Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а

Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Эта заявка претендует на эффект по предварительной заявке США № 61/196753 от 20 октября 2008г., полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы очистки моноклональных антител фармацевтического качества, получаемых из ферментирующей культуры, обычно включают четыре основных стадии. Эти стадии включают: (1) сбор/осветление-отделение клеток-хозяев от ферментирующей культуры; (2) захват-отделение антитела от большинства компонентов осветленного продукта; (3) доочистку-удаление остаточных примесей и агрегатов из клеток-хозяев; и (4) приготовление состава-введение антитела в соответствующий носитель для максимальной стабильности и времени хранения.

Однако эти стадии часто не приводят к композиции антитела с чистотой, достаточной для использования в фармацевтике. Поэтому в настоящий момент необходимы способы получения и очистки представляющих интерес антител в достаточно чистой форме, подходящих для использования в фармацевтике. Настоящее изобретение направлено на эту цель.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы выделения и очистки антител из образца культурального материала. В некоторых аспектах изобретение направлено на способы очистки антител, в которых используется аффинная хроматография, предпочтительно хроматография на основе белка А. В определенных аспектах в способах по настоящему изобретению используют стадию инактивации кислотой, стадию аффинной хроматографии и одну или более дополнительных стадий хроматографии и/или фильтрации. Хроматографические стадии могут включать одну или более стадий ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобных взаимодействий. Кроме того, настоящее изобретение направлено на фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, очищенных описанным в настоящем документе способом.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения направлен на способ очистки антитела или его антигенсвязывающего участка из образца культурального материала, в котором полученная композиция антитела по существу свободна от белков клетки-хозяина («БКХ»). В одном аспекте культуральный материал включает продукт клеточной линии, причем клеточную линию используют для продукции специфических антител по настоящему изобретению. В конкретном аспекте образец культурального материала (или просто образец) получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к IL-12; в другом аспекте образец культурального материала получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к TNFα; и в еще одном аспекте образец культурального материала получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к IL-18.

Один способ по настоящему изобретению включает подведение рН в образце культурального материала, содержащем потенциально представляющее интерес антитело или его антигенсвязывающий участок. В одном аспекте рН подводят до кислых значений рН. Примером подходящего рН является показатель рН между примерно 3 и 5, предпочтительно рН примерно 3,5. Это первичное выделение проводят отчасти для уменьшения количества или инактивации рН-чувствительных вирусов. Кроме снижения количества и/или инактивации вирусов, кислые условия облегчают удаление клеток и клеточного дебриса, в результате чего образуется первичный выделенный образец. После соответствующего отрезка времени рН можно подвести до более нейтрального или основного значения и провести аффинную хроматографию, предпочтительно хроматографию на основе белка А, первичного выделенного образца. В одном аспекте образец после аффинной хроматографии собирают и дополнительно проводят последовательные стадии хроматографической очистки, такой как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобных взаимодействий.

В одном варианте осуществления изобретения стадия аффинной хроматографии включает нанесение первичного выделенного образца на колонку, содержащую подходящий носитель для аффинной хроматографии. Неограничивающие примеры таких хроматографических носителей включают, но не ограничены ими, смолу на основе белка А, смолу на основе белка G, аффинные носители, содержащие антиген, к которому получали представляющее интерес антитело, и аффинные носители, содержащие Fc-связывающий белок. Для аффинной очистки и выделения антител (IgG) пригодна смола на основе белка А. В одном аспекте колонку на основе белка А уравновешивают соответствующим буфером до нанесения образца. Примером соответствующего буфера является Tris/NaCl-буфер с pH примерно 7,2. После уравновешивания образец можно нанести на колонку. После нанесения на колонку ее можно промыть один или несколько раз, используя, например, буфер для уравновешивания. Перед элюцией с колонки можно использовать другие промывки, включая промывки другими буферами. Затем образец можно элюировать с колонки на основе белка А, используя соответствующий элюирующий буфер. Примером подходящего элюирующего буфера является буфер, содержащий уксусную кислоту и NaCl, с рН примерно 3,5. Элюцию можно контролировать с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, можно наблюдать за поглощением при 280 нм (OD₂₈₀). Представляющие интерес элюированные фракции(ию) затем можно подготовить для дополнительной очистки.

В одном варианте осуществления изобретения за аффинной хроматографией на основе белка А следует ионообменная стадия. Эта ионообменная стадия представляет собой катионный или анионный обмен или их комбинацию. Эта стадия может представлять собой одну процедуру ионообмена или может включать несколько ионообменных стадий, таких как катионообменная стадия, за которой следует анионообменная стадия, или наоборот. В одном аспекте ионообменная стадия представляет собой одностадийную процедуру. В другом аспекте ионообменная стадия представляет собой двухстадийный ионообменный процесс. Подходящей катионообменной колонкой является колонка, неподвижная фаза которой включает анионные группы. Примером такой колонки является Fractogel™ SO₃ ^-. Эта стадия ионообменной захватывающей хроматографии облегчает выделение антител из образца. Подходящей анионообменной колонкой является колонка, неподвижная фаза которой включает катионные группы. Примером такой колонки является колонка Q Sepharose™. Одна или более ионообменных стадий дополнительно очищают антитела, снижая содержание примесей, таких как белки и ДНК клеток-хозяев, и при необходимости содержание белка из аффинного носителя. Эту процедуру анионного обмена проводят хроматографией в режиме проскока, при котором целевые антитела не взаимодействуют с анионообменной смолой (или твердой фазой) или не связывают ее. Однако многие примеси взаимодействуют с анионообменной смолой или связываются с ней. В конкретном аспекте ионообменная стадия представляет собой анионообменную хроматографию.

Элюат после аффинной хроматографии подготавливают для ионообмена, подводя рН и ионную силу в буфере для нанесения образца. Например, рН элюата после аффинной хроматографии можно подвести до показателя от примерно 6,0 до примерно 8,5 1М Tris-буфером. Перед нанесением образца (элюата после аффинной хроматографии) на ионообменную колонку ее можно уравновесить, используя подходящий буфер. Примером подходящего буфера является Tris/NaCl-буфер с рН от примерно 6,0 до примерно 8. После уравновешивания на колонку можно нанесли элюат после аффинной хроматографии. После нанесения колонку можно промыть один или несколько раз подходящим буфером. Примером подходящего буфера является сам буфер для уравновешивания. К сбору проскока можно приступать, например, когда поглощение (OD₂₈₀) поднимется выше примерно 0,2 AU.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в настоящий способ включена дополнительная стадия. Эта стадия включает использование хроматографии гидрофобных взаимодействий («ХГВ»). Подходящей колонкой является колонка, у которой неподвижная фаза содержит гидрофобные группы. Примером такой колонки является колонка со смолой Phenyl-Sepharose™ (фенил-сефарозой). В ходе процесса выделения/очистки возможно образование агрегатов целевых антител. Эта стадия гидрофобной хроматографии облегчает удаление этих агрегатов. Она также способствует удалению примесей. В процедуре используется высокосолевой буфер, который усиливает взаимодействие антител (или их агрегатов) с гидрофобной колонкой. Элюцию с колонки осуществляют более низкими концентрациями соли.

В еще одном варианте осуществления изобретения элюат после ХГВ фильтруют через фильтр для удаления вирусов, такой как фильтр Ultipor DV20™. Эта процедура отделяет вирусные частицы из элюата после колонки с фенил-сефарозой для снижения количества вирусов (если таковые присутствуют) до безопасного уровня. В этом варианте осуществления изобретения можно использовать фильтры, хорошо известные специалистам в данной области.

Чистоту интересующих антител в полученном образце продукта можно проанализировать, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области, например, гель-фильтрацию, ВЭЖХ-анализ на колонке Poros™ A, БКХ-ELISA (твердофазный ИФА на белки клеток-хозяев), белок A-ELISA (твердофазный ИФА на белок А) и Вестерн-блот анализ.

В еще одном варианте осуществления изобретение направлено на одну или более фармацевтических композиций, содержащих выделенное антитело или его антигенсвязывающий участок и приемлемый носитель. В другом аспекте композиции дополнительно содержат один или более фармацевтических агентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к IL-12 (ABT-847).

На фиг. 2 приведены последовательности тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к IL-18 (ABT-325).

На фиг. 3 приведены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к TNFα (Адалимумаба).

На фиг. 4 изображена типичная хроматограмма, показывающая чистоту продукта из биореактора объемом 300 л после использования хроматографии на основе белка А (на смоле MabSelect™) для захвата антител к IL-12 и снижения примесей в продукте и примесей, связанных с процессом, таких как одиночные и двойные фрагменты легкой цепи, белки и ДНК клеток-хозяев СНО и т.д.

На фиг. 5 приведена оценка условий промывки MabSelect™.

Фиг. 6 представляет собой фотографию разделения в полиакриламидном геле осадков, полученных после подведения рН элюата с MabSelect™ до 8 и проводимости до 7 мСм/см.

На фиг. 7 представлен типичный хроматографический профиль проскока с хроматографической колонки Q Sepharose™ FF в масштабе биореактора 300 л.

На фиг. 8 представлен типичный хроматографический профиль элюции с хроматографической колонки Phenyl Sepharose™ НР в масштабе биореактора 300 л.

На фиг. 9 показаны результаты анализа динамической обменной емкости, в результате которого было установлено, что 10%-ная точка проскока для смолы MabSelect™ составляет 37,4 г антитела на л смолы.

Фиг. 10 представляет собой фотографию разделения в полиакриламидном геле, приведенную для сравнения отличий между промежуточными продуктами выделения способа, в котором используется белок А, и способа AY-04. Наносили по 2 мкг антител для каждого образца.

На фиг. 11 представлен выход Адалимумаба после очистки на MabSelect™ относительно рН элюции. На фигуре продемонстрировано, что выход, по меньшей мере, 90% получали в диапазоне рН элюции, составляющем 2,5-3,8, а при рН 4 выход значительно снижался.

На фиг. 12 показаны результаты анализа сравнения выхода мономера Адалимумаба относительно рН элюции и времени инкубации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы выделения и очистки антител из образца культурального продукта. Один аспект изобретения направлен на снижение количества вирусов/их инактивацию в образцах, получаемых на различных стадиях очистки антител. В конкретном аспекте в способах по настоящему изобретению используется стадия кислотного снижения количества/инактивации вирусов, за которой следуют одна или более хроматографических стадий. Хроматографические стадии могут включать одну или более из следующих хроматографических процедур: ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Кроме того, настоящее изобретение направлено на фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, очищенных описанным в настоящем документе способом.

Для ясности, а не для ограничения, это подробное описание было разбито на следующие разделы:

1. Определения.

2. Получение антител.

3. Продукция антител.

4. Очистка антител.

5. Способы оценки чистоты продукта.

6. Дополнительные модификации.

7. Фармацевтические композиции.

8. Применение антител.

1. Определения

Для более легкого понимания настоящего изобретения далее прежде всего приведены определения некоторых терминов.

Термин «антитело» включает молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области можно дополнительно разделить на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемыми более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH- и VL-область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, начиная с амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин «антигенсвязывающий участок» антитела (или «участок антитела») включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, hIL-12, hTNFα или hIL-18). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином «антигенсвязывающий участок», антитела включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, содержащий VL-, VH-, CL- и CH1-домены; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, содержащий VH- и CH1-домены; (iv) Fv-фрагмент, содержащий VL- и VH-домены одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), который содержит VH-домен; и (vi) изолированную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, их можно соединить рекомбинантными способами через синтетический линкер, что позволяет изготавливать их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области образуют пару, давая моновалентную молекулу (известную как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); смотри, например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающий участок» антитела. Также охвачены другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Диантитела являются бивалентными биспецифичными антителами, в которых VH- и VL-домены экспрессируются в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для образования пар между двумя доменами в одной цепи, таким образом, обуславливая образование пар между комплементарными доменами разных цепей и создавая два антигенсвязывающих участка (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий участок могут представлять собой часть более крупной иммуноадгезионной молекулы, образуемой ковалентными или нековалентными связями антитела или участка антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких иммуноадгезионных молекул включают использование «коровой» (связывающей биотин) области стрептавидина для создания тетрамерной scFv-молекулы (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для создания бивалентных и биотинилированных scFv-молекул (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки). Участки антител, такие как Fab- и F(ab')2-фрагменты, можно получить из полноразмерных антител, используя общепринятые методики, такие как расщепление папаином или пепсином соответственно полноразмерных антител. Более того, антитела, участки антител и иммуноадгезионные молекулы можно получить, используя стандартные методики рекомбинантных ДНК, описанные в настоящем документе. В одном аспекте антигенсвязывающие участки представляют собой полноразмерные домены или пары полноразмерных доменов.

Используемая в настоящем описании фраза «интерлейкин-12 человека» (сокращенно называемый в настоящем описании hIL-12 или IL-12) включает цитокин человека, секретируемый в основном макрофагами и дендритными клетками. Термин включает гетеродимерный белок, содержащий субъединицу 35 кДа (р35) и субъединицу 40 кДа (р40), которые соединены друг с другом дисульфидным мостиком. Гетеродимерный белок называется «субъединицей р70». Структура IL-12 человека более подробно описана, например, в Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки. Кодирующая IL-12 нуклеиновая кислота имеет номер доступа NM_000882 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа NP_000873.2 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин IL-12 человека включает рекомбинантный IL-12 человека (rhIL-12), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Используемая в настоящем описании фраза «интерлейкин-18 человека» (сокращенно называемый в настоящем описании hIL-18 или IL-18) включает цитокин человека, который исходно синтезируется в виде биологически неактивного 193-аминокислотного белка-предшественника, а также 156-аминокислотный зрелый белок, получаемый (например, а не в качестве ограничения) расщеплением белка-предшественника, например, каспазой-1 или каспазой-4, который проявляет биологическую активность, включающую костимуляцию пролиферации Т-клеток, усиление цитотоксичности NK-клеток и индукцию продукции IFN-γ Т-клетками и NK-клетками и усиление дифференцировки Т-хелперов 1-го типа (Th1). Кодирующая IL-18 нуклеиновая кислота имеет номер доступа NM_001562 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа NP_001553 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин IL-18 человека включает рекомбинантный IL-18 человека (rhIL-18), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Фраза «фактор некроза опухолей α» (сокращенно называемый в настоящем описании hTNFα или TNFα) относится к многофункциональному провоспалительному цитокину, секретируемому преимущественно моноцитами/макрофагами, который действует на метаболизм липидов, коагуляцию, инсулинорезистентность и функцию эндотелия. TNFα представляет собой растворимый гомотример белковых субъединиц с молекулярным весом 17 кДа. Также существует мембраносвязанная форма белка-предшественника с молекулярным весом 26 кД. Он был обнаружен в синовиальных клетках и макрофагах в тканях. Другие клетки (помимо моноцитов и макрофагов) также продуцируют TNFα. Например, немоноцитарные опухолевые клеточные линии человека продуцируют TNFα, а также его продуцируют CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты периферической крови и некоторые культивируемые Т- и В-клеточные линии. Кодирующая TNFα нуклеиновая кислота имеет номер доступа X02910 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа CAA26669 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин TNFα человека включает рекомбинантный TNFα человека (rhTNFα), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Термины «нумерация по Кабат», «определения по Кабат» и «разметка по Кабат» используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Эти известные в данной области термины относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными) по сравнению с другими аминокислотными остатками в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающего участка (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391; и Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Для вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область соответствует аминокислотам с 31-ной по 35-ную для CDR1, аминокислотам с 50-ной по 65-ную для CDR2 и аминокислотам с 95-ной по 102-ную для CDR3. Для легкой цепи гипервариабельная область соответствует аминокислотам с 24-ной по 34-ную для CDR1, аминокислотам с 50-ной по 56-ную для CDR2 и аминокислотам с 89-ной по 97-ную для CDR3.

Термин «антитело человека» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевой линии человека, описанным Kabat et al. (см. Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматических мутаций in vivo), например, в CDR-областях и, в частности, CDR3. Мутации можно ввести с использованием «подхода селективного мутагенеза». Антитело человека может иметь, по меньшей мере, одну замененную аминокислотную позицию, например, усиливающим активность аминокислотным остатком, который не кодируется последовательностью иммуноглобулина зародышевой линии. Антитело человека может иметь до двадцати позиций, замененных аминокислотными остатками, которые не являются частью последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека. В других вариантах осуществления изобретения заменены до десяти, до пяти, до трех или до двух позиций. В одном варианте осуществления изобретения эти замены расположены в CDR-областях. Однако используемый в настоящем описании термин «антитело человека» не предполагает включение антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, перенесены в каркасные последовательности иммуноглобулина человека.

Фраза «подход селективного мутагенеза» включает способ усиления активности антитела путем отбора и индивидуального мутагенеза аминокислот из CDR, по меньшей мере, по одной из подходящей для селективного мутагенеза позиции, позиции, по которой проходит гипермутация, и/или контактной позиции. «Селективно мутированное» антитело человека представляет собой антитело, которое содержит мутацию в позиции, выбранной с использованием подхода селективного мутагенеза. В другом аспекте предполагается, что подход селективного мутагенеза обеспечивает способ предпочтительного мутагенеза выбранных индивидуальных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (в дальнейшем H1, H2 и H3 соответственно), или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи (в дальнейшем L1, L2 и L3 соответственно) антитела. Аминокислотные остатки могут быть выбраны из позиций для селективного мутагенеза, контактных позиций или гипермутирующих позиций. Индивидуальные аминокислоты выбирают, исходя из их позиции в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Следует понимать, что гипермутирующая позиция также может быть контактной позицией. В одном аспекте подход селективного мутагенеза представляет собой «направленный подход». Предполагается, что выражение «направленный подход» включает способ мутагенеза выбранных индивидуальных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела направленным образом, например, в виде «группового направленного подхода» или «CDR-направленного подхода». В «групповом направленном подходе» индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных группах являются мишенями селективного мутагенеза, включая группы I (включающие L3 и H3), II (включающие H2 и L1) и III (включающие L2 и H1), группы перечислены в порядке предпочтения для мутагенеза. В «CDR-направленном подходе» индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных CDR являются мишенями для селективного мутагенеза в следующем порядке предпочтения для мутагенеза: H3, L3, H2, L1, H1 и L2. Выбранный аминокислотный остаток заменяют, например, по меньшей мере, на два других аминокислотных остатка и определяют эффект мутации на активность антитела. Активность измеряют как изменение специфичности связывания/аффинности антитела и/или нейтрализующей способности антитела. Следует понимать, что подход селективного мутагенеза можно использовать для оптимизации любого антитела, полученного из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с зародышевыми линиями IgG человека и антитела человека, выделенные из В-клеток человека. Подход селективного мутагенеза можно использовать для антител, которые нельзя дополнительно оптимизировать с помощью методики фагового дисплея. Следует понимать, что антитела из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенные животные с зародышевыми линиями IgG человека и антитела человека, выделенные из В-клеток человека, могут быть предметом обратного мутагенеза до или после подхода селективного мутагенеза.

Фраза «рекомбинантное антитело человека» включает антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают соединение последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (см., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NEH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо в случае использования трансгенных животных для последовательностей Ig человека - соматическому мутагенезу in vivo), и поэтому аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из VH- и VL-последовательностей зародышевой линии человека или связанными с ними, могут не существовать в природном репертуаре антител человека зародышевой линии in vivo. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные антитела являются результатом селективного мутагенеза или обратного мутагенеза, либо двух этих подходов.

«Выделенное антитело» включает антитело, которое по существу свободно от других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hIL-12, по существу свободно от антител, которые специфично связывают другие антигены, кроме hIL-12). Выделенное антитело, которое специфично связывает hIL-12, может связывать молекулы IL-12 других биологических видов. Более того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических соединений. Подходящие антитела к IL-12, которые можно очистить в контексте настоящего изобретения, раскрыты в патенте США № 6914128 (полное содержание которого, таким образом, включено путем ссылки), в том числе, но не ограниченные этим, антитело к IL-12, обозначенное в данном патенте как J695, и которое впоследствии обозначается ABT-874. Подходящие антитела к IL-18, которые можно очистить и выделить в контексте настоящего изобретения, раскрыты в USSN 09/780035 и 10/988360, включая антитело, которое впоследствии обозначается ABT-325. Подходящим антителом к TNFα является Адалимумаб (Abbott Laboratories).

«Нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-12») включает антитело, чье связывание с hIL-12 приводит к ингибированию биологической активности hIL-12. Это ингибирование биологической активности hIL-12 можно оценить, измеряя один или более индикаторов биологической активности hIL-12, например, ингибирование индуцируемой фитогемагглютинином (ФГА) пролиферации бластных клеток человека в анализе пролиферации бластных клеток, индуцируемой ФГА, или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания рецептора IL-12 человека. Эти индикаторы биологической активности hIL-12 можно оценить с помощью одного или нескольких стандартных in vitro или in vivo методов анализа, известных в данной области.

«Нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-18») включает антитело, чье связывание с hIL-18 приводит к ингибированию биологической активности hIL-18. Это ингибирование биологической активности hIL-18 можно оценить, измеряя один или более индикаторов биологической активности hIL-18, например, индукцию синтеза IFNγ T-клетками или NK-клетками, или ингибирование связывания рецептора IL-18 в анализе связывания рецептора IL-18 человека. Эти индикаторы биологической активности hIL-18 можно оценить с помощью одного или нескольких стандартных in vitro или in vivo методов анализа, известных в данной области.

Термин «активность» включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к антигену, например, антитела к hIL-12, связывающего антиген IL-12, и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к hIL-12, чье связывание с hIL-12 ингибирует биологическую активность hIL-12, например, ингибирование индуцируемой ФГА пролиферации бластных клеток или ингибирование связывание рецептора в анализе связывания рецептора IL-12 человека. Термин «активность» включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к IL-18 к своему антигену, например, антитела к hIL-18, связывающего антиген IL-18, и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к hIL-18, чье связывание с hIL-18 ингибирует биологическую активность hIL-18. Термин «активность» также включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к TNFα антитела к своему антигену, например, антитела к TNFα, связывающего антиген TNFα, и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к TNFα, чье связывание с hTNFα ингибирует биологическую активность hTNFα.

Фраза «поверхностный плазмонный резонанс» включает оптическое явление, которое позволяет анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени путем детекции изменения концентраций белков в биосенсорном носителе, например, с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ.). Дополнительное описание см. в Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., el al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, полное содержание которых включено в настоящий документ.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «K_off» относится к константе скорости диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «K_d» относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антиген/антитело.

Фраза «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК и РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но в одном аспекте представляет собой двухцепочечную ДНК.

Фраза «выделенная молекула нуклеиновой кислоты», используемая в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или участки антител (например, VH, VL, CDR3), например, антитела, которые связывают hIL-12, hTNFα или hIL-18, включает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или участок антитела, свободны от других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или участки антител, связывающих другие антигены помимо hIL-12, hTNFα или hIL-18, которые могут в природе окружать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота по изобретению, кодирующая VH-область антитела к IL-12h, антитела к TNFα или антитела к hIL-18, не содержит других последовательностей, кодирующих другие VH-области, которые связывают другие антигены, помимо, например, IL-12, hTNFα или hIL-18. Также предполагается, что фраза «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» включает последовательности, кодирующие бивалентные, биспецифичные антитела, такие как диантитела, в которых VH- и VL-области не содержат других последовательностей, кроме последовательностей диантитела.

Фраза «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») включает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут возникнуть некоторые модификации вследствие либо мутаций, либо воздействия окружающей среды, такое потомство может в действительности быть не идентичным родительской клетке, но оно все еще включено в объем термина «клетка-хозяин», используемый в настоящем документе.

Предполагается, что используемый в настоящем документе термин «модификация» относится к изменению одной или более аминокислот в антителах или их антигенсвязывающих участках. Изменения можно вносить добавлением, заменой или удалением аминокислот по одной или нескольким позициям. Изменения можно вносить, используя известные методики, такие как ПЦР-мутагенез.

Предполагается, что используемый в настоящем документе термин «примерно» относится к диапазону приблизительно в 10-20% выше или ниже указываемого значения. Для специалиста в данной области будет ясно, что в некоторых обстоятельствах вследствие природы указываемого значения термин «примерно» может относиться к диапазону меньше или больше 10-20%-ного отклонения от этого значения.

Предполагается, что используемая в настоящем документе фраза «снижение количества/инактивация вирусов» относится к снижению числа вирусных частиц в конкретном образце («снижение количества»), а также к снижению активности, например, но не ограниченной этим, инфицирующей способности или способности к репликации вирусных частиц в конкретном образце («инактивация»). Такое снижение количества и/или активности вирусных частиц может быть порядка от примерно 1% до примерно 99%, предпочтительно от примерно 20% до примерно 99%, более предпочтительно от примерно 30% до примерно 99%, более предпочтительно от примерно 40% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 50% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 60% до примерно 99%, еще более предпочтительно от приме