Самоинактивирующиеся аденовирусы-помощники для получения рекомбинантных аденовирусов с высокой емкостью

Самоинактивирующиеся аденовирусы-помощники для получения рекомбинантных аденовирусов с высокой емкостью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-173326RU/071

САМОИНАКТИВИРУЮЩИЕСЯ АДЕНОВИРУСЫ-ПОМОЩНИКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ С ВЫСОКОЙ ЕМКОСТЬЮ

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБЕРТЕНИЕ

Изобретение относится к области аденовирусных векторов и, более конкретно, к области получения систем третьего поколения или аденовирусных векторов, лишенных вирусных кодирующих областей («лишенных существенного внутреннего содержимого» - «gutless»), с помощью применения самоинактивирующихся аденовирусов-помощников, которые позволяют создавать в клетках рекомбинантные аденовирусы с минимальным загрязнением аденовируса с высокой емкостью аденовирусами-помощниками.

Аденовирусы с высокой емкостью (НС-Ad), также известные как аденовирусы, «лишенные существенного внутреннего содержимого», или зависимые от помощников аденовирусы, очень привлекательны в качестве векторов для генной терапии, так как могут поддерживать высокую эффективность трансдукции и тропизм других аденовирусных векторов, как у грызунов, так и у приматов, но они предотвращают иммуногенность, ассоциированную с экспрессией вирусных белков в инфицированных клетках. Кроме того, такие вирусные векторы обладают высокой емкостью для встраивания представляющего интерес трансгена (примерно до 36 т.п.н.), намного большей, чем емкость других вирусных векторов.

Аденовирусные векторы с высокой емкостью основаны на аденовирусах, которые «очищены» от всех вирусных кодирующих последовательностей. Такие векторы имеют в качестве минимальных требований концевые области аденовирусного генома (ITR, инвертированные концевые повторы), которые необходимы для репликации вируса, и сигнал упаковки (Ψ), который также действует в цис-положении.

В связи с тем, что у аденовирусов с высокой емкостью отсутствуют все вирусные кодирующие области, для его размножения требуется присутствие вирус-помощника с делецией в области E1, который обеспечивает вирусные белки в транс-положении. Размножение осуществляют с помощью котрансфекции или совместно инфекции линий клеток 293, в которые была интегрирована делетированная область E1 вируса-помощника.

Однако при такой системе размножения также образуются нежелательные вирусные частицы, которые заключают в капсид геномы вирусов-помощников и загрязняют конечные препараты аденовирусов с высокой емкостью. Накопление вирусов-помощников довольно изменчиво, но иногда оно может быть таким значительным, что они вытесняют вирус с высокой емкостью, что является одной из причин, по которой современные способы получения являются недостаточно надежными для клинического применения. Эффективность является другим ограничивающим фактором, также отчасти связанным с проблемой появления вирусов-помощников. До настоящего времени разработаны и описаны несколько разных систем уменьшения эффективности упаковки вируса-помощника. Такие системы обычно основаны на введении мутаций в сигнал упаковки вируса-помощника, на увеличенном размере его генома и особенно на специфичном удалении сигнала упаковки в процессе продуцирования вирусов.

Parks с соавторами (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 13565-13570) описали способы удаления сигнала упаковки Ψ вируса-помощника с помощью системы рекомбинации Cre-loxP, в которой сигнал Ψ указанного вируса фланкирован сайтами loxP. Если размножение осуществляют в клетках 293, экспрессирующих рекомбиназу Cre, то рекомбиназа вырезает сигнал Ψ вируса-помощника, предотвращая его от возможности упаковки, но так, чтобы он сохранял кодирующие последовательности, необходимые для упаковки аденовируса с высокой емкостью. Альтернативно в US 7045347 и в публикации Ng с соавторами (Mol. Ther. 2001; 3: 809-815) описаны системы инактивации вируса-помощника, основанные на вирусах-помощниках, последовательность упаковки которых фланкирована сайтами узнавания frt для рекомбиназы FLP, так что размножение вируса-помощника в клетках 293, экспрессирующих рекомбиназу FLP дрожжей, приводит к вырезанию последовательности упаковки.

Такие системы имеют недостаток, который заключается в том, что реакция, катализируемая рекомбиназой, является двунаправленной, в силу чего последовательность упаковки может быть снова повторно введена в геном вируса-помощника. Чтобы предотвратить такую проблему Groth с соавторами (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 5995-6000) предложили применение однонаправленной рекомбиназы, в частности, рекомбиназы PhiC31, с использованием специфичных последовательностей узнавания attB/attP для того, чтобы фланкировать сигнал Ψ. Когда рекомбиназа PhiC31 вырезает последовательность, фланкированную сайтами attB/attP, она модифицирует последовательности узнавания и превращает их в последовательности attR/attL, предотвращая возможность узнавания их снова (с повторным введением сигнала Ψ).

Однако в случае всех способов сталкиваются с проблемой, что удаление последовательностей упаковки вируса-помощника требует экспрессии рекомбиназы с кодирующей ее последовательности, локализованной в геноме клетки-хозяина. Указанный процесс происходит в момент вирусного цикла, когда экспрессия клеточных белков частично ингибирована вследствие цитопатических эффектов, ассоциированных с инфекцией аденовирусами, поэтому вероятно, что не достигаются достаточно высокие внутриклеточные уровни рекомбиназы, чтобы удалить все копии аденовируса-помощника.

Поэтому были предложены альтернативные способы, чтобы предотвратить образование аденовирусов-помощников, способных упаковываться, или, по меньшей мере, задержать их образование относительно образования векторов, лишенных существенного внутреннего содержимого. В патентном документе WO2007125146 соответственно описан вариант описанного ранее способа, в котором аденовирусные векторы-помощники содержат последовательность attB фага ФС31 между последовательностью упаковки и ITR, ближайшей к указанной последовательности упаковки. Добавление указанного сайта attB приводит даже в отсутствие рекомбиназы ФС31 к задержке упаковки аденовируса-помощника относительно аденовируса, лишенного существенного внутреннего содержимого, что вызывает уменьшение количества загрязняющих аденовирусов-помощников в препарате вирусов, лишенных существенного внутреннего содержимого. Однако такой способ приводит только к задержке образования аденовирусов-помощников, но не предотвращает образование аденовирусов-помощников, обладающих способностью к упаковке.

Указанную проблему решали с помощью аденовирусной системы, описанной в DE 10159167. В данной системе рекомбиназа кодируется аденовирусом, лишенным существенного внутреннего содержимого, а аденовирус-помощник содержит сайты-мишени, узнаваемые рекомбиназой, которые определяют границы области, содержащей сигнал упаковки, и удаление которой приводит к тому, что аденовирусный ген E1, присутствующий в аденовирусе-помощнике в 3'-направлении по отношению к сайленсеру экспрессии, оказывается вблизи промотора транскрипции p5 AAV. Поэтому в присутствии аденовируса, лишенного существенного внутреннего содержимого, рекомбиназа удаляет область упаковки генома аденовируса-помощника, в то же самое время обеспечивая экспрессию гена E1, который необходим для упаковки аденовируса, лишенный существенного внутреннего содержимого. Однако в такую аденовирусную систему включен вирус-помощник, экспрессирующий E1, поэтому он является реплицируемым вирусом и, следовательно, более опасным, чем обычный вирус-помощник. Кроме того, вирус, лишенный существенного внутреннего содержимого, экспрессирует рекомбиназу, которая нежелательна в терапевтическом векторе с потенциальным клиническим применением.

Другим альтернативным решением для предотвращения зависимости рекомбиназы от пакующей клетки является использованием рекомбиназы, кодируемой самим вирусом-помощником. В патентном документе US 20020072120 описаны аденовирусные векторы-помощники, кодирующие слитый белок, образованный рекомбиназой Cre, и связывающим лиганд доменом рецептора эстрогена, при этом указанный слитый белок кодируется последовательностью, которая находится под оперативным контролем конститутивного промотора. Слитый белок Cre-ER перемешается в ядро и проявляет свою рекомбиназную активность только в присутствии эстрогена или аналога, тем самым исключая необходимость в использовании клетки, экспрессирующей рекомбиназу, и в то же самое время предотвращая токсичный эффект рекомбиназы в связи с тем, что ее активность можно регулировать с помощью добавления эстрогенов в культуральную среду.

Таким образом, в данной области существует необходимость в системах упаковки аденовирусных векторов, которая устраняет недостатки систем, известных до настоящего времени, в частности в способах, при которых образование аденовирусов-помощников во время размножения аденовируса, лишенного существенного внутреннего содержимого, максимально снижено.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему:

(a) область, кодирующую сайт-специфичную рекомбиназу, при этом указанная область находится под оперативным контролем индуцируемого промотора, и

(b) область, необходимую для репликации и/или упаковки аденовирусного генома, фланкированную последовательностями узнавания, специфичными для рекомбиназы, кодируемой последовательностью по п. (a), при этом указанные последовательности узнавания ориентированы так, чтобы вырезание указанной необходимой области происходило в присутствии указанной рекомбиназы.

Во втором аспекте изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему полинуклеотид согласно изобретению.

В третьем аспекте изобретение относится к аденовирусной частице, содержащей последовательность полинуклеотида согласно изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к системе репликации и упаковки самоинактивирующегося аденовируса-помощника, включающей в себя:

(a) полинуклеотид, экспрессирующий вектор или аденовирусную частицу согласно изобретению; и

(b) эукариотическую клетку.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения самоинактивирующегося аденовируса-помощника, включающему в себя:

i) осуществление контакта клетки с полинуклеотидом, экспрессирующим вектором или аденовирусной частицей согласно изобретению и необязательно с одним или несколькими полинуклеотидами, кодирующими аденовирусные белки, необходимые для упаковки и репликации аденовируса в клетке в подходящих условиях, так чтобы происходило проникновение в клетку аденовирусного генома или полинуклеотида,

(ii) содержание клетки в условиях подходящих для того, чтобы обеспечить возможность упаковки и репликации аденовируса в клетки и предотвратить экспрессию сайт-специфичной рекомбиназы, и

(iii) извлечение аденовирусов из среды.

В другом аспекте изобретение относится к аденовирусу-помощнику, полученному согласно способу, описанному в предыдущем абзаце.

В другом аспекте изобретение относится к применению полинуклеотида, вектора иди аденовирусной частицы согласно изобретению для продуцирования и упаковки аденовирусов с высокой емкостью.

В другом аспекте изобретение относится к системе для получения рекомбинантного аденовируса с высокой емкостью, включающей в себя:

(a) полинуклеотид, экспрессирующий вектор или аденовирусную частицу согласно изобретению;

(b) аденовирус, геном которого содержит представляющий интерес ген, и в котором отсутствует последовательность, кодирующая, по меньшей мере, один из белков, необходимых для репликации, или последовательность, кодирующая, по меньшей мере, один из белков, необходимых для упаковки указанного аденовируса, или полинуклеотид, содержащий геном указанного аденовируса, и

(c) эукариотическую клетку.

В другом аспекте изобретение относится к способу создания аденовируса с высокой емкостью, экспрессирующего представляющий интерес ген, включающему в себя стадии:

(i) осуществления контакта клетки с аденовирусом в подходящих условиях так, чтобы происходило проникновение в клетку генома указанного аденовируса или полинуклеотида, содержащего указанный геном,

(ii) осуществления контакта указанной клетки со вторым компонентом, выбранным из группы, состоящей из:

(a) полинуклеотида, содержащего:

1) область, кодирующую сайт-специфичную рекомбиназу, при этом указанная область находится под оперативным контролем индуцируемого промотора, и

2) сигнал упаковки аденовируса Ψ, фланкированный последовательностями узнавания, специфичными для рекомбиназы, кодируемой последовательностью по п. (a), при этом указанные последовательности узнавания ориентированы так, чтобы вырезание сигнала упаковки Ψ происходило в присутствии указанной рекомбиназы,

(b) аденовирусного вектора, содержащего полинуклеотид по п. (a); и

(c) аденовирусной частицы, содержащей полинуклеотид по п. (a),

в условиях, подходящих для того, чтобы происходило проникновение в клетку указанного полинуклеотида, указанного аденовирусного вектора или генома указанной аденовирусной частицы,

(iii) поддерживание клетки в условиях, подходящих для экспрессии белков, кодируемых геномами обоих аденовирусов, для репликации геномов обоих аденовирусов и для экспрессии рекомбиназы, кодируемой полинуклеотидом, вектором или аденовирусом, используемым на стадии (ii), и

(iv) извлечение аденовируса с высокой емкостью из культуры клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показана оперативная схема самоинактивирующегося аденовируса-помощника. На панели A показан классический способ, основанный на продукции Cre пакующей клеткой. В условиях интенсивной репликации вирусов экспрессия Cre может быть недостаточной для вырезания последовательности упаковки из некоторого количества вирусных геномов, количество которых возрастает экспоненциально. На панели В показано, как каждый самоинактивирующийся вирус-помощник является носителем гена Cre, так что способность к экспрессии Cre возрастает параллельно в увеличением количества вирусных геномов.

На фигуре 2 показана оперативная схема индуцируемой системы для экспрессии Cre. Конститутивный промотор (PGK) управляет экспрессией трансактивирующего белка rtTA-M2. В присутствии индуктора (доксициклина), rtTA-M2 димеризуется и активирует индуцируемый промотор (tetO-pA1b), контролирующий экспрессию рекомбиназы Cre. pA, последовательность полиаденилирования.

На фигуре 3 показана оперативная схема белка tTS. В отсутствие доксициклина tTS связывается с индуцируемым промотором и ингибирует экспрессию Cre. Когда добавляют доксициклин, tTS теряет аффинность к промотору, останавливает ингибирование экспрессии Cre и обеспечивает возможность для опосредованной димером активации трансактивирующего белка.

На фигуре 4 показана стабильная экспрессия tTS в клетках 293. ДНК разных клонов клеток 293, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей tTS, очищали и осуществляли ОТ-ПЦР, чтобы выявить продукцию мРНК tTS. Плазмиды, содержащие кДНК, включали в качестве контроля. MW, маркер размера.

На фигуре 5 показан контроль экспрессии Cre в индуцируемых плазмидах. Клетки 293 трансфицировали указанными плазмидами: pBS185 экспрессирует Cre под контролем конститутивного промотора CMV; palbCre содержит индуцируемый промотор для контроля экспрессии Cre; pGKrtTA экспрессирует трансактиватор под контролем промотора PGK; prtTACre содержит кассеты экспрессии Cre и трансактиватора в одной и той же плазмиде. В случае A все клетки поддерживали в присутствии доксициклина. В случае B их сравнивали в присутствии или в отсутствие доксициклина. Экспрессию Cre выявляли с помощью Вестерн-блота.

На фигуре 6 в виде диаграммы представлен вирус AdTetCre и его функционирование. Сигнал упаковки (Ψ) фланкирован сайтами LoxP в такой же ориентации. Трансактиватор rtTA-M2 находится под контролем конститутивного промотора гена PGK мыши, а белок MerCreMer находится под контролем своего индуцируемого промотора TetO-palb. В присутствии доксициклина трансактиватор rtTA-M2 димеризуется и связывается с промотором TetO-palb. Это активирует экспрессию белка MerCreMer, который будет активным в присутствии тамоксифена, узнавая сайты LoxP и удаляя сигнал упаковки, предотвращая при этом капсидирование вируса-помощника. ITR, инвертированный концевой повтор.

На фигуре 7 показана рекомбинация между плазмидами pAdLoxPMerCre и pShutMer с образованием генома вируса AdTetCre. В клетки 293tTs совместно трансфицировали две плазмиды pShutMer и pAdLoxPMerCre, расщепленные ферментом рестрикции Рас I. Между гомологичными областями обеих плазмид происходила рекомбинация, при этом геном инфекционного аденовируса восстанавливался с полной кассетой экспрессии для MerCreMer и сигналом упаковки, фланкированным сайтами LoxP.

На фигуре 8 показана регуляция экспрессии белка MerCreMer вируса AdTetCre. Клетки 293tTs инфицировали вирусом AdTetCre, используя MOI 2 вируса/клетку, в течение 48 часов в присутствии (дорожки 7-9) или в отсутствие (дорожки 4-6) обработки тамоксифеном и доксициклином. Экстракт клеток 293 загружали на дорожку 2, чтобы подтвердить выявление рекомбиназы дикого типа с помощью антитела. Клетки 293tTs на дорожке 3 трансфицированы плазмидой pANMerCreMer. Дорожка 1 соответствует нетрансфицированным клеткам 293 в качестве негативного контроля. Экспрессию Cre и MerCreMer регистрировали с помощью иммуноблоттинга.

На фигуре 9 показана регуляция продукции вируса AdTetCre. Клетки 293tTs, 293 and 293Cre4 инфицировали, используя MOI 2 вируса/клетку, вирусом AdTetCre в течение 48 часов, и количественно оценивали продукцию инфекционного вируса в клеточных экстрактах. Клетки получали предварительную 24-часовую обработку доксициклином (Dox), тамоксифеном (Tam), обоими средствами одновременно (T/D) или оставались необработанными в течение данного периода (контроль), как указано. Обработки продолжали во время инфекции.

На фигуре 10 показана регуляция продукции вируса AdTetCre по сравнению со стандартным аденовирусом-помощником. Клетки 293tTs, 293 и 293Cre4 инфицировали, используя MOI 2 вируса/клетку, вирусом AdTetCre или AdLC8cluc. Клетки получали предварительную 24-часовую обработку доксициклином и тамоксифеном (T/D) или оставались необработанными в течение данного периода (контроль), как указано. Обработки продолжали во время инфекции. В конце 48-часового периода количественно оценивали продукцию инфекционного вируса в клеточных экстрактах.

На фигуре 11 показано вырезание сигнала упаковки вируса AdTetCre и AdLC8cluc. (A) Клетки 293 инфицировали, используя MOI 2 вируса/клетку, вирусом AdTetCre в течение 48 часов. Клетки получали предварительную 24-часовую обработку доксициклином и тамоксифеном (дорожка 4) или оставались необработанными в течение данного периода времени (дорожка 3), как указано. Обработки продолжали во время инфекции, после указанного периода времени ДНК инфицированных клеток экстрагировали, и область, соответствующую началу вирусного генома, амплифицировали в ПЦР. ПЦР-продукт при использовании плазмиды pShutMer в качестве матрицы, при этом такая плазмида содержит ту же самую область генома (дорожка 2), или очищенного вируса AdTetCre, полученного в клетках 293tTs (дорожка 1), показан в качестве контроля. (B) Клетки 293Cre4 (дорожка 2) инфицировали, используя MOI 2 вируса/клетку, вирусом AdLC8cluc, и спустя 48 часов экстрагировали ДНК. ПЦР-анализ осуществляли, как описано в предыдущем разделе. ДНК очищенного вируса AdLC8cluc, полученного в клетках 293 (дорожка 1), использовали в качестве контроля. Размер, соответствующий фрагменту с интактным или вырезанным сигналом упаковки, показан черной или белой стрелкой, соответственно.

На фигуре 12 показано применение вируса AdTetCre для получения НС-Ad. (A) Клетки 293Cre4 трансфицировали плазмидой, содержащей геном НС-Ad KCZ, и спустя 6 часов инфицировали, используя MOI 1, вирусом-помощником AdTetCre. Клетки собирали через 48 часов (пассаж 0). Лизат предыдущего пассажа использовали в последующих пассажах, чтобы инфицировать больше клеток 293Cre4 с использованием MOI 1 вируса AdTetCre. Пассажи 0-3 осуществляли на чашках диаметром 60 мм. Пассаж 4 соответствует 2 чашкам диаметром 150 мм, пассаж 5-8 чашкам диаметром 150 мм и пассаж 6 эквивалентен 30 чашкам диаметром 150 мм. Количество вирусов KCZ и AdTetCre оценивали в каждом пассаже с помощью иммуноцитохимии. Во всех случаях клетки обрабатывали доксициклином и тамоксифеном. (B) Такой же протокол использовали в случае клеток 293 вплоть до пассажа 4. (C) Такому же протоколу следовали в случае клеток 293Cre4, используя вирус-помощник AdLC8cluc без обработки доксициклином и тамоксифеном.

На фигуре 13 показана кинетика экспрессии белка MerCreMer вируса AdTetCre. Клетки 293 подвергали 24-часовой предварительной обработке тамоксифеном и доксициклином, после которой их инфицировали вирусом AdTetCre, используя MOI 2 вируса/клетку. Через 6, 12, 36 и 48 часов клетки собирали и анализировали экспрессию MerCreMer с помощью иммуноблоттинга. Экстракт неинфицированных клеток 293 загружали на контрольную дорожку.

На фигуре 14 показано применение вируса AdTetCre для получения HC-Ad, несущего терапевтический трансген. (A) Были инфицированы клетки Huh-7 (полученные из гепатокарциномы человека) с разным количеством вектора HC-Ad, экспрессирующего мышиный IL-12 (GL-Ad/RUmIL-12), в присутствии индуктора Мифепристон. (B) Вектор HC-Ad, экспрессирующий мышиный IL-12 (GL-Ad/RUmIL-12), вводили внутривенно мышам и после внутрибрюшинного введения индуктора Мифепристон измеряли количество MIL-12, присутствующее в сыворотке (RU486). Индукцию и измерение mIL-12 осуществляли на 7, 48 и 62 сутки после инъекции вектора и проверяли, что мыши стабильно экспрессировали высокие количества трансгена. Индукцию измеряли MIL-12 через 7, 48 и 62 суток после инъекции вектора, и было обнаружено, что мыши стабильно экспрессируют высокие количества трансгена.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения показали, что аденовирусные векторы-помощники, в которых последовательность упаковки фланкирована сайтами-мишенями узнавания рекомбиназой, и которые дополнительно содержат последовательность, кодирующую рекомбиназу, при этом указанная последовательность оперативно связана с индуцируемым промотором, неожиданно обеспечивает возможность образования аденовируса, лишенного существенного внутреннего содержимого, с низкой степенью загрязнения вирусами-помощниками. Не связывая изобретение с какой-либо теорией, считают, что включение колирующей последовательности в существующий аденовирус-помощник позволяет увеличить экспрессию рекомбиназы параллельно с увеличением копий существующего вируса, так что всегда имеется достаточное количество рекомбиназы, чтобы вырезать последовательность упаковки из всех копий генома аденовируса-помощника, и она всегда нечувствительна к ингибированию экспрессии клеточных белков, вызванному существующим вирусом. На фигуре 1 показаны сравнительные схемы способов упаковки обычного аденовируса, при которых рекомбиназа экспрессируется клеткой, в которой осуществляется указанная упаковка (левая панель), или способа согласно изобретению, при котором рекомбиназа экспрессируется геномом существующего вируса-помощника (правая панель). В экспериментальной части иллюстративным образом (смотри пример 3) описано, что аденовирусы, имеющие характерные признаки согласно изобретению, экспрессируют рекомбиназу, зависимую от присутствия доксициклина в среде.

Полинуклеотид согласно изобретению

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему:

(a) область, кодирующую сайт-специфичную рекомбиназу, при этом указанная область находится под оперативным контролем индуцируемого промотора, и

(b) область, необходимую для репликации и/или упаковки аденовирусного генома, фланкированную последовательностями узнавания, специфичными для рекомбиназы, кодируемой последовательностью по п. (a), при этом указанные последовательности узнавания ориентированы так, чтобы вырезание указанной необходимой области происходило в присутствии указанной рекомбиназы.

Согласно изобретению подразумевают, что сайт-специфичная рекомбиназа представляет собой белок, который способен стимулировать сайт-специфичную рекомбинацию между сайтами-мишенями для указанной рекомбиназы. Рекомбиназы, подходящие для использования в изобертении, включают рекомбиназу Cre фага P1 (LoxP), рекомбиназу FLP S. cerevisiae (Frt), интегразу из фага ФС31 Streptomyces (attB, attP), рекомбиназу TP901-1, рекомбиназу R4 или интегразу лямбда. В предпочтительном варианте, рекомбиназой, кодируемой полинуклеотидом согласно изобретению, является рекомбиназа Cre, которая включает как рекомбиназу Cre фага P1, которая исходно описана Abreinski и Hoess (J. Biol. Chem. 1984, 259: 1509-1514), а также слитые белки, содержащие последовательность рекомбиназы и второй полипептид, регулирующий активность рекомбиназы. Рекомбиназа Cre, как при использовании как таковой, так и при использовании в форме слитого белка, может быть модифицирована так, чтобы она обладала более широкой специфичностью по отношению к последовательностям-мишеням, как описано в WO2000060091.

В том случае, когда полинуклеотид согласно изобретению содержит последовательность, кодирующую слитый белок, включающий в себя рекомбиназу, возможно использование полипептидов, действующих как активируемые последовательности ядерной локализации, т.е., они действуют по существу только в присутствии определенного лиганда. Таким образом можно легко регулировать активность рекомбиназы, так чтобы она перемещалась в ядро и проявляла свою активность только в присутствии указанного лиганд. В предпочтительном варианте источником активируемой последовательности ядерной локализации является ядерный рецептор. Последовательностями ядерной локализации, подходящими для применения в изобретении, являются последовательность локализации, полученная из PPAR (рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом), которая перемещается в ядро в присутствии 15-дезокси-[дельта]-простагландина J2, из рецепторов ретиноевой кислоты, которая перемещается в ядро в присутствии альфа-, бета- или гамма-изомеров 9-цис-ретиноевой кислоты, из X-рецепторов фарнезоидов, активируемых ретиноевой кислотой и TTNPB, из X-рецепторов печени, активируемых 24-гидроксихолестерином, X-рецепторов бензоатов, активируемых 4-аминобутилбензоатом, из конститутивного рецептора андростана, рецепторов прегнана, индуцируемых прегнолон-16-карбонтрила из рецепторов стероидов и ксенобиотиков, индуцируемых рифампицином, из рецепторов прогестерона, индуцируемых медроксипрогестероном, а также агонистами и антагонистами мифепристона и производными 19-норэтистерона, из рецепторов глюкокортикоидов, активируемых глюкокортикоидами, из рецепторов тиреоидных гормонов, активируемых T3 и/или T4, и из рецепторов эстрогенов, активируемых эстрогенами и их производными, такими как 17-бета-эстрадиол и эстрадиол. Альтернативно можно использовать слитый белок, который инактивируется посредством его связывания с другим белком, и который в присутствии лиганда в результате диссоциации отщепляется от указанного дополнительного белка, таким образом приводя к индуцируемой активации слитого белка.

Активируемая последовательность ядерной локализации предпочтительно соответствует домену связывания лиганда рецептора эстрогена, который описан в WO0228175. В контексте изобретения термин «домен связывания лиганда» означает последовательность домена связывания эстрогена рецептора эстрогена и предпочтительно его вариантов, содержащих одну или несколько мутаций, возникающих в результате инсерции, делеции и/или замены одной или несколько аминокислот, но который сохраняет по существу интактную способность к транслокации в ядро в присутствии определенного лиганда, хотя предпочтительные лиганды таких вариантов могут варьировать по сравнению с лигандами рецептора дикого типа. Таким образом, изобретение включает в себя применение последовательностей ядерной локализации предпочтительно отвечающих на природные лиганды рецепторов эстрогена (эстрадиол, эстриол или эстрон) или на их различные агонисты и антагонисты, такие как тамоксифен, ICI 164384, RU 54876, диэтилстилбестрол, ралоксифен, зукломифен и торемифен.

Рекомбиназа и последовательность ядерной локализации могут встречаться в любом положении относительно другого элемента слитого белка. Следовательно, изобретение охватывает полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, в которых C-концевая область последовательности ядерной локализации связана с N-концевой областью рекомбиназы, полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, в которых C-концевая область рекомбиназы связана с N-концевой областью последовательности ядерной локализации, и предпочтительно полинуклеотиды, кодирующие слитые белки, образованные рекомбиназой, фланкированной двумя последовательностями ядерной локализации, которые могут быть идентичными или разными, хотя предпочтительно они являются идентичными. Кроме того, изобретение охватывает применение вариантов последовательности ядерной локализации, которая проявляет аффинность по отношению к лигандам, отличающуюся от аффинности, проявляемой последовательностью ядерной локализации рецептора дикого типа. Таким образом, изобретение охватывает применение последовательности связывающего лиганд домена рецептора эстрогена, содержащего мутацию G512R (пронумеровано в соответствии с нумерацией рецептора эстрогена человека). Такая мутация приводит к получению аффинности связывающего лиганд домена с природным лигандом, которая в 1000 раз меньше, чем аффинность, проявляемая связывающим лиганд доменом рецептора дикого типа, но она, однако, не влияет на его аффинность по отношению к 4-гидрокситамоксифену. Таким образом, можно стимулировать транслокацию слияния с белком, обладающим активностью рекомбиназы, используя 4-гидрокситамоксифен, не влияя на возможный ответ пакующей клетки на эстрогены. Альтернативно связывающий лиганд домен рецептора эстрогена может содержать мутации G400V/M543A/L544A, которые приводят получению связывающего лиганд домена, который в 10 раз более чувствителен, транслокация которого в ядро может быть активирована с использованием дозы, которая в 4 раза ниже, чем доза, необходимая для активации ядерной транслокации мутанта G512R. Альтернативно связывающий лиганд домен может содержать мутации M543 и L544A, приводящие к образованию молекулы, проявляющей чувствительность к тамоксифену и 4-гидрокситамоксифену, которая в 10 раз выше чувствительности, проявляемой мутантом G400V/M543A/L544A. В предпочтительном варианте активируемой последовательностью ядерной локализации является связывающий лиганд домен рецептора эстрогена человека (Metger et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92: 6991-6995) или вариант G521R такого домена, который описан Feil et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 10887-10890). В другом предпочтительном варианте рекомбиназа содержит вариант G525R последовательности ядерной локализации, активируемой эстрогенами, полученной из рецептора эстрогена мыши (аминокислот 281-599 указанного рецептора), на каждом конце белка, как, например, белок MerCreMer, подробно описанный Verrou с соавторами (Biol. Chem., 1999, 380: 1435-1438) и Tannour-Louet M. с соавторами (Hepatology, 2002; 35: 1072-1081), при этом содержание указанных публикации включено в настоящее описание в виде ссылки.

Полинуклеотид согласно изобретению содержит последовательность, кодирующую рекомбиназу, которая находится под оперативным контролем индуцируемого промотора. В контексте изобретения индуцируемый промотор понимают как любую последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию полинуклеотида, расположенного в 3'-направлении, в присутствии соединения или в определенных условиях. Предпочтительно индуцируемыми промоторами, которые можно использовать в контексте изобретения, являются промоторы, отвечающие на индуцирующий агент, которые дают нулевую или незначительную базовую экспрессию в отсутствие индуцирующего агента и которые способны стимулировать активацию гена, локализованного в 3'-положении. В зависимости от типа индуцирующего агента индуцируемые промоторы классифицируют как включаемые/выключаемые Tet-промоторы (Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551; Gossen, M. et al., 1995, Science 268: 1766-1769; Rossi, F.M.V. and H.M. Blau, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 451-456); включаемые/выключаемые Pip-промоторы (US 6287813); зависимые от антипрогестина промоторы (US 2004132086), зависимые от экдизона промоторы (Christopherson et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6314-6318; No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351, Suhr et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 7999-8004 и WO9738117), зависимый от металлотионеина промотор (WO8604920) и зависимые от рапамицина промоторы (Rivera et al., 1996, Nat. Med. 2: 1028-32).

В предпочтительном варианте индуцируемый промотор представляет собой зависимую от тетрациклина систему. Такая система позволяет получать высокие уровни экспрессии, регулируемой тетрациклином или его производными, такими как доксициклин. В такой системе экспрессия гена активируется в присутствии доксициклина и инактивируется в отсутствие доксициклина. Такая система основана на двух регуляторных элементах, встречающихся в опероне резистентности к тетрациклину E. coli, в частности, последовательности тетрациклинового оператора, с которой связывается тетрациклиновый репрессор. Представляющий интерес ген клонируют в 3'-направлении относительно промотора, содержащего несколько элементов ответа на тетрациклин. Вторая плазмида содержит последовательность, кодирующую регуляторный элемент, который называют регулируемым тетрациклином трансактиватором, который состоит из транскрипционного фактора VP16 вируса простого герпеса и тетрациклинового репрессора дикого типа (rtTA-M2, описанного в Zabala с соавторами в Cancer Res., 64: 2799-2804). Следовательно, в присутствии доксициклина слитый белок, образованный тетрациклиновым репрессором и VP16, взаимодействует с индуцируемым промотором, стимулируя транскрипцию гена, расположенного в 3'-напралвении по отношению к промотору. Указанный индуцируемый промотор предпочтительно образован несколькими копиями Tet-оператора (TetO), слитыми с минимальным промотором, таким как, например, минимальный промотор CMV, промотор из 29 пар нуклеотидов центрального белка вируса гепатита В человека или промоторы из 5'-области гена альбумина мыши из 196 или 84 пар нуклеотидов или промотор альбумина (Zabala et al., 2004, выше).

Специалисту в данной области будет понятно, что трансактиватор ответа на тетрациклин может кодироваться геномом клетки, используемой для упаковки, имеющимся полинуклеотидом, содержащим последовательность, кодирующую рекомбиназу, под контролем промотора, чувствительного к тетрациклину, или в предпочтительном варианте и геномом и полинуклеотидом. Количество продуцируемого трансактиватора, таким образом, будет зависеть от количества копий аденовирусного генома в клетке, что в свою очередь позволит адаптировать количество трансактиватора к количеству промоторов, присутствующих в клетке. Последовательность, кодирующая трансактиватор, регулируется конститутивным промотором. Конститутивными промоторами, подходящими для регуляции зависимого от лиганда трансактиватора наряду с другими являются промотор CMV, промотор SV40, промотор DHFR, промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор фактора элонгации 1a (EF1a), промотор альбумина, промотор ApoA1, промотор кератина, промотор CD3, промотор тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, промотор нейрофиламентов, промотор специфичной для нейронов енолазы, промотор L7, промотор CD2, промотор киназы легкой цепи миозина, промотор гена HOX, промотор тимидинкиназы, промотор РНК-полимеразы II, промотор гена MyoD, промотор гена фосфоглицерокиназы (PGK), промотор липопротеида низкой плотности (LDL), промотор гена актина. В предпочтительном варианте промотором, регулирующим экспрессию трансактиватора, является промотор гена PGK.

Полинуклеотид согласно изобретению также содержит область, необходимую для репликации и/или для упаковки аденовируса, которая фланкирована сайтами-мишенями рекомбиназы, которая кодируется указанным полинуклеотидом. Области аденовирусного генома, необходимые для репликации и/или для упаковки указанного генома, включают в себя инвертированные концевые повторы (ITR) и аденовирусную последовательность упаковки Ψ.

Согласно изобретению термин «инвертированный концевой повтор» или «ITR» понимают как последовательности длиной примерно 100 пар нуклеотидов, которые находятся с обеих сторон от линейного генома аденовируса и которые необходимы для репликации аденовирусного генома (Stow,