Аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними

Аденовирусные векторы и способы и применения, связанные с ними

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. А именно, изобретение относится к лечению рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к онколитическим аденовирусным векторам и клеткам и фармацевтическим композициям, содержащим указанные векторы. Настоящее изобретение также относится к применению указанных векторов в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта и к способу лечения рака у субъекта. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования GM-CSF в клетке и повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта, а также к применениям онколитического аденовирусного вектора изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке и для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Предшествующий уровень техники

Рак можно лечить оперативно, с помощью гормональной терапии, химиотерапии и/или лучевой терапии, однако во многих случаях злокачественные опухоли, которые часто обнаруживаются на поздней стадии, нельзя излечить существующими терапевтическими способами. Следовательно, существует необходимость в новых способах лечения, нацеленных на раковые клетки, таких как генная терапия.

На протяжении последних двадцати лет технология переноса генов находится в стадии интенсивного исследования. Целью генной терапии рака является введение гена в клетку опухоли. Эти терапевтические гены, вводимые в клетку-мишень, могут, например, корректировать мутировавшие гены, подавлять активный онкогенез или генерировать дополнительные свойства в клетке. Подходящие экзогенные терапевтические гены включают, но не ограничиваются, иммунотерапевтические, антиангиогенные, хемопротективные и "суицидальные" гены, и их можно вводить в клетку, применяя модифицированные вирусные векторы или невирусные способы, включая электропорацию, генную пушку и липидные или полимерные покрытия.

Требования для оптимальных вирусных генов включают эффективную способность находить конкретные клетки-мишени и экспрессировать вирусный геном в клетках-мишенях. Кроме того, оптимальные векторы должны оставаться активными в тканях-мишенях или клетках-мишенях. Все эти свойства вирусных генов были обнаружены в течение последних декад, и, например, ретровирусные, аденовирусные и аденоассоциированные вирусные векторы были широко исследованы в биомедицине.

Для дальнейшего усиления пенетрации опухоли и локального усиления противоопухолевого действия, сконструированы селективные онколитические агенты, например условно репликационные аденовирусы. Онколитические аденовирусы являются перспективным инструментом для лечения рака. Опухолевые клетки погибают от онколитических аденовирусов благодаря репликации вируса в опухолевой клетке, при этом последняя фаза репликации приводит к высвобождению тысяч вирионов в окружающие опухолевые ткани, вследствие чего происходит эффективная пенетрация опухоли и реинфекция сосудов. Опухолевые клетки обеспечивают репликацию вируса, в то время как нормальные клетки сберегаются благодаря сконструированным изменениям в вирусном геноме, который предотвращает репликацию в неопухолевых клетках.

В дополнение к опосредованной репликацией клеточной гибели, онколитические аденовирусы также можно «заряжать» различными терапевтическими трансгенами. Этот подход объединяет преимущества традиционной доставки генов с эффективностью агентов, способных вызывать репликацию. Одна задача заряженных вирусов состоит в индукции иммунной реакции по отношению к клеткам, которые обеспечивают репликацию вируса. Репликация вируса сама по себе, хотя и иммуногенна, обычно недостаточна для индуцирования эффективного противоопухолевого иммунитета. Для усиления индукции терапевтического иммунитета вирусы можно заряжать стимулирующими белками, такими как цитокины, для облегчения введения опухолевых антигенов в антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, и их стимуляции и/или созревания. Введение иммунотерапевтических генов в опухолевые клетки и к тому же трансляция белков приводит к активации иммунного ответа и эффективному разрушению опухолевых клеток. Наиболее соответствующими в этом отношении иммунными клетками являются натуральные киллеры (NK) и цитотоксические CD8+ Т-клетки.

Аденовирусы являются безоболочными икосаэдрическими вирусами среднего размера (90-100 нм), которые имеют двухцепочечную линейную молекулу ДНК примерно в 36 кб в белковом капсиде. Вирусный капсид имеет фиберные структуры, которые участвуют в прикреплении вируса к клетке-мишени. Сначала выступающий домен белка фибера соединяется с рецептором клетки-мишени (например, CD46 или рецептором аденовируса коксаки (CAR)), затем вирус взаимодействует с молекулой интегрина и в итоге вирус подвергается эндоцитозу в клетке-мишени. Затем вирусный геном транспортируется из эндосом в ядро и репликационный аппарат клетки-мишени используется также для вирусных целей (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

Аденовирусный геном имеет «ранние» (Е1-Е4), «средние» (IX и IVa2) и «поздние» гены (L1-L5), которые транскрибируются в последовательном порядке. Ранние генные продукты влияют на защитные механизмы, клеточный цикл и клеточный метаболизм клетки-хозяина. Средние и поздние гены кодируют структурные вирусные белки для продукции новых вирионов (Wu and Nemerow, 2004, Trends Microbiol 12: 162-168; Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604; Volpers С.and Kochanek S. 2004, J Gene Med 6 suppi 1, S 164-71; Kootstra N.A. and Verma I.M. 2003, Annu Rev Pharmacol Toxicol 43, 413-439).

У людей найдено более чем 50 различных серотипов аденовирусов. Серотипы подразделяются на шесть подгрупп A-F, и известно, что разные серотипы ассоциированы с разными состояниями, т.е. респираторными заболеваниями, конъюнктивитами и гастроэнтеритами. Известно, что аденовирусный серотип 5 (Ad5) вызывает респираторные заболевания и является наиболее широко изученным серотипом в области генной терапии. В первых Ad5-векторах участки Е1 и/или Е3 были удалены, способствуя вставке чужеродной ДНК в векторы (Danthinne and Imperiale 2000). Кроме того, делеции других участков, а также дополнительные мутации обеспечивают особые свойства вирусным векторам. Фактически, предлагаются различные модификации аденовирусов для достижения эффективного противоопухолевого действия.

Например, патент ЕР 1377671 B1 (Cell Genesys, Inc.) и публикация заявки США 2003/0104625 Al (Cheng С. et al.) описывают онколитический аденовирусный вектор, кодирующий иммунотерапевтический белок гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Также публикация ЕР 1767642 A1 (Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.) выделяет онколитические аденовирусные векторы, оказывающие улучшенные эффекты на иммунную реакцию человека.

Также благодаря генной терапии обеспечивается более эффективный и точный перенос генов, а также повышенная специфичность и достаточная способность поражения опухоли. Также должны быть отличными показатели по безопасности терапевтических векторов. Настоящее изобретение обеспечивает инструмент лечения рака вместе с вышеуказанными свойствами посредством применения обоих онколитического и иммунотерапевтического свойств аденовирусов новым и изобретательным путем.

Краткое описание изобретения

Цель изобретения заключается в обеспечении новых способов и средств достижения вышеуказанных свойств аденовирусов и, следовательно, в решении проблем традиционного лечения рака. Более конкретно, изобретение обеспечивает новейшие способы и средства генной терапии.

Настоящая заявка описывает конструкцию рекомбинантных вирусных векторов, способы, связанные с векторами и их применение в опухолевых клеточных линиях, в экспериментальных моделях и у раковых пациентов.

Настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору, содержащему остов нуклеиновых кислот 5-го серотипа (Ad5) аденовируса, делецию из 24 п.о. (D24) в Rb-связывающей константной области 2 аденовирусного Е1 и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в месте удаленного gp19k/6.7K в Е3-области аденовируса.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке, содержащей аденовирусный вектор изобретения.

Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аденовирусный вектор изобретения.

Также настоящее изобретение относится к применению аденовирусного вектора изобретения в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта.

Также настоящее изобретение относится к способу лечения рака у субъекта, где способ включает введение вектора или фармацевтической композиции изобретения субъекту.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования GM-CSF в клетке, который включает:

a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор изобретения, к клетке, и

b) экспрессирование GM-CSF указанного вектора в клетке.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта, причем способ включает:

a) доставку носителя, содержащего онколитический аденовирусный вектор изобретения, к клетке-мишени или ткани,

b) экспрессирование GM-CSF указанного вектора в клетке и

c) повышение количества цитотоксичных Т-клеток и/или натуральных киллеров в указанной клетке-мишени или ткани.

Также настоящее изобретение относится к применению онколитического аденовирусного вектора изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке.

Также настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору изобретения для продуцирования GM-CSF в клетке.

Также настоящее изобретение относится к применению онколитического аденовирусного вектора изобретения для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Также настоящее изобретение относится к онколитическому аденовирусному вектору изобретения для повышения опухолеспецифического иммунного ответа у субъекта.

Настоящее изобретение обеспечивает средство лечения злокачественных опухолей, которые резистентны к традиционным подходам. Также остается немного резистентных типов опухолей, подходящих для лечения, по сравнению с другими способами лечения. К тому же с помощью заявленного изобретения можно излечивать все солидные опухоли. Посредством настоящего изобретения могут быть излечены и более крупные опухоли по массе и более смешанные опухоли. Лечение можно проводить путем внутриопухолевого, внутриполостного, внутривенного введения и в комбинации из указанных. Такой способ лечения может оказать системное действие, несмотря на местное введение. Также в результате лечения заявленным способом могут быть уничтожены клетки, которые предположительно вызывают рост опухоли ("раковые стволовые клетки").

Кроме этого, способствуя транспорту вектора к представляющему интерес участку, вектор изобретения также обеспечивает экспрессию и сохранение трансгена. Кроме того, иммунный ответ против вектора, а также трансгена сводится до минимума.

Настоящее изобретение решает проблему терапевтической резистентности при традиционных способах лечения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает средства и способы селективного лечения, исключающее токсичность или повреждение здоровых тканей. Также преимущества настоящего изобретения включают различные и ослабленные побочные эффекты по сравнению с другими средствами. Важно, что заявленный способ лечения оказывает синергетическое действие со многими другими способами лечения, включая химиотерапию и лучевую терапию, и, следовательно, может использоваться в схемах комбинированного лечения.

В нормальных условиях, индукция иммунного ответа в отношении клеток, которые обеспечивают репликацию «невооруженного» вируса, недостаточна для развития терапевтического иммунитета к опухоли. Для преодоления данного недостатка, настоящее изобретение обеспечивает вирусы, "вооруженные" высокоактивным индуктором противоопухолевого иммунитета. Настоящее изобретение обеспечивает противоопухолевую терапию, при которой опухолевые клетки разрушаются под действием вирионов, вызывающих онколизис. Также оказывают влияние и различные механизмы активирования иммунного ответа человека, включая активацию натуральных киллеров (NK) и дендритных клеток (DC).

По сравнению со способами лечения с использованием аденовирусов, известными из уровня техники, настоящее изобретение обеспечивает более простой, более эффективный, недорогой, нетоксичный и/или безопасный способ противоопухолевой терапии. Кроме того, отпадает необходимость в применении вирусов-помощников.

Новые продукты изобретения способствуют дополнительной оптимизации противоопухолевой терапии.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает схему pAd5-D24-GMCSF. Вирус несет 24-п.о. делецию в константную область 2 из Е1А. gp19k и 6.7К в Е3 замещены кДНК GM-CSF человека. ADP относится к белку, убивающему аденовирус.

Фиг.2 показывает схему первой стадии клонирования с созданием шаттл-плазмиды (pTHSN), несущей GM-CSF.

Фиг.3 показывает схему второй стадии клонирования с созданием плазмиды. содержащей все аденовирусные гены с 24-п.о. делецией в области Е1 (которая опосредует селективную репликацию в раковых клетках).

Фиг.4 показывает схему третьей стадии клонирования с созданием плазмиды, содержащей все аденовирусные гены, за исключением gp19k и 6.7К, которые замещены GM-CSF (pAd5D24.GM-CSF (SEQ ID NO 8)). Ad5-RGD-D24-GMCSF (SEQ ID NO 9), Ad5/3-D24-GMCSF (SEQ ID NO 7) и Ad5-pK7-D24-GMCSF (SEQ ID NO 10) создавали аналогично.

Фиг.5a-d показывают, что GMCSF-экспрессия не ослабляет репликацию вируса и эффект гибели клеток. Фиг.5а представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели клеток, полученных из рака легких (А549), вируса Ad5-D24-GMCSF нового поколения. Фиг.5В представляет результаты анализа MTS, показывающего гибель инициирующих рак клеток JIMT-1 ("раковые стволовые клетки") посредством Ad5-D24-GMCSF. Фиг.5с представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели клеток рака молочной железы (MDA-MB-436) вируса Ad5-D24-GMCSF нового поколения. Фиг.5d представляет результаты анализа MTS, показывающего эффективность гибели MDA-MB-436 вирусов Ad5-D24-GMCSF, Ad5-RGD-D24-GMCSF и Ad5/3-D24-GMCSF нового поколения.

Фиг.6а показывает экспрессию GM-CSF человека, связанную с аденовирусом. А549-клеточную линию инфицировали Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF, среду собирали и определяли экспрессию GM-CSF с помощью FACSARRAY.

Фиг.6b показывает, что аденовирус-экспрессированный GM-CSF сохраняет свою биологическую активность в лимфоцитах человека. TF1-клетки, которым требуется GM-CSF человека для жизнедеятельности, культивировали в присутствии человеческого рекомбинантного GM-CSF (Е. coli-продуцируемый, получен от Sigma) или супернатанта из Ad5-D24-GMCSF-инфицированных клеток.

Фиг.7а и 7b показывают анализ in vitro трансдукции опухоли пациента для тестирования инфекционности Ad5-основанного вируса.

Фиг.7с показывает предварительную оценку опухолевой трансдукции Ad5-D25-GMCSF путем окрашивания его рецептора CAR (коксаки-аденовирусный рецептор) в архивных опухолевых образцах.

Фиг.8а показывает эффективность in vivo Ad5-D24-GMCSF у сирийских хомяков (пермисивных для репликации аденовируса человека) со злокачественными опухолями поджелудочной железы. Оба Ad5D24 и Ad5-D24-GMCSF ликвидировали опухоли за 16 дней лечения. 1×10⁹ VP вируса вводили на дни 0, 2 и 4.

Фиг.8b показывает, что внутриопухолевая инъекция Ad5-D24-GMCSF привела к высоким уровням hGM-CSF в сыворотке сирийских хомяков. У животных, которым вводили Ad5D24E3 или Ad5-D24-GMCSF, брали пробы на 4 день и концентрацию GMC-SF человека в сыворотке определяли с помощью анализа FACS.

Фиг.8с показывает, что лечение HapT1-опухолей с помощью Ad5-D24-GMCSF (но не Ad5D24) защищало сирийских хомяков от последующего повторного заражения HapT1. Это показывает, что Ad5-D24-GMCSF может индуцировать опухолеспецифический иммунный ответ. Животных, которых ранее лечили с помощью Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF (фиг.8а), повторно заражали той же опухолью и измеряли рост опухоли с течением времени.

Фиг.8d показывает индукцию опухолеспецифического иммунного ответа посредством Ad5-D24-GMCSF, лечение опухолей HapT1 с помощью Ad5-D24-GMCSF не защитило сирийских хомяков от опухолей Hak. Животных с опухолями HapT1, подвергшихся ранее лечению Ad5D24 или Ad5D24-GMCSF (фиг.8а), повторно заражали другой опухолью и измеряли рост опухоли с течением времени.

Фиг.9А показывает эффективность Ad5-D24-GMCSF в комбинации с циклофосфамидом при оральном введении. 88% уменьшение размеров опухоли наблюдали с помощью СТ-сканирования через 71 день после начала лечения.

Фиг.9b показывает эффективность лечения с помощью Ad5D24-GMCSF у пациентки с раком яичников. СТ-сканирование показало полное исчезновение всех измеряемых опухолей.

Фиг.10a-d показывают, что Ad5-D24-GMCSF вызывает Т-клеточный ответ против обоих опухолевых эпитопов и аденовируса (присутствующих в опухолевых клетках). Т-клетки, взятые от пациентов, подвергающихся лечению Ad5-D24-GMCSF, анализировали с помощью IFN-гамма ELISPOT при стимуляции смесью пептидов из аденовируса 5 и смесью пептидов опухолевого антигена сурвивин.

Фиг.11 показывает индукцию аденовирусных гексон-специфичных Т-клеток. Лейкоциты, собранные от пациентов, подвергавшихся лечению Ad5-D24-GMCSF, окрашивали CD3, CD8 и гексон-специфичными тетрамерными антителами и анализировали с помощью проточной цитометрии перед и после лечения. Лечение увеличивало гексон-специфические цитотоксические Т-клетки с 0,21 до 2,72%.

Фиг.12 показывает сокращение циркулирующих регуляторных Т-клеток у пациента R73. РВМС, которые положительны по CD4, отрицательны по CD 127 и обогащены Foxp3, являются эффективными регуляторными Т-клетками.

Фиг.13a-i показывают схемы клонирования с получением шаттл-плазмиды (pTHSN), несущей GM-CSF, с получением плазмиды, содержащей все гены с 24 п.о. делецией в E1-участке (который опосредует селективную репликацию в раковых клетках) и с получение плазмиды Ad5/3-D24-GMCSF, содержащей все аденовирусные гены, за исключением gp19k и 6.7К, которые замещены GM-CSF (pAd5D24.GM-CSF).

Фиг.14 показывает нуклеотидную последовательность Ad5/3-D24-GMCSF. Выделенный жирным участок показывает D24-удаленный E1A-участок (нуклеотиды 563-1694). Подчеркнутый участок показывает GM-CSF (нуклеотиды 28380-28814). Область, выделенная курсивом, показывает Ad3 выступающий участок (нуклеотиды 31701-32272). Последовательность, показанная на фигуре, соответствует последовательности SEQ ID NO 7.

Фиг.15 показывает график выживаемости пациентов, подвергшихся лечению Ad5/3-D24-GMCSF.

Подробное описание изобретения

Аденовирусный вектор

В Ad5, а также в других аденовирусах, икосаэдральный капсид состоит из трех главных белков: гексона (II), пентона (III), и выступающего фибера (IV), наряду с минорными белками: VI, VIII, IX, IIIa и IVa2 (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604). Белки VII, небольшой пептид mu и терминальный белок (ТР) связаны с ДНК. Белок V обеспечивает структурную связь с капсидом через белок VI. Вирус, кодирующий протеазу, необходим для процессинга некоторых структурных белков.

Онколитический аденовирусный вектор настоящего изобретения основан на остове нуклеиновой кислоты аденовируса серотипа 5 (Ad5), 24 bp делеции (D24) в Rb-связывающей константной области 2 (CR2) аденовирусного Е1 и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF) в месте удаленного gp19k/6,7K в аденовирусном Е30-участке (фиг.1). В предпочтительном воплощении изобретения аденовирусный вектор основан на аденовирусе человека.

Геном Ad5 содержит ранние (Е1-4), средние (IX и IVa2) и поздние (L1-5) гены, фланкированные по левым и правым инвертированным концевым повторам (LITR и RITR, соответственно), которые содержат последовательности, необходимые для репликации ДНК. Также геном содержит сигнал упаковки ([psi]) и главный поздний промотор (MLP).

Транскрипция раннего гена Е1А начинает репликационный цикл с последующей экспрессией Е1В, Е2А, Е2В, Е3 и Е4. E1-белки модулируют клеточный метаболизм таким путем, который делает клетку более восприимчивой к репликации вируса. Например, они интерферируют с NF-кВ, р53 и pRb-белками. Е1А и Е1В вместе ингибируют апоптоз. Е2 (Е2А и Е2В) и Е4-генные продукты опосредуют репликацию ДНК и Е4-продукты также обеспечивают метаболизм вирусной РНК и предотвращают синтез белка-хозяина. Е3-генные продукты ответственны за защиту против иммунной системы хозяина, повышая лизис клетки, и высвобождение вирусного потомства (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

Средние гены IX и IVa2 кодируют минорные белки вирусного капсида. Экспрессия поздних генов L1-5, которые приводят к продукции вирусных структурных белков, инкапсулированию и созреванию вирусных частиц в ядре, находится под влиянием MLP (Russell W.С. 2000, J General Virol 81, 2573-2604).

По сравнению с аденовирусным геномом дикого типа, аденовирусный вектор изобретения не содержит 24 п.о. из CR2 в E1-участке, в частности в E1A-участке, и gp19k и 6,7К в Е3-участке. В предпочтительном воплощении изобретения в дополнение к неполным участкам Е1 и Е3, онколитический аденовирусный вектор изобретения дополнительно содержит один или несколько участков, выбранных из группы, состоящей из Е2, Е4 и поздних участков. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит следующие участки: левый ITR, неполный E1, pIX, pIVa2, Е2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, неполный Е3, L5, Е4 и правый ITR. Участки могут располагаться в векторе в любом порядке, но в предпочтительном воплощении изобретения участки располагаются в последовательном порядке в направлении 5'-3'. Открытые рамки считывания (ORF) могут находиться в одной цепи ДНК или в разных цепях ДНК. В предпочтительном воплощении изобретения E1-участок содержит вирусный сигнал упаковки.

В используемом здесь значении выражение "остов нуклеиновой кислоты 5 серотипа аденовируса (Ad5)" относится к геному или неполному геному Ad5, который содержит один или несколько участков, выбранных из группы, состоящей из неполного E1, pIX, pIVa2, Е2, VA1, VA2, L1, L2, L3, L4, неполного Е3, L5 и Е4 Ad5-ориджина. Один предпочтительный вектор изобретения содержит остов нуклеиновой кислоты из Ad5. В другом предпочтительном векторе аденовирусный остов нуклеиновой кислоты по большей части происходит из Ad5 и связывается с частью (например, частью структуры капсида) Ad3.

В используемом здесь значении выражение "неполный" участок относится к участку, который не содержит какую-либо часть по сравнению с соответствующим участком дикого типа. "Неполный Е1" относится к El-участку вместе с D24 и "неполный Е3" относится к Е3-участку, не содержащему gp19k/6.7K.

В используемом здесь значении выражения "VA1" и "VA2" относятся к ассоциированных с вирусом РНК 1 и 2, которые транскрибируются под действием аденовируса, но не транслируются. VA1 и VA2 противодействуют защитным механизмам клетки.

В используемом здесь значении выражение "вирусный сигнал упаковки" относится к части вирусной ДНК, которая состоит из серий АТ-богатых последовательностей и регулирует процесс инкапсулирования.

24 п.о. - делеции (D24) Е1 оказывают влияние на домен CR2, который ответственен за связывание Rb-опухолевого супрессора/регулирующего клеточный цикл белка и тем самым обеспечивает индукцию фазы синтеза (S), т.е. ДНК-синтеза, или фазы репликации. Для взаимосвязи pRb и Е1А необходимо восемь аминокислот - со 121 по 127 из консервативной области ElA-белка (Heise С. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139), которые удалены в настоящем изобретении. Вектор настоящего изобретения содержит делеции нуклеотидов, соответствующих аминокислотам 122-129 вектора, описанного в работе Heise С. et al. (2000, Nature Med 6, 1134-1139). Известно, что вирусы с D24 обладают пониженной способностью к преодолению контрольной точки G1-S и к репликации, эффективной только в тех клетках, в которых данная взаимосвязь не требуется, например в опухолевых клетках, дефективных по пути Rb-pl6 (Heise С. et al. 2000, Nature Med 6, 1134-1139; Fueyo J et al. 2000, Oncogene 19, 2-12).

Участок Е3 несущественен для вирусной репликации in vitro, однако Е3-белки играют важную роль в регуляции иммунного ответа хозяина, т.е. в ингибировании обоих врожденного и специфического иммунного ответов. gp19k/6.7K-делеция в Е3 относится к делеции, составляющей 965 п.о., из аденовирусного участка Е3А. В полученной аденовирусной конструкции, оба гена gp19k и 6.7К удалены (Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94). Известно, что gp19k-генный продукт связывает и блокирует молекулы главного комплекса гистосовместимости I (MHC1) в эндоплазматическом ретикулюме и предотвращает распознавание инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Поскольку многие опухоли имеют дефицит MHC1, делеция gp19k увеличивает избирательность вирусов (вирус выводится быстрее, чем вирус дикого типа из нормальных клеток, но не существует различия для опухолевых клеток). 6.7К-белки экспрессируются на клеточной поверхности и они участвуют в снижении регуляции TNF-зависимого апоптоза, индуцируя лиганд (TRAIL) рецептор 2.

В настоящем изобретении GM-CSF-трансген помещают в gp19k/6.7k удаленный участок Е3, сверху промотора Е3. Это ограничивает экспрессию трансгена в опухолевых клетках, что обеспечивает репликацию вируса и последующую активацию Е3-промотора. Е3-промотор может быть любым экзогенным или эндогенным промотором, известным из уровня техники, предпочтительно эндогенным промотором. В предпочтительном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, находится под контролем вирусного промотора Е3.

GM-CSF принимает участие в иммунном ответе за счет воздействия на разные механизмы, включая рекрутинг клеток натуральных киллеров (NK) и стимуляцию антиген-презентирующих клеток (АРС). АРС могут потом обновлять, активировать и нацеливать Т-клетки относительно опухоли. Нуклеотидная последовательность, кодирующая GM-CSF, может быть от любого животного, такого как человек, обезьяна, кролик, мышь, хомяк, собака или кошка, но предпочтительно GM-CSF кодируется последовательностью человека. Нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF, можно модифицировать для повышения эффектов GM-CSF или можно не модифицировать, т.е. взять из дикого типа. В предпочтительном воплощении изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая GM-CSF, принадлежит дикому типу.

Вектор изобретения может также содержать другие модификации, чем неполные делеции CR2 и Е3 и вставки последовательности GM-CSF, как указано выше. В предпочтительном воплощении изобретения все другие участки вектора Ad5 принадлежат дикому типу. В другом предпочтительном воплощении изобретения Е4-участок принадлежит дикому типу. В предпочтительном воплощении изобретения участки дикого типа расположены выше участка Е1. "Выше" относится к непосредственно перед E1-участком в направлении экспрессии. Е1В участок также можно модифицировать в векторе изобретения.

Вставка экзогенных элементов может усилить действия векторов в клетках-мишенях. Применение экзогенных тканевых или опухолеспецифичных промоторов широко распространено в рекомбинантных аденовирусных векторах, и они также могут использоваться в настоящем изобретении. Например, вирусную репликацию можно ограничить в клетках-мишенях, например, под действием промоторов, которые включают, но не ограничиваются, СЕА, SLP, Cox-2, Midkine, hTERT, варианты hTERT, E2F, варианты E2F, CXCR4, SCCA2 и TTS. Их обычно добавляют к контрольному участку Е1А, но, в дополнение к или альтернативно, другие гены, такие как Е1В или Е4, также могут регулироваться. Экзогенные инсуляторы, т.е. блокирующие элементы против неспецифических энхансеров, левый ITR, нативный E1A-промотор или белки хроматина также могут быть включены в рекомбинантные аденовирусные векторы. Любые дополнительные компоненты или модификации могут, при необходимости, использоваться, но не обязательно, в векторах настоящего изобретения.

Большинство взрослых подвержены воздействию наиболее широко применяемого аденовируса 5 серотипа (Ad5), и вследствие этого иммунная система может быстро продуцировать нейтрализующее антитело (NAb) против него. Фактически распространенность анти-AdS NAb может составлять до 50%. Показано, что NAb может индуцироваться против многих из множества иммуногенных белков аденовирусного капсида, и, с другой стороны, показано, что даже небольшие изменения в выступе фибера Ad5 могут обеспечить «ускользание» от капсид-специфичного NAb. Следовательно, модификация выступа является существенным для сохранения или повышения доставки генов вместе с применением аденовирусов у людей.

Кроме того, известно, что Ad5 связывается с рецептором, называемым CAR, посредством выступающей части фибера, и модификации этой выступающей части или фибера могут повысить вхождение в клетку-мишень и вызвать усиленный онколизис в некоторых злокачественных опухолях (Ranki Т. et al. 2007, Int J Cancer 121, 165-174). В действительности, капсид-модифицированные аденовирусы являются подходящими инструментами для улучшения доставки генов в раковые клетки.

В одном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит капсидную модификацию. В используемом здесь значении "капсид" относится к белковой оболочке вируса, которая включает белки гексон, фибер и основания пентона. В настоящем изобретении можно применять любую модификацию капсида, т.е. модификацию белков гексона, фибера и пентона, известную из уровня техники, которая улучшает доставку вируса к опухолевой клетке. Модификации могут быть генетическими и/или физическими и включают, но не ограничиваются, модификации для объединения лиганд, которые распознают клеточные рецепторы и/или блокируют связывание нативных рецепторов, для замещения фибера или выступающего домена аденовирусного вектора выступом другого аденовируса (химеризм) и для добавления специфических молекул (например, FGF2) к аденовирусам. Таким образом, капсидные модификации включают, но не ограничиваются, включение небольших пептидных молекул(ы), пептида(ов), химеризм(ы) или мутацию(и) в фибере (например, в выступающей, хвостовой или стержневой части), гексоне и/или основании пентона. В предпочтительном воплощении изобретения капсидная модификация представляет Ad5/3-химеризм, вставку интегрин-связывающего участка (RGD) и/или модификацию полилизина, связанного с гепарин сульфатом, в фибере. В конкретном воплощении изобретения капсидная модификация представляет собой Ad5/3-химеризм.

В используемом здесь значении "Ad5/3-химеризм" капсида относится к химеризму, в котором выступающая часть фибера происходит из 3 серотипа Ad и остальная часть фибера происходит из 5 серотипа Ad.

В используемом здесь значении "RGD-область" относится к мотиву аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты (RGD), который воздействует на основание пентона и связывается с клеточными αυ интегринами, обеспечивая аденовирусную интернализацию. В предпочтительном воплощении изобретения капсидная модификация представляет собой RGD-4C модификацию. "RGD-4C модификация" относится к вставке интегрин-связывающего RGD-4C-мотива в H1-петле домена выступающего фибера. 4С относится к четырем молекулам цистеина, которые формируют сульфидные мостики в RGD-4C. Конструкция рекомбинантного Ad5 фиберного гена, кодирующего фибер вместе с RGD-4C пептидом, описана подробно, например, в статье Dmitriev I. et al. (1998, Journal of Virology, 72, 9706-9713).

В используемом здесь значении "модификация полилизина, связанного с гепарин сульфатом" относится к добавлению удлинения из семи молекул лизина к с-концу выступа фибера.

Экспрессионные кассеты используются для экспрессирования трансгенов в мишени, такой как клетка, при использовании векторов. В используемом здесь значении выражение "экспрессионная кассета" относится к ДНК-вектору или его части, содержащему нуклеотидные последовательности, которые кодируют сДНК или гены, и нуклеотидные последовательности, которые контролируют и/или регулируют экспрессию указанных кДНК или генов. Одинаковые или разные экспрессионные кассеты можно вставлять в один вектор или в несколько разных векторов. Ad5-векторы настоящего изобретения могут содержать как несколько, так и одну экспрессионную кассету. Однако эффективным является только одна экспрессионная кассета. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит, по меньшей мере, одну экспрессионную кассету. В предпочтительном воплощении изобретения онколитический аденовирусный вектор содержит только одну экспрессионную кассету.

Клетка, содержащая аденовирусный вектор изобретения, может быть любой клеткой, такой как клетка эукариота, клетка бактерии, клетка животного, клетка человека, клетка мыши и т.д. Клетка может быть клеткой in vitro, ex vivo или in vivo. Например, клетку можно использовать для получения аденовирусного вектора in vitro, ex vivo или in vivo, или клетка может быть мишенью, такой как клетка опухоли, которая инфицирована аденовирусным вектором.

В способе получения GM-CSF в клетке носитель, содержащий вектор изобретения, вводится в клетку и в дальнейшем экспрессируется ген GM-CSF и белок транслируется и секретируется паракринным образом. "Носителем" может быть любой вирусный вектор, плазмида или другой инструмент, такой как частица, который способен доставлять вектор изобретения к клетке-мишени. Любой традиционный способ, известный из уровня техники, можно применять для доставки вектора к клетки.

Опухолеспецифический иммунный ответ можно усилить у субъекта посредством настоящего изобретения. Цитотоксические Т-клетки и/или натуральные киллеры стимулируются, продуцируются и нацеливаются как результат экспрессии GM-CSF. В предпочтительном воплощении изобретения количество натуральных киллеров и/или цитотоксических Т-клеток увеличивается в клетке-мишени или ткани. Для доведения до конца или изучения эффектов изобретения можно определить различные маркеры иммунного ответа (например, маркеры воспаления). Наиболее распространенные маркеры включают, но не ограничиваются, повышение уровней провоспалительных цитокинов, опухоле- или аденовирус-специфических цитотоксических Т-клеток, рекрутинг и активация антиген-презентирующих клеток или увеличение размера локальных лимфатических узлов. Уровни этих маркеров можно исследовать любыми традиционными способами, известными из уровня техники, включая те, но не ограничиваясь, в которых используются антитела, зонды, праймеры и т.д., такие как анализ ELISPOT, тетрамерный анализ, пентамерный анализ и анализ разных типов клеток в крови или в опухолях.

Рак

Рекомбинантные Ad5-векторы изобретения были сконструированы для ведения репликации в клетках, которые имеют дефекты в Rb-пути, в особенности пути Rb-p16. Эти дефективные клетки включают все опухолевые клетки у животных и людей (Sherr С.J. 1996, Science 274, 1672-1677). В предпочтительном воплощении изобретения вектор способен к селективной репликации в клетках, имеющих дефекты в Rb-пути. В используемом здесь значении понятие "дефекты Rb-пути" относится к мутациям и/или эпигенетическим изменениям в любых генах или белках указанного пути. Вследствие этих дефектов опухолевые клетки сверхэкспрессируют E2F и, следовательно, связывание Rb посредством Е1А CR2, что требуется для эффективной репликации в нормальных условиях, не является необходимым.

Любой рак или любые опухоли, включая злокачественные и доброкачественные опухоли, а также первичные опухоли и метастазы, могут являться мишенями генной терапии. В конкретном воплощении изобретения рак представляет собой любую солидную опухоль. В предпочтительном воплощении изобретения рак выбирают из группы, состоящей из назофарингеального рака, синовиального рака, гепатоцеллюлярного рака, рака почек, рака соединительных тканей, меланомы, рака легких, колоректального рака, рака толстой кишки, рака прямой кишки, рака ободочной и прямой кишки, рака мозга, рака гортани, рака полости рта, рака печени, рака костей, рака поджелудочной железы, хориокарциномы, гастриномы, феохромоцитомы, пролактиномы, Т-клеточной лейкемии/лимфомы, нейромы, болезни фон Гиппеля-Линдау, синдром Золлингера-Эллисона, рака надпочечников, рака анального канала, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака уретры, рака мозга, олигодендроглиомы, нейробластомы, менингиомы, опухоли позвоночника, рака костей, остеохондромы, хондросаркомы, саркомы Юинга, рака без выявленного первичного очага, карциноида, карциноида желудочно-кишечного тракта, фибросаркомы, рака молочной железы, болезни Пэджета, рака шейки матки, колоректального рака, ректального рака, рака пищевода, рака желчного пузыря, рака головы, рака глаз, рака шеи, рака почки, опухоли Вильмса, рака