содержит эффективность отстирывания крови-молока-чернил (КМЧ) в детергенте. В некоторых вариантах осуществления первое свойство представляет собой экспрессию белка, и второе свойство представляет собой ферментативную активность. В поднаборе этих вариантов осуществления, ферментативная активность содержит эффективность отстирывания рисового крахмала в детергенте. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, протеаза выбрана из группы, состоящей из нейтральной металлопротеазы, сериновой протеазы и субтилизина. В поднаборе этих вариантов осуществления, нейтральная металлопротеаза представляет собой нейтральную металлопротеазу семейства Bacillaceae. В некоторых образцовых вариантах осуществления, нейтральная металлопротеаза из рода Bacillus (например, NprE B. subtilis). В дополнительных вариантах осуществления амилаза представляет собой α-амилазу семейства Bacillaceae. В образцовых вариантах осуществления, α-амилаза из рода Bacillus (например, AmyS B. stearothermophilus). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, эффективность стирки тестируют в порошке или жидком моющем составе, обладающем pH между 5 и 12,0, и/или холодной воде с жидким детергентом, обладающим основным pH. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1 или -2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равного +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит, по меньшей мере, две замены, первую с изменением суммарного заряда, равным 0, -1 или -2 по отношению к родительскому ферменту; и вторую с изменением суммарного заряда, равным +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна замена содержит от одной до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) замен. В некоторых вариантах осуществления улучшенный вариант фермента обладает изменением суммарного заряда, равного -2, -1, 0, +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых вариантах осуществления замены находятся в позициях в родительском ферменте, обладающих доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 25%, приблизительно больше чем 50% или приблизительно больше чем 65%. Также настоящим изобретением предоставлены выделенные полинуклеотиды, кодирующие варианты фермента, изложенные в настоящем документе. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид в функциональном сочетании с промотором. В некоторых вариантах осуществления предоставлены клетки-хозяева, содержащие экспрессирующий вектор. В дополнительных вариантах осуществления предоставлены чистящие композиции, которые содержат варианты фермента, произведенные с использованием способов по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится к способам производства улучшенных вариантов белков, содержащим в функциональном порядке: a) тестирование первого свойства множества вариантов белков с единичными заменами в первом тесте и второго свойства во втором тесте, где свойство родительского белка представляет собой заданное значение, равное 1,0, в каждом тесте, благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим 1,0, и чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,80; b) идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связана с благоприятным первым свойством и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным вторым свойством; c) идентификацию замены, по меньшей мере, в одном из вариантов белков с единичными заменами, которая связана с благоприятным вторым свойством и которая не связана с чрезмерно неблагоприятным первым свойством; и d) введение замены из стадии b) и замены из стадии c) в белок, чтобы получить вариант белка с множественными заменами, где вариант белка с множественными заменами является улучшенным вариантом белка. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, способы дополнительно содержат: стадию e) тестирования варианта белка с множественными заменами в первом тесте и втором тесте, где улучшенный вариант белка достигает значения, превышающего 1,0, как в первом, так и во втором тестах, или значения, превышающего 1,0 в первом тесте, и значения от 0,80 до 1,0 во втором тесте. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, родительский белок представляет собой фермент, где улучшенные варианты белков являются ферментами. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, фермент выбран из протеаз, амилаз, целлюлаз, полиэстераз, эстераз, липаз, кутиназ, пектиназ, оксидаз, трансфераз и каталаз. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, фермент представляет собой протеазу или амилазу. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, первое и второе интересующие свойства содержат два или более из группы, состоящей из связывания субстрата, ингибирования фермента, экспрессии, стабильности в детергенте, тепловой стабильности, скорости реакции, степени завершенности реакции, тепловой активности, разжижения крахмала, разложения биомассы, осахаривания, гидролиза эфира, ферментативного отбеливания, эффективности стирки и модификации текстиля. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления, способы дополнительно содержат стадию производства улучшенного варианта белка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, первое и второе свойства обладают отрицательной корреляцией. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, благоприятное первое или второе свойство обладают значением приблизительно больше чем 1,2. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,60. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления, чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением приблизительно менее чем 0,40. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, первое свойство представляет собой стабильность, и второе свойство представляет собой эффективность стирки. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, стабильность содержит стабильность в моющих составах и эффективность стирки содержит эффективность отстирывания крови-молока-чернил (КМЧ). В некоторых других дополнительных вариантах осуществления, эффективность стирки тестируют в порошке или жидком моющем составе, обладающем pH между приблизительно 5 и приблизительно 12. В некоторых дополнительных предпочтительных вариантах осуществления, эффективность стирки тестируют в холодной воде с жидким детергентом, обладающим основным pH. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, первое свойство представляет собой экспрессию белка, и второе свойство представляет собой ферментативную активность. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, протеаза выбрана из нейтральных металлопротеаз и сериновых протеаз. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, сериновая протеаза представляет собой субтилизин. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, нейтральная металлопротеаза представляет собой нейтральную металлопротеазу, полученную из члена семейства Bacillaceae. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, амилаза представляет собой α-амилазу, полученную из члена семейства Bacillaceae. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1, или -2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1 или -2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых дополнительных альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых других дополнительных вариантах осуществления, улучшенный вариант фермента обладает изменением суммарного заряда, равным +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. В некоторых альтернативных вариантах осуществления, замены находятся в позициях в родительском ферменте, обладающих доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 25%. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, замены находятся в позициях в родительском ферменте, обладающих доступной для растворителя поверхностью (ДРП) приблизительно больше чем 50%, приблизительно больше чем 65%. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, родительский фермент представляет собой фермент дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к чистящим композициям, содержащим улучшенный вариант белка, произведенный в соответствии со способами, изложенными в настоящем документе.

Настоящее изобретение также относится к выделенным вариантам нейтральной металлопротеазы, обладающим аминокислотной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, выполненную в позиции, эквивалентной позиции в нейтральной металлопротеазе, содержащей аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO:3. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, по меньшей мере, одна замена выполнена в позиции, эквивалентной позиции 83 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:3. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления, замена представляет собой L83K.

Краткое описание чертежей

На фиг.1A показана относительная специфическая гидролитическая активность для BODIPY-крахмала по отношению к экспрессии комбинаторной зарядовой библиотеки (КЗБ) AmyS-S242Q во встряхиваемых пробирках.

На фиг.1B показана относительная активность очистки на микрообразцах с рисовым крахмалом в TIDE 2× по отношению к экспрессии КЗБ AmyS-S242Q во встряхиваемых пробирках.

На фиг.2A показана относительная экспрессия во встряхиваемых пробирках по отношению к относительному изменению суммарного заряда для КЗБ AmyS-S242Q.

На фиг.2B показана относительная гидролитическая активность для BODIPY-крахмала по отношению к относительному изменению суммарного заряда для КЗБ AmyS-S242Q.

На фиг.3A показана относительная экспрессия во встряхиваемых пробирках по отношению к относительному изменению суммарного заряда для КЗБ AmyS-S242Q.

На фиг.3B показана активность очистки микрообразцов с рисовым крахмалом по отношению к относительному изменению суммарного заряда для КЗБ AmyS-S242Q.

Общее описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам конструирования белков с целью оптимизации их эффективности при конкретных интересующих окружающих условиях. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности при конкретных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их каталитической активности и/или стабильности при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам конструирования ферментов с целью оптимизации их стабильности при хранении, конкретно при неблагоприятных окружающих условиях. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам изменения суммарного поверхностного заряда и/или распределения поверхностных зарядов ферментов (например, металлопротеаз) с целью получения вариантов фермента, которые проявляют улучшенную эффективность и/или стабильность в моющих составах по сравнению с начальным или родительским ферментом.

Протеаза субтилизин является основным ферментом, используемым в детергентах для стирки и возможно наиболее широко используемым ферментом в мире. Отмечалось, что поверхностные электростатические эффекты могут модулировать каталитическую активность субтилизина (см., например, Russell and Fersht, Nature 328:496-500 [1987]). Совсем недавно были открыты мутации, которые участвуют в изменении суммарного заряда субтилизина и имеют сильное влияние на эффективность стирки в детергентах (см., например, EP патент № 0479870 B1). Полагалось, что это положительное воздействие является результатом сдвига pI (изоэлектрической точки) субтилизина в сторону pH моющего раствора. Однако последняя работа показала, что это заключение не всегда является применимым (см., например, патент США № 6673590 B1). Как указано в этом патенте, влияние зарядовых мутаций в субтилизине сильно зависит от концентрации детергента, причем мутации, снижающие pI родительского субтилизина, предоставляют фермент, который более эффективен при низкой концентрации детергента, и мутации, повышающие pI, предоставляют фермент, который более эффективен при высокой концентрации детергента. Это обладает значительной выгодой, так как концентрация детергента в моющих растворах значительно меняется в мировом масштабе. Таким образом, специалистам в данной области становится понятно, что существует оптимальная pI субтилизина для эффективной стирки, которая зависит от pH и концентрации детергента в моющем растворе. Описывались дальнейшие попытки увеличения активности субтилизина в детергентах для стирки (см. патентную заявку США № 2005/0221461). К удивлению было обнаружено, что варианты субтилизина, обладающие таким же суммарным электростатическим зарядом, как у родительского субтилизина, обладают повышенной эффективностью стирки в условиях мытья как с высокой, так и с низкой концентрацией детергента.

Если не указано иначе, осуществление настоящего изобретения на практике затрагивает общепринятые способы, которые являются общеупотребительными в конструировании белков, молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, которые известны специалистам в данной области. Такие способы известны специалистам в данной области и описаны во множестве текстов и справочных работ, хорошо известных профессионалам в данной области. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, отмеченные в настоящем документе как выше, так и ниже, настоящим явно включены в настоящий документ в качестве ссылки по причине того, что они содержат уместные сведения, относящиеся к способам и композициям, предоставленным настоящим изобретением.

Пока в настоящем документе не установлено обратное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, обладают таким же значением, в каком обычно их понимает специалист в области, к которой принадлежит это изобретение. Хотя любые способы и материалы, схожие или эквивалентные способам и материалам, описываемым в настоящем документе, находят применение в осуществлении настоящего изобретения на практике, некоторые предпочтительные способы и материалы описаны в настоящем документе. Таким образом, термины, которые определены непосредственно ниже, описаны более полно по отношению к описанию в целом.

Так же, как используется в настоящем документе, единственное число включает множественное число до тех пор, пока в контексте не будет ясно указано обратное. Числовые диапазоны включают в себя числа, определяющие этот диапазон. Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в направлении от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от амино- к карбокси-концу соответственно. Следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными описанными способами, протоколами и реактивами, так как они могут меняться в зависимости от контекста, в котором их используют специалисты в данной области.

Предполагается, что каждое максимальное числовое ограничение, заданное на всем протяжении этого описания, включает каждое нижнее числовое ограничение, как если бы такие нижние числовые ограничения были явно прописаны в настоящем документе. Каждое минимальное числовое ограничение, заданное на всем протяжении этого описания, будет включать каждое верхнее числовое ограничение, как если бы такие верхние числовые ограничения были явно прописаны в настоящем документе. Каждый числовой диапазон, заданный на всем протяжении этого описания, будет включать каждый более узкий числовой диапазон, который попадает в пределы такого более широкого числового диапазона, как если бы все такие более узкие числовые диапазоны были явно прописаны в настоящем документе.

Кроме того, заголовки, предоставленные в настоящем документе, не являются ограничениями для различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут иметь место по отношению к описанию в целом. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены по отношению к описанию в целом. Тем не менее, для того чтобы облегчить понимание изобретения, определенное количество терминов определено ниже.

Определения

Как используется в настоящем документе, термины «протеаза» и «протеолитическая активность» относятся к белку или пептиду, проявляющему способность к гидролизу пептидов или субстратов, обладающих пептидными связями. Для измерения протеолитической активности существует множество хорошо известных процедур (см., например, Kalisz, «Microbial Proteases», In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology [1988]). Например, протеолитическую активность можно установить с помощью сравнительных анализов, в которых анализируют способность соответствующей протеазы гидролизовать коммерческий субстрат. Образцовые субстраты, пригодные для такого анализа протеазы или протеолитической активности, включают в качестве неограничивающих примеров диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Si