Способ и прибор для сортировки клеток

Способ и прибор для сортировки клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США №61/077083, поданной 30 июня 2008 г.; все содержание которой включено в настоящее описание путем отсылки. Настоящая заявка связана с одновременно поданной заявкой на патент США №___(реестр адвокатов №30752/44821), все содержание которой также включено в данную заявку путем отсылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение, в целом, связано со способами и приборами, предназначенными для сортировки клеток, и, в частности, со способами и приборами, предназначенными для использования контролируемого источника энергии с целью преобразования популяции целевых клеток путем выборочного удаления, увеличения числа или изменения клеток, вирусов или частиц в популяции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проточная цитометрическая сортировка позволяет отбирать, увеличивать число, пропорционально распределять или делить популяции целевых клеток, вирусов, организмов или частиц (далее - клетки). Критерии отбора включают измеряемые свойства отдельных клеток, которые можно выявить снаружи клетки как с помощью, так без помощи химических реагентов, комплексов, или организмов, которые присоединяются или могут присоединяться к клетке. Например, свойства клеток можно измерить или приблизительно установить посредством обнаружения и/или определения связи клеток с одной или несколькими метками, такими как флуоресцирующие молекулы, комплексы или организмы, или молекулы, комплексы или организмы, измененные с целью обеспечения флуоресценции. Такие флуоресцирующие молекулы, комплексы и/или организмы могут избирательно присоединяться к клеткам исходя из качественных или количественных свойств клеток, включая их состав в плане содержания белков, липидов, фосфопротеинов, гликопротеинов, фосфолипидов, нуклеиновых кислот (включая количество, последовательность или структуру нуклеиновых кислот), углеводов, солей/ионов и других молекул, находящихся в клетках или присоединенных к ним. Кроме того, такие флуоресцирующие молекулы, комплексы и/или организмы могут избирательно присоединяться к клеткам исходя из физических или физиологических характеристик клеток, таких как проницаемость мембран, состав мембран, текучесть мембран, химический или мембранный потенциал, жизнеспособность, химические градиенты, подвижность, восстановительный или окислительный потенциал или состояние восстановления или окисления, а также другие параметры и свойства.

Другие измеряемые свойства помеченных или непомеченных, измененных или неизмененных клеток, которые могут служить основанием для отбора клеток, включая, без ограничения:

свойства взаимодействия света с клетками, например флуоресценция, спектральная поглощательная способность, отражательная способность, рассеяние, поляризация или другие свойства;

электрические свойства клеток или воздействие клеток на свою среду, включая проводимость, индуктивность, сопротивление, мембранный потенциал или напряжение, а также другие свойства;

магнитные или электромагнитные свойства клеток, включая магнетизм, парамагнетизм, магнитный резонанс и/или взаимодействие клеток с электромагнитной энергией;

внешние признаки, вид или морфологические свойства клеток; и

состав клеток по отношению к какому-либо веществу или параметру, измеренному прямо или косвенно, каким бы то ни было способом.

Кроме того, прямое или косвенное измерение таких параметров как по отдельности, так и в комбинации может отражать простые или сложные свойства целевых клеток.

Примером такого свойства является половая хромосома, входящая в диплоид, гаплоид или геном гаметы, она может быть Х-хромосомой или Y-хромосомой или их сочетанием в зависимости от типа клетки и организма. Определить содержания половой хромосомы можно при помощи одного или нескольких месяцев на основании прямых или косвенных измерений или определений. Такие способы включают в себя измерение содержания в клетках относительно или абсолютно определенной ДНК; наличие или отсутствие определенных последовательностей ДНК или маркеров наличия или отсутствия определенных последовательностей ДНК; размер клеток или частей, или органелл клеток; наличие, местонахождение или отсутствие белков или другой характеристики маркеров, их комбинаций или моделей представления таких маркеров содержания половой хромосомы в клетках; или любое другое измерение, отражающее состав половой хромосомы клетки. Для выявления клеток, представляющих интерес в определенном случае, ситуации, системе, болезни, состоянии, процессе или обстоятельствах может потребоваться целый ряд подобных изменений или манипуляций, направленных на определение свойств.

Такие цитометрические измерения обеспечивают возможность определять количественные и/или качественные свойства клеток, популяций клеток, органов, тканей или организмов. Такие определения могут использоваться различным образом, включая, в том числе, диагностику, биомедицинское исследование, проектирование, эпидемиологию, медицину, сельское хозяйство, животноводство, содержание скота, зоологию, биофармацевтическую промышленность и другие сферы. Помимо возможности проводить такие измерения существующие способы и аппаратура позволяют разделять клетки на основании характеристик или параметров, измеренных с помощью описанной выше цитометрии. Отбор клеток может быть позитивно-негативным и производиться путем концентрирования, сбора или разделения целевых клеток или путем удаления ненужных или нецелевых клеток в составе. Контроль за таким отбором может вестись на основании любого параметра, характеристики или комбинации параметров или характеристик, которые можно определить так, как указано выше.

Клетки, выявленные с помощью способов, включающих описанные выше способы или связанные с ними, можно разделить, отделить, увеличить или уменьшить степень их концентрации или объединить их в любое произвольное число групп. В одном распространенном способе разделения (представленном на фиг.1А) используются электростатические силы для отвода электрического или электростатического потока, капли или капель, содержащих клетку или клетки с нужными или ненужными свойствами. Отклоненные клетки соответствующим образом собираются или исключаются в зависимости от области применения, как показано на фиг.1А. Другие способы разделения включают использование струйных элементов, в том числе клапаны для отвода клеток в потоке жидкости в альтернативные пути, каналы, трубки или элементы для последующего сбора или удаления, как показано на фиг.1В.

Существует ряд методов и систем для проточной цитометрический сортировки клеток, в том числе методы и системы, разработанные специально для проточной цитометрический сортировки сперматозоидов млекопитающего и, в частности, для сортировки сперматозоидов в популяциях сперматозоидов, несущих Х-хромосомы, и/или популяциях сперматозоидов, несущих Y-хромосомы, с целью повышения вероятности того, что оплодотворение яйцеклетки отсортированной спермой приведет к рождению потомства необходимого пола. Например, владельцу молочной фермы может потребоваться отсортировать сперму быка с целью создания коровьего эмбриона путем искусственного осеменения, экстракорпорального оплодотворения или иным образом, используя сперму с Х-хромосомой, для получения дополнительного потомства женского рода у коров.

Методы проточной цитометрической сортировки сопряжены с некоторыми трудностями, в частности, это относится к сортировке сперматозоидов млекопитающего для дальнейшего использования при создании потомства. Важно отметить, что методы, используемые для метки и/или разграничения клеток, и/или методы, используемые для сортировки клеток, не должны негативно влиять на жизнеспособность клеток. Часто одна или несколько целей использования методов и/или систем (например, ускоренная сортировка, более высокая точность и т.д.) противоречат другим целям использования методов и/или систем. Необходимо сбалансировать и учесть различные факторы, включая температуру, изменения температуры, давление и/или изменения давления, которые влияют на клетки, жидкостную среду, воздействующую на клетки, силы, действующие на клетки, и продолжительность жизни клетки. Например, скорость, с которой флуоресцирующая молекула (например, флуорохром) входит в клетку для связи с ДНК в ядре клетки (т.е. скорость окрашивания клеток), может увеличиваться по мере роста температуры. Следовательно, производительность системы (по меньшей мере, производительность процесса окрашивания) может увеличиваться по мере роста температуры среды, в которой находится клетка. Тем не менее, повышенная температура может негативно сказаться на жизнеспособности клеток и/или продолжительности времени, в течение которого клетки остаются жизнеспособными. Напротив, поддержание клеток на оптимальном температурном уровне с целью обеспечения жизнеспособности может увеличить время, необходимое для окрашивания (и для измерения и сортировки) клеток, таким образом, для реализации процесса потребуется больше времени, чем это целесообразно с практической точки зрения, или, в результате, по истечении времени, необходимого для завершения процесса, клетки станут нежизнеспособными.

Другая трудность, сопряженная с сортировкой клеток, связана с физическими и оптическими свойствами клеток. В частности, сплющенные или другие ассиметричные клетки такие, как эритроциты или сперматозоиды млекопитающих, обеспечивают анизотропное излучение энергии (например, свет). Сложная геометрическая форма внутренней части клетки и/или сложная геометрическая форма границ клетки способствует преломлению и/или отражению света такими путями, которые в значительной мере зависят от ориентации клетки по отношению к любым источникам света и/или детекторам, используемым для различения клеток. К примеру, проточная цитометрическая сортировка сперматозоидов млекопитающего в популяциях с Х- или Y-хромосомами обычно включает окрашивание клеток с флуоресцирующей молекулой, которая связывается с ДНК внутри клеток. Варьирование содержания ДНК между Х- и Y-хромосомами большинства видов млекопитающих (Y-хромосомы, как правило, содержат меньше ДНК, чем Х-хромосомы) приводит к относительно большей флуоресценции со стороны клеток с Х-хромосомами. Однако разница в содержании ДНК Х- и Y-хромосом обычно составляет порядка нескольких процентов и часто геометрическая форма и/или ориентация клетки может повлиять на обнаруженную флуоресценцию в процентном соотношении, которое существенно превышает процентную разницу в содержании ДНК в Х- и Y-хромосомах. Кроме того, такой анализ требует, чтобы клетки проходили через область обнаружения по отдельности таким образом, чтобы детектор не истолковывал флуоресценцию со стороны двух клеток, как флуоресценцию со стороны одной клетки.

В системах проточной цитометрической сортировки часто используется струйный механизм «ядро в оболочке» для переноса клеток через область обнаружения. Как показано на фиг.1C, относительно медленно движущийся поток 50 водной суспензии клеток 52 вливается в относительно быстро движущуюся струю проточной жидкости 54. Такая схема позволяет собрать клетки 52 в поток 56, который называется «ядерным» потоком. При соответствующем выборе давления и образующейся в результате скорости ядерной суспензии и проточной жидкости «ядерный» поток сужается под действием гидродинамических сил, вызванных проточной струей, и клетки в «ядерном» потоке распределяются в продольном направлении таким образом, чтобы обеспечить их перенос в струе по очереди. Силы, которые удлиняют и сужают «ядерный» поток, позволяют ориентировать клетки 52 таким образом, чтобы продольная ось 58 клетки 52 была параллельна направлению струи 56, в которой клетки движутся по одной. Однако ориентация клеток по отношению к продольной оси 58 остается более или менее произвольной. Таким образом, при прохождении каждой клеткой зоны обнаружения свет, падающий на клетку, свет, излучаемый от клетки (например, флуоресцентное излучение), и свет, отражаемый от клетки, по-прежнему зависит от ориентации клетки 52. Это особенно справедливо для многих типов сперматозоидов млекопитающих.

Существует несколько решений проблемы ориентации сперматозоида, связанной с освещением и обнаружением клеток в проточных цитометрических системах. Например, на фиг.1D представлено одно решение, в котором используется срезанный, скошенный наконечник 60 на трубке 62 для вливания пробного потока 64 в проточную струю 66. Срезанный, скошенный наконечник 60 помогает направлять клетки по отношению к их продольным осям 58 внутри проточной струи 66, выравнивая лицевые поверхности клеток в одном направлении. Другое решение (которое можно объединить с решением, предполагающим использование скошенного наконечника) предусматривает применение двух детекторов 68 и 70, перпендикулярных друг другу (детектор 68, расположенный под углом 0 градусов, и детектор 70, расположенный под углом 90 градусов), которые используются совместно для определения ориентации каждой клетки 52 при прохождении ею зоны обнаружения 72, а также для измерения уровня флуоресценции соответствующим образом ориентированных клеток таким образом, чтобы обеспечить квантование флуоресцирующего сигнала. Решения, использующие гидродинамическую ориентацию клеток вокруг продольной оси, как правило, дают результат в популяциях, в которых необходимое выравнивание с целью измерения флуоресценции обеспечивается примерно для 70% или менее клеток в пробной струе, что снижает производительность аппаратуры и приводит к исключению неправильно направленных клеток.

Еще одно решение проблемы, связанной с геометрической формой и ориентацией клеток, подразумевает использование оптического обнаружения вдоль оси, вдоль которой струя «ядро в оболочке» переносит клетки. В одном таком решении используется оптика для эпи-освещения с целью освещения клетки и обнаружения света, излучаемого клеткой. Как показано на фиг.1Е, пробный поток 74, переносимый проточной струей 76, движется непосредственно к объективу микроскопа 78, исключая зависимость от ориентации клетки (например, сперматозоида 80) по отношению к продольной оси 82 клетки 80. Однако траектория движения клетки 80 к объективу 78 требует, чтобы клетка 80 немедленно изменила траекторию после прохождения через зону обнаружения 82 (т.е. фокальную точку 84 объектива 78). Система изменяет траекторию за счет поперечной струи 86 жидкости. После проведения анализа за счет схождения 88 поперечной струи жидкости 86, проточной струи 76 и потока жидкости 74 может возникнуть неопределенность в отношении расположения отдельных клеток. Такая неопределенность относительно расположения может привести к тому, что система не сможет выполнить сортировку клеток, поскольку местонахождение клетки 80 внутри сведенной в одну точку струи может стать непредсказуемым сразу после прохождения клетки через зону обнаружения 82.

Еще одно решение, представленное на фиг.1F, подразумевает использование одного или нескольких параболических отражателей 102 для равномерного освещения клеток и/или для радиального сбора света из клеток. В системе применяется сопло 104 для выпуска потока/струи 106 жидкости с отдельными клетками 92. Поток 106 движется через область обнаружения 94 и через отверстие 96 в параболическом отражателе 102. После прохождения области обнаружения в какой-то точке поток 106 разделяется на капли 90, которые могут быть электрически заряжены. После этого каждая капля 90 может быть отсортирована, например, путем изменения направления заряженной капли 90 и электрически заряженных пластин дефлектора 98 для смещения капель в одно или несколько приемных устройств 100. Проблема в том, что такая конфигурация «струя в воздухе» приводит к тому, что при выходе потока 106 из сопла 104 поток 106 (и клетки 92, находящиеся в потоке 106) подвергается падению давления. Внезапное изменение давления (и увеличенное давление внутри самого сопла) может негативно повлиять на жизнеспособность клетки 92 аналогично последующему влиянию на клетку 92 внутри приемного устройства 100. Следовательно, давление и скорость потока 106, выходящего из сопла 104, должны оставаться ниже любого порогового значения, при котором клетки 92 могут быть разрушены, что снижает производительность системы. Кроме того, движение капель 90 в атмосфере может потребовать установления ограничений по отношению к среде, включая чистоту воздуха в помещении (например, «чистое помещение») и контроль температуры.

Таким образом, даже при относительно улучшенном состоянии проточной цитометрии существует потребность в более эффективных, более чувствительных и более точных методах и средствах разделения и/или идентификации клеток.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описывается способ и прибор для обнаружения, выборочного изменения за счет функционального и/или физического изменения, и сбора нужных или ненужных клеток в популяции с помощью проточной цитометрии. Данный способ не основывается на использовании параболических отражателей или перпендикулярно расположенных детекторов для обнаружения и категоризации клеток, как в случае с распространенными методами и приборами цитометрической сортировки. Напротив, данный способ основан на использовании объектива, оптическая ось которого расположена соосно прохождению образца через зону обнаружения. Этот способ необязательно основывается на отклонении или разделении струйного потока клеток или на распределении клеток по разным принимающим сосудам или каналам, как и в случае с распространенными методами и приборами цитометрической сортировки.

Данный способ предполагает использование контролируемого источника энергии, такого как источник электромагнитного излучения, например лазер, для облучения нужных или ненужных клеток в популяции, которые были выявлены с помощью цитометрических методик обнаружения. Контролируемый источник энергии выборочно направляется на целевые клетки исходя из их измеренных свойств или характеристик, после их анализа в цитометре, в некоторых вариантах в течение одной секунды проведения анализа, тогда как клетки остаются в жидкостной струе устройства. Такие клетки можно функционально или физически изменить за счет переданной энергии. В зависимости от конкретного использования и конкретного варианта исполнения способов и приборов образующаяся популяция клеток может быть функционально или физически очищена от ненужных клеток или может быть преобразована таким образом, чтобы обеспечить последующее увеличение числа нужных клеток или удаление ненужных клеток. Описанные способы и приборы полезны в тех случаях, когда требуется увеличить или уменьшить количество клеток. В некоторых вариантах исполнения данный способ и/или прибор изменяет жидкость, содержащую нужные или ненужные клетки в популяции, которые были выявлены с помощью цитометрических методик обнаружения, и не может непосредственно изменять клетки. В таких вариантах исполнения способ действия данного метода и/или прибора может основываться на отклонении или разделении струйного потока клеток или на распределении клеток по разным принимающим сосудам или каналам.

Один аспект, связанный с описываемыми способами и приборами, включает их использование для увеличения числа, отбора, функционального изменения и уменьшения числа сперматозоидов в популяции на основе Х или Y половой хромосомы, содержащейся в клетках. Данные способы и приборы предполагают использование альтернативных проектов для струйной техники и оптических систем цитометра, включая, с одной стороны, прибор, в котором оптические измерительные элементы и/или изменяющий клетки источник энергии ориентированы/ориентирован перпендикулярно жидкостному потоку, а с другой стороны, прибор, в котором некоторые такие элементы могут также или в качестве альтернативы быть ориентированы по той же оси, что и жидкостный поток и/или под косыми углами по отношению к нему.

Данные способы и приборы проточной цитометрии предлагают новый способ и прибор для позитивно-негативного отбора клеток путем наблюдения за клетками и точной классификации каждой клетки независимо от ориентации клетки по отношению к ее самой длинной оси, а также посредством последующего использования классификации для того, чтобы определить, изменить, дериватизировать, разрушить, уничтожить или фрагментировать клетку в ходе цитометрии. Описываемые способы и приборы включают применение сил, энергии или облучения по отношению к нужным или ненужным клеткам одновременно или в течение одной секунды после цитометрического измерения с целью внесения изменений в те клетки, которые изменяют их в физическом или функциональном плане. Такие измененные клетки или их остатки или производные, с одной стороны, сохраняются в образующемся составе или, с другой стороны, добавляются или удаляются в зависимости от требований при определенном использовании или применении.

Здесь дано описание варианта исполнения, позволяющего на функциональном и/или физическом уровне отделять спермии с Х-хромосомами от спермиев с Y-хромосомами и/или спермии с Y-хромосомами от спермиев с Х-хромосомами. В данном исполнении относительное содержание ДНК в отдельных спермиях в популяции спермиев косвенно измеряется с помощью хорошо известного свойства химических веществ, связывающихся с ДНК, таких как бисбензимид, красители SYBR, например SYBR-14, Хехст 33342, Хехст 33258, бромид этидия, акридиновый оранжевый, DAPI, хромомицин, митрамицин, оливомицин, и других химических веществ, известных в данной отрасли, которые при присоединении к ДНК обеспечивают повышенный уровень флуоресценции. Измерение производится путем наблюдения за клеткой по мере ее перемещения внутри потока, движущегося к точке наблюдения, желательно с помощью объектива, оптическая ось которого расположена соосно движению потока. Предполагается, что клетки с относительно большим количеством ДНК (т.е. более высокое содержание ДНК) содержат большую Х-хромосому, а клетки с относительно меньшим количеством ДНК (т.е. более низкое содержание ДНК) содержат меньшую Y-хромосому. В некоторых вариантах исполнения способа, когда в конечном составе должны быть клетки только с одной из половых хромосом, данный способ предполагает направление лазерного источника энергии на клетки одновременно или в течение одной секунды, или менее, проведения анализа, когда лазерный источник энергии можно быстро смоделировать для облучения клеток, содержащих ненужную половую хромосому, и/или клеток, половая хромосома которых не определена. Один вариант исполнения предполагает использование в данном способе лазерного источника энергии, выделяющего энергию достаточного качества и/или в достаточном объеме для изменения, дериватизации, разрушения, деактивации и/или уничтожения ненужных клеток. Такие изменения в отобранных клетках, с одной стороны, включают фрагментирование клеток или, с другой стороны, являются менее разрушительными в зависимости от применения. Например, в тех вариантах исполнения способа, когда для оплодотворения и/или размножения используется идентифицированная и/или выявленная сперма, для того чтобы получить нужный состав, достаточно лишить ненужные клетки возможности воспроизводить жизнеспособное потомство, например, в результате разрушения последовательности или структуры молекул ДНК в клетках или в результате уменьшения их подвижности таким образом, чтобы при искусственном осеменении они в большинстве своем были бесплодны. В других вариантах ненужные клетки становятся неподвижными, уничтожаются, изменяются или инактивируются каким-либо другим способом с целью воздействия на репродуктивную способность ненужных клеток. В альтернативном варианте ненужные клетки изменяются или дериватизируются таким образом, чтобы в последующем их можно было удалить или частично удалить из состава, включающего нужные клетки.

В другом варианте исполнения в конфигурации цитометра применяется один или несколько оптических элементов, с одной стороны, для измерения клеточных свойств и/или, с другой стороны, для использования с целью подачи энергии в клетки, когда хотя бы один оптический элемент, желательно оптическая ось объектива, ориентирован по отношению к той же оси, что и струя с анализируемыми клетками. Таким образом, в некоторых вариантах исполнения представлен способ и прибор, которые для освещения, измерения или подачи энергии в клетки используют оптический элемент и, в частности, объектив, расположенный соосно струе жидкости. В другом исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных под углом 90 градусов по отношению к потоку жидкости. В еще одном исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных несоосно потоку жидкости. И еще в одном исполнении представлен способ и прибор, которые для измерения или подачи энергии в клетки по отдельности или совместно используют один или несколько дополнительных оптических элементов, расположенных под косым углом по отношению к потоку жидкости. В настоящем документе «косой угол» означает острый или тупой угол, не являющийся прямым углом или кратным прямому углу.

Некоторые варианты исполнения предлагают способ для изменения целевой клетки в популяции клеток, включая направление на целевую клетку контролируемого источника энергии, который изменяет целевую клетку после идентификации клетки как целевой клетки в популяции клеток, не отделяя целевую клетку от популяции клеток после изменения с помощью источника энергии.

Некоторые варианты исполнения предлагают способ для выявления субпопуляции целевых клеток в популяции клеток, включая направление на популяцию клеток контролируемого источника энергии, который изменяет клетки субпопуляции целевых клеток, при этом источник энергии направляется после первого анализа клеток в пробной жидкостной струе проточного цитометра, и не более чем через примерно одну секунду после первого анализа, при этом клетки остаются в пробной жидкостной струе проточного цитометра, и в ходе первого анализа клетки субпопуляции клеток идентифицируются как целевые клетки, по мере того, как такие целевые клетки движутся к зоне опроса, и при этом контролируемый источник энергии изменяет целевые клетки пробной струи посредством проточного цитометра.

В некоторых вариантах исполнения первый анализ включает обнаружение целевых клеток с нужным свойством, выбранным из группы со следующими необходимыми характеристиками: белковый состав, состав ДНК, маркер на поверхности клетки, размер молекулы, поглощение света, отражение света, флуоресценция, рассеяние света, поляризация, электрическое свойство, магнитное свойство, морфологическое свойство, проницаемость мембран, текучесть мембран и окислительно-восстановительное состояние.

В некоторых вариантах исполнения источник энергии направляется на популяцию клеток в момент прохождения популяции клеток через струйный поток в проточном цитометре. В соответствующем исполнении источник энергии направляется на целевую клетку после, и в течение одной секунды, идентификации клетки как целевой клетки в струйном потоке.

В некоторых вариантах исполнения предполагается, что источник энергии располагается соосно струйному потоку. Также предполагается, что источник энергии располагается под углом 90° по отношению к струйному потоку или под косым углом по отношению к струйному потоку. В другом исполнении источник энергии подается в целевые клетки с помощью оптики для освещения по Келеру и/или эпи-освещения. Еще в одном исполнении источник энергии направляется на точку в струе клеток, расположенную ниже места, в котором измеряются клеточные свойства. И еще в одном исполнении источник энергии направляется на точку в струе клеток, расположенную ниже места, где измеряются клеточные свойства, и которая расположена после отклонения или поворота струйного потока по отношению к исходному направлению струи.

В некоторых вариантах исполнения один или несколько анализов проводятся путем наблюдения за клеткой по мере ее перемещения внутри потока, движущегося к точке наблюдения, желательно с помощью объектива, оптическая ось которого расположена соосно движению потока. После прохождения через точку наблюдения в некоторых вариантах исполнения поток изменяет направление, тогда как порядок и/или месторасположения клеток в потоке по-прежнему поддаются определению. В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии может выборочно изменить одну или несколько клеток в соответствии с данными одного или нескольких анализов. В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии располагается соосно заново направленному потоку, тогда как в других вариантах исполнения контролируемый источник энергии располагается перпендикулярно или под косым углом по отношению к заново направленному потоку. В некоторых вариантах исполнения, которые необязательно включают контролируемый источник энергии, сопло может выталкивать поток, образующий капли, которые могут сортироваться с помощью общеизвестных средств (например, за счет контролируемого источника энергии для подачи электростатического заряда, за счет контроля давления в различных каналах потока жидкости и т.д.).

В некоторых соответствующих вариантах исполнения контролируемый источник энергии направляется на место расположения клетки в струйном потоке одним из способов, включающих непрерывный поток, импульсный поток, прерывистые циклы включения-выключения, периодическую фокусировку и расфокусировку источника энергии и прерывистое быстрое отклонение источника энергии к потоку.

В некоторых вариантах исполнения контролируемый источник энергии представляет собой электромагнитный источник. В некоторых вариантах исполнения источником энергии является лазер.

В некоторых вариантах исполнения способ изменения клеток выбирается из группы, включающей дериватизацию, уничтожение, разрушение, нарушение и фрагментирование целевых клеток.

Кроме того, целевая клетка идентифицируются как целевая клетка с помощью метки, которая обнаруживается с помощью электрических, магнитных, спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, флуоресцентных или других химических средств. В некоторых вариантах исполнения метка представляет собой добавление фотоактивируемого химического соединения или метки.

В соответствующем исполнении целевая клетка идентифицируется как клетка с нужным свойством, выбранным из группы со следующими необходимыми характеристиками: белковый состав, содержание белка, состав ДНК, содержание ДНК, маркер на поверхности клетки, размер молекулы, поглощение света, отражение света, флуоресценция, рассеяние света, поляризация, электрическое свойство, магнитное свойство, морфологическое свойство, проницаемость мембран, текучесть мембран и окислительно-восстановительное состояние.

Описываемые способы и приборы предполагают, что любой источник энергии, детектор или фокусирующий элемент, используемый при выявлении свойств клеток в струе, может располагаться соосно струйному потоку. Например, в проточном цитометре, состоящем из детекторов или контролируемого источника энергии, либо детекторы, либо контролируемый источник энергии, либо и то и другое, располагаются соосно струйному потоку. В соответствующем исполнении любое устройство обнаружения и/или оптические элементы, используемые при выявлении свойств клеток в струе, располагаются соосно струйному потоку.

В другом исполнении для подачи света или энергии, необходимой для выявления нужных свойств, используется оптика для освещения по Келеру и/или эпи-освещения. В соответствующем исполнении, когда способ предполагает использование проточного цитометра, проточный цитометр представляет собой цитометр для эпи-освещения. Также предполагается, что цитометр для эпи-освещения, используемый в описываемом способе, включает прибор для изменения целевых клеток, о чем будет сказано ниже.

При использовании в описываемом способе проточного цитометра проточный цитометр представляет собой цитометр с одним или несколькими пробными потоками, который включает оптику с объективом, расположенным соосно течению одного или нескольких пробных потоков для подачи света или энергии, необходимой для выявления нужных свойств, с целью выявления нужных свойств клеток и/или для подачи света или энергии, необходимой для изменения нужных или ненужных клеток.

В другом исполнении источник энергии изменяет целевую клетку с нужным свойством. В соответствующем исполнении источник энергии изменяет целевую клетку, не обладающую нужным свойством.

Еще в одном варианте исполнения целевой клеткой является сперматозоид, отобранный из группы сперматозоидов, несущих Х-хромосому, и сперматозоидов, несущих Y-хромосому. В некоторых вариантах исполнения предполагается, что сперматозоид идентифицируется как целевая клетка на основании нужного различия в содержании ДНК между сперматозоидами, несущими Х-хромосому, и сперматозоидами, несущими Y-хромосому.

Описываемые способы и приборы также обеспечивают сбор популяции клеток в сборную камеру для дальнейшего использования. В некоторых исполнениях сборная камера содержит целевые клетки, измененные контролируемым источником энергии, и клетки, не измененные контролируемым источником энергии. В соответствующем исполнении после сбора целевые клетки могут использоваться при реализации последующих процессов и процедур. В еще одном исполнении предполагается, что после сбора целевые клетки исключаются, и оставшиеся в популяции клетки используются при реализации последующих процессов или процедур.

Описываемые способы и приборы также предполагают использование прибора для изменения целевой клетки в популяции клеток, включающего контролируемый источник энергии, изменяющий целевую клетку после идентификации клетки как целевой клетки в популяции клеток, не отделяя целевую клетку от популяции клеток после изменения с помощью источника энергии.

В соответствующем варианте исполнения описываемые способы и приборы предполагают выявление субпопуляции целевых клеток в популяции клеток с помощью проточного цитометра, включающего контролируемый источник энергии, который изменяет субпопуляцию целевых клеток, при этом источник энергии направляется после первого анализа клеток во время прохождения пробы через типовую трубку проточного цитометра, и, как правило, в течение одной секунды анализа клетки, тогда как клетки остаются в пробной жидкостной струе прибора, при этом в ходе первого анализа клетка идентифицируется как целевая клетка, и при этом контролируемый источник энергии изменяет целевую клетку при прохождении пробы через проточный цитометр.

В некоторых вариантах исполнения один или несколько предусмотренных данным способом этапов хранятся в виде машиночитаемых инструкций на материальных носителях в контроллере. Процессор контроллера выполняет инструкции с целью мониторинга и/или контроля различных аспектов сортировочного проточного цитометра. Данные инструкции могут включать одну или несколько операций, адаптированных для выполнения разных задач в цитометре.

В некоторых дополнительных вариантах исполнения оптическая ячейка, кювета, окно, расходомерная трубка, стенка, край или другая часть сортировочного проточного цитометра изготовлены из материала с коэффициентом преломления от 1,30 до 1,40 включительно. В этих и других вариантах исполнения решение, включающее определяемое при анализе вещество, может быть скорректировано таким образом, чтобы коэффициент преломления в данном решении был близок к коэффициенту преломления оптической ячейки, кюв