Способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала

Способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к способам восстановления области утраченного зуба и способам изготовления восстановительного материала.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Зуб представляет собой орган, состоящий из: эмали в крайнем наружном слое и дентина во внутреннем слое, которые относятся к твердым тканям; одонтобластов, образующих дентин и находящихся внутри слоя дентина; пульпы зуба, заполняющей центральное пространство. Зубы могут утрачиваться вследствие кариеса зубов, пародонтита и подобных заболеваний. С учетом большого значения наличия или отсутствия зубов для внешнего вида и для восприятия вкуса, а также в целях сохранения здоровья и высокого качества жизни были разработаны различные методики восстановления зубов.

[0003] Так, в публикации в J. Dent. Res. (2002, Vol.81 (10), pp.695-700) описана регенерация зубоподобной ткани в результате внутрибрюшинной трансплантации мыши клеток с биоразлагаемым носителем, в частности эпителиальных или мезенхимальных клеток, выделенных из зубного зачатка.

Другой пример: в японской опубликованной заявке на изобретение (JP-A) №2004-331557 предлагается способ регенерации зубного зачатка, в котором клетки зубного зачатка, выделенные из живого организма, выращивают в присутствии физиологически активного вещества, например фактора роста фибробластов. В еще одном патентном документе, JP 2004-357567 А, предлагается способ, предусматривающий, что клетки, по меньшей мере, одного типа, выделенные из клеток зубного зачатка в живом организме, и клетки, способные к дифференцировке с образованием этого типа, выращивают вместе на носителе, содержащем фибрин. При этом носитель позволяет придать формируемому зубному зачатку нужную форму, образуя таким образом «зуб» с уникальной морфологией.

[0004] В WO 2006/129672 описана методика, согласно которой эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки, полученные из зубного зачатка, преобразуют в клеточные массы, которые затем помещают в коллагеновый гель, приводя их в тесный контакт друг с другом, и выращивают в этих условиях, создавая таким образом зуб, обладающий уникальным расположением клеток.

[0005] С другой стороны, в документе WO 2003/101503 описан способ, в котором для регенерации зубного зачатка клетки зубного зачатка и клетки, способные к дифференцировке с образованием соответствующего типа, выращивают с механическим стимулированием, а также способ терапии, в котором регенерированный таким образом зубной зачаток трансплантируют в челюстную кость пациента с утраченным или поврежденным зубным зачатком.

Помимо этого в документе JP 2005-013261 А описан искусственный биоматериал с частицами коллоидной окиси кремния, прикрепленными к его поверхности, используемый как имплантационный материал, который внедряют в живой организм.

[0006] Было отмечено, однако, что внедрение винтообразного имплантата из таких материалов, как титан, в современной имплантационной терапии подавляет рост челюстной кости в период роста челюсти и делает невозможным перемещение зуба, что является нежелательным. Кроме того, хотя от регенерированного зуба для обеспечения тех же функций, что и у обычного зуба, требуется такая же нормальная окклюзия, в вышеупомянутых методиках с использованием клеток, выделенных из живого организма, достижение такой окклюзии не было в достаточной степени подтверждено. Следует также учитывать, что нервы периодонтальной связки обладают чувствительностью к повреждающим стимулам в зубах (например, к сжатию), что биологически важно с точки зрения восприятия, например, ощущений от еды. Чтобы регенерированный зуб обладал теми же функциями, что и обычный зуб, необходимо восстановить область утраченного зуба до такой степени, чтобы регенерированный зуб обеспечивал нормальную окклюзию с твердостью, равноценной твердости обычного зуба, и включал в себя нервы, обеспечивающие нормальную чувствительность к стимулам, воздействующим на зуб.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ УКАЗАННЫХ ПРОБЛЕМ

[0007] Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ изготовления восстановительного материала для восстановления области утраченного зуба, который обеспечит регенерированному зубу твердость, равноценную твердости обычного зуба, что позволит добиться нормальной окклюзии, и чувствительность к стимулам, равноценную чувствительности обычного зуба; и способ восстановления области утраченного зуба.

[0008] Настоящее изобретение предлагает способ изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, и способ восстановления области утраченного зуба.

Первый аспект настоящего изобретения предусматривает способ изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, включающий этапы:

помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;

выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба и определяют ориентацию зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта и

используют зубной зачаток или зуб, ориентация которого была определена, в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба.

[0009] Второй аспект настоящего изобретения предусматривает способ восстановления области утраченного зуба в полости рта, включающий этапы:

помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка, и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом, без смешивания;

выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба и внедряют зачаток восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба в область утраченного зуба.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0010] На Фиг.1А представлены фотографии внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа), которые были сняты под углом 45° относительно места трансплантации в верхней челюсти.

На Фиг.1В представлены фотографии внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа), которые были сняты в вертикальном направлении относительно места трансплантации в верхней челюсти.

На Фиг.1C представлены фотографии окклюзии зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).

На Фиг.1D представлены КТ-изображения внешнего вида зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).

На Фиг.1Е представлены КТ-изображения в разрезе (Е) зуба примера 2 настоящего изобретения, снятые в период экструзии (слева), в период от экструзии до окклюзии (в центре) и в период после окклюзии (справа).

На Фиг.2А представлен график твердости по Кнупу для эмали зуба после экструзии в примере 2 настоящего изобретения.

На Фиг.2В представлен график твердости по Кнупу для дентина зуба после экструзии в примере 2 настоящего изобретения.

На Фиг.3 представлено окрашенное гематоксилином и эозином изображение регенерированного зуба примера 2 настоящего изобретения непосредственно перед экструзией (при увеличении ×20).

На Фиг.4А представлено окрашенное гематоксилином и эозином изображение, подтверждающее явление костной перестройки в кости у периодонтальной связки (В: сторона сжатия, С: сторона растяжения), которая происходила при приложении ортодонтической силы в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×20).

На Фиг.4В представлен увеличенный вид стороны сжатия (зона В в черной рамке) на Фиг.4А (при увеличении ×200).

На Фиг.4С представлен увеличенный вид стороны растяжения (зона С в черной рамке) на Фиг.4А (при увеличении ×200). На Фиг.5А представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой в отсутствие ортодонтического воздействия в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×100).

На Фиг.5В представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой через 2 часа после применения ортодонтического воздействия в примере 2 настоящего изобретения (при увеличении ×100).

На Фиг.5С представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемой спустя 48 часов после применения ортодонтического воздействия (при увеличении ×100).

На Фиг.5D представлено иммуноокрашенное изображение экспрессии белка c-Fos в продолговатом мозге, наблюдаемое через 2 часа после вскрытия пульпы зуба (при увеличении ×100).

ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Предусматриваемый настоящим изобретением способ изготовления восстановительного материала относится к способам изготовления материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта, и включает этапы:

помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;

выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба (этот этап обозначается ниже как «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба») и

определяют ориентацию зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта (этот этап обозначается ниже как «этап определения ориентации»);

используют зубной зачаток или зуб, ориентация которого была определена, в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба.

[0012] Кроме того, предусматриваемый настоящим изобретением способ восстановления области утраченного зуба относится к способам восстановления области утраченного зуба в полости рта и включает этапы:

помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и первую и вторую клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания;

выращивают первую и вторую клеточные массы с формированием зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба (этот этап обозначается ниже как «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба»); и

внедряют зачаток восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба в область утраченного зуба (этот этап обозначается ниже как «этап внедрения»).

[0013] Согласно настоящему изобретению способ изготовления восстановительного материала и способ восстановления области утраченного зуба предусматривают использование в качестве восстановительного материала, внедряемого в область утраченного зуба, зачатка восстанавливаемого зуба или целого восстанавливаемого зуба, которые будут получены на этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба помещением первой клеточной массы и второй клеточной массы на носитель, причем первая и вторая клеточные массы находятся в тесном контакте друг с другом без смешивания. Посредством того, что в область утраченного зуба в качестве восстановительного материала будет внедрен зачаток восстанавливаемого зуба или целый восстанавливаемый зуб, из области внедрения экструдируется эквивалент зуба, приобретший такие длину и твердость, которые обеспечивают окклюзию с зубом-антагонистом, причем в эквивалент зуба могут врастать нервы. В итоге эквивалент зуба может иметь твердость, равноценную твердости обычного зуба, то есть такую же, как у окружающих зубов, может обеспечивать нормальную окклюзию и обладать чувствительностью к стимулам, равноценной чувствительности обычного зуба.

[0014] В настоящем изобретении термин «эквивалент зуба» и подобные ему обозначают зуб, имеющий такие длину и твердость, которые делают возможной окклюзию с зубом-антагонистом после экструзии из области утраченного зуба, в которую был внедрен указанный эквивалент.

В настоящем изобретении выражение «этап формирования зачатка восстанавливаемого зуба» относится как к способу изготовления восстановительного материала, так и к способу восстановления области утраченного зуба.

Далее, слово «этап», используемое в данном документе, подразумевает не только отдельный этап, но и другие этапы, которые не могут быть отчетливо от него отделены и служат достижению ожидаемого эффекта рассматриваемого этапа.

Кроме того, диапазоны, обозначаемые с помощью предлогов «от» и «до», включают в себя также граничные числовые значения, указанные непосредственно после данных предлогов.

Ниже следует описание изобретения.

[0015] В настоящем изобретении термином «зуб» обозначается непрерывная ткань, включающая внутренний слой дентина и наружный слой эмали и обладающая ориентацией, за счет выделения коронки и корня. Ориентация зуба может определяться взаимным расположением его коронки и его корня. Разграничение коронки и корня может подтверждаться визуально на основании их формы, гистологического окрашивания и т.п. Коронка - это часть, в которой присутствуют слои эмали и дентина, тогда как в корне слой эмали отсутствует.

[0016] Специалисты в данной области могут легко распознать дентин и эмаль морфологически путем гистологического окрашивания или аналогичными методами. Эмаль может быть также определена по наличию амелобластов, которое может подтверждаться наличием/отсутствием амелогенина. С другой стороны, дентин может быть определен по наличию одонтобластов, которое может подтверждаться наличием/отсутствием сиалопротеина дентина. Наличие амелогенина и сиалопротеина дентина может быть легко подтверждено известным в данной области способом, например гибридизацией in situ и иммуноокрашиванием антителами и т.п. И, наконец, ориентация зуба может быть определена по расположению коронки и корня. Разграничение коронки и корня может подтверждаться визуально на основе их формы, гистологического окрашивания и т.п.

[0017] В настоящем изобретении термины «зубной зачаток» и «зубная колба» используются для точных обозначений, соответствующих определенным стадиям развития. В данном случае «зубной зачаток» обозначает образование на ранней стадии развития зуба, которое в будущем превратится в зуб и развитие которого включает стадию колбы и стадию «колокола» в соответствии с обычной периодизацией развития зуба и, в частности, предполагает наличие ткани в таком состоянии, в котором не наблюдается аккумуляция дентина и эмали, являющихся характерными составляющими твердых тканей зуба. С другой стороны, «зубная колба» предполагает наличие определенной ткани на переходном этапе от «зубного зачатка» в том смысле, в каком этот термин используется в настоящем изобретении, то есть обозначает стадию, на которой начинается аккумуляция дентина и эмали, характерных для твердых тканей зуба, и предшествующую прорастанию зуба из десны, при котором создаются предпосылки для выполнения типичных функций зуба. Развиваясь из зубного зачатка, зуб проходит стадию колбы, стадию «чаши», раннюю стадию «колокола» и позднюю стадию «колокола». На стадии колбы эпителиальные клетки впячиваются, образуя оболочку вокруг мезенхимальных клеток, и на ранней и поздней стадиях «колокола» эпителиальная часть превращается в наружную эмаль, а из мезенхимальной части начинает формироваться внутренний дентин. Так в результате межклеточного взаимодействия из зубного зачатка между эпителиальными и мезенхимальными клетками формируется зуб.

[0018] В настоящем изобретении термин «мезенхимальная клетка» обозначает клетку, происходящую из мезенхимальной ткани, и «эпителиальная клетка» обозначает клетку, происходящую из эпителиальной ткани. Ниже в настоящем изобретении термин «пародонт» обозначает альвеолярный отросток и периодонтальную связку, образованную преимущественно в наружном слое зуба. Специалисты в данной области могут легко распознать альвеолярный отросток и периодонтальную связку морфологически путем гистологического окрашивания или аналогичными методами.

[0019] На этапе формирования зачатка восстанавливаемого зуба согласно настоящему изобретению помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками или клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой или другими клетками из мезенхимальных клеток, при этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка, причем первая и вторая клеточные массы находятся в тесном контакте друг с другом без смешивания; после этого первую и вторую клеточные массы выращивают в качестве клеточной культуры с формированием зачатка восстанавливаемого зуба.

Что касается этапа формирования зачатка восстанавливаемого зуба, то соответствующий способ, описанный в документе WO 2006/129672, может применяться в исходном виде без изменений.

[0020] Как первую клеточную массу, так и вторую клеточную массу формируют либо исключительно из мезенхимальных клеток, либо исключительно из эпителиальных клеток, и каждая из этих клеточных масс состоит по существу из клеток одного из этих типов. Термин «клеточная масса» обозначает плотное образование, состоящее из клеток, а клетки могут находиться либо в состоянии ткани, либо в состоянии массы (агрегата), приготовленной из одиночных клеток. Выражение «состоит по существу» обозначает минимально возможное включение веществ, отличных от представляющих интерес клеток. Количество клеток, составляющих каждую клеточную массу, различается в зависимости от вида животных, а также от типа, жесткости и размера носителя и может составлять в общем случае от 10¹ до 10⁸ клеток, предпочтительно от 10³ до 10⁸ клеток на одну клеточную массу.

[0021] Что касается мезенхимальных клеток и эпителиальных клеток, используемых в настоящем изобретении, по меньшей мере, клетки одного из этих двух типов могут быть получены из зубного зачатка, благодаря чему они способны воспроизводить расположение клеток в живом организме и эффективно формировать зуб, обладающий специфической структурой и ориентацией. Для большей надежности в формировании зуба как мезенхимальные, так и эпителиальные клетки предпочтительно должны быть получены из зубного зачатка (или зубных зачатков). Зубной зачаток берут предпочтительно на стадии колбы или на стадии «чаши», чтобы клетки были незрелыми и гомогенными с точки зрения их дифференцировки.

[0022] Мезенхимальные клетки, выделяемые из источника, отличного от зубного зачатка, могут быть взяты из других мезенхимальных тканей живого организма и представлять собой, например, предпочтительно клетки костного мозга, не содержащие клеток крови, и мезенхимальные стволовые клетки, более предпочтительно - мезенхимальные клетки из полости рта, клетки костного мозга из челюстной кости, мезенхимальные клетки, отобранные из клеток краниального нервного гребня, мезенхимальные клетки-предшественники, которые могут производить мезенхимальные клетки, и их стволовые клетки.

Эпителиальные клетки, выделяемые из источника, отличного от зубного зачатка, могут быть взяты из других эпителиальных тканей живого организма и представлять собой, например, предпочтительно эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки полости рта и десен, более предпочтительно - незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые при дифференцировке могут, например, подвергаться кератическим или паракератическим изменениям, образуя эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки и подобные им. Примерами таких незрелых эпителиальных клеток-предшественников служат некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки.

[0023] Зубной зачаток и другие ткани могут быть выделены в челюстной кости и подобных источниках у различных животных, например у приматов (людей, обезьян), копытных животных (свиней, коров, лошадей), то есть у млекопитающих; у грызунов (мышей, крыс, кроликов), то есть у мелких млекопитающих; у собак, кошек и т.п. Для отбора зубного зачатка и ткани могут быть без изменений применены условия, обычно используемые для отбора тканей; зубной зачаток или ткань следует выделять в стерильных условиях и хранить в подходящем месте. В качестве зубного зачатка человека может быть использован, например, зубной зачаток третьего моляра, называемого также зубом мудрости, или же зубной зачаток эмбриона, но с точки зрения использования аутогенных тканей использование зубного зачатка зуба мудрости предпочтительно. Если используется зубной зачаток от мыши, его берут предпочтительно на 10-16 день развития эмбриона.

[0024] Подготовку мезенхимальных и эпителиальных клеток из этого зубного зачатка выполняют, разделяя зубной зачаток, выделенный из окружающей его ткани, на мезенхимальную ткань и эпителиальную ткань на основе их формы. В этой процедуре для упрощения выделения тканей могут использоваться ферменты. Примерами ферментов, используемых для такой цели, служат диспаза, коллагеназа и трипсин.

[0025] Мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки могут быть приготовлены в виде одиночных клеток соответственно из мезенхимальной ткани и из эпителиальной ткани. Чтобы облегчить диспергирование ткани на одиночные клетки, могут применяться такие ферменты, как диспаза, коллагеназа и трипсин.

[0026] В качестве среды для выращивания могут использоваться среды, обычно используемые для выращивания животных клеток, например среда Игла в модификации Дульбекко СИМД (DMEM), к которым для усиления пролиферации клеток может быть добавлена сыворотка, или, в качестве альтернативы, клеточный фактор роста, например фибробластный ФФР (FGF), эпидермальный ЭФР (EGF) или тромбоцитарный ТФР (PDGF), или же известные компоненты сыворотки, например трансферрин. В том случае, если добавляется сыворотка, концентрация может быть соответствующим образом изменена в зависимости от условий выращивания и обычно может составлять 10% от объема. При выращивании клеток могут создаваться обычные в этих случаях условия, например такие, которые используются для выращивания клеток в инкубаторах, - 37°С и 5% СO₂. При необходимости можно также добавлять антибиотики, например стрептомицин.

[0027] Согласно настоящему изобретению может быть использован носитель, пригодный для выращивания клеток и предпочтительно представляющий собой смесь с указанной выше средой. Примерами такого носителя служат коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, эластин, фибрин, фибронектин, ламинин, внеклеточные матриксы смешанного состава, полигликолевая кислота ПГК (PGA), полимолочная кислота ПМК (PLA), сополимеры молочной и гликолевой кислот СМГК (PLGA), «Cellmatrix» (торговое наименование, производитель Nitta Gelatin Inc.), «Mebiol Gel» (торговое наименование, производитель Ikeda Scientific Co., Ltd.) и «Matrigel» (торговое наименование, производитель, Beckton, Dickinson and Company), которые также могут применяться в сочетаниях. Эти носители могут обладать достаточной жесткостью для того, чтобы клетки эффективно удерживались в тех местах, где они были помещены на носитель, который может пребывать в форме геля, волокон или твердого тела. С точки зрения облегчения обеспечения требуемой жесткости, а также удерживающей способности из перечисленных носителей предпочтительными являются коллаген, агарозный гель, карбоксиметилцеллюлоза, желатин, агар, гидрогель, «Cellmatrix», «Mebiol Gel», «Matrigel», внеклеточные матриксы смешанного состава, эластин, фибрин, фибронектин и ламинин и их сочетания; наиболее предпочтительны из них коллаген, фибрин, фибронектин, ламинин, внеклеточные матриксы смешанного состава, «Cellmatrix», «Mebiol Gel», «Matrigel» и их сочетания. Эти носители обеспечивают хорошее межклеточное взаимодействие между мезенхимальными и эпителиальными клетками внутри соответствующих клеточных масс и хорошее взаимодействие между клеточными массами. При этом за уровень жесткости, который позволяет удерживать клетки на их местах, может быть принята жесткость, которая обычно применяется в трехмерных культурах, то есть жесткость, обеспечивающая сохранение положения клеток и не препятствующая в то же время их гипертрофии вследствие роста. Такая величина жесткости может быть легко определена.

При этом носители могут иметь толщину, не препятствующую росту внутри них первой и второй клеточных масс, и эта толщина может быть задана в соответствии с размерами данной ткани и подобными параметрами.

[0028] Кроме того, носитель может обладать такой удерживающей способностью, которая позволяет сохранять контактное состояние клеток, не допуская их диспергирования. В данном документе термин «контактное состояние» обозначает плотное (обладающее высокой плотностью) состояние, которое обеспечивает межклеточное взаимодействие внутри каждой клеточной массы и между клеточными массами, причем благодаря состоянию высокой плотности, в котором находится агрегат клеток, оказывается возможным выращивать клетки с такой удерживающей способностью, которая, например, обеспечивает контактное состояние, более сильное, чем простое прикосновение клеток. Например, при использовании коллагена соответствующая жесткость обеспечивается при конечной концентрации от 2 до 3 мг/мл, то есть при концентрации, которая имеет прочность студня от 120 до 250 г, измеренную согласно стандарту JIS-К6503-1996 (как нагрузка, необходимая для сжатия на 4 мм с помощью штока диаметром 12,7 мм). Эта величина прочности студня не является ограничительной, и в качестве носителя по настоящему изобретению могут предпочтительно использоваться и другие типы носителей, если они имеют ту же прочность, определяемую тем же методом измерения. Кроме того, носитель с жесткостью, соответствующей желаемой прочности студня, может быть получен смешиванием одного или более различных носителей.

[0029] Состояние высокой плотности подразумевает такую плотность, которая почти эквивалентна плотности формирования ткани, например в случае клеточных масс она составляет от 5×10⁷ до 1×10⁹ клеток/мл при помещении клеток на носитель, предпочтительно от 1×10⁸ до 1×10⁹ клеток/мл, что необходимо для межклеточного взаимодействия без отрицательного воздействия на деятельность клеток, и наиболее предпочтительно - от 2×10⁸ до 8×10⁸ клеток/мл. Чтобы приготовить клеточную массу с такой плотностью клеток, предпочтительно уплотнять и осаждать клетки центрифугированием, поскольку именно таким образом удается достичь высокой плотности без отрицательного воздействия на деятельность клеток. Центрифугирование может выполняться со скоростью вращения, которая соответствует центробежной силе от 300 g до 1200 g, не воздействующей неблагоприятно на выживание клеток, предпочтительно от 500 g до 1000 g, в течение от 3 до 10 минут. Центрифугирование с силой ниже 300 g может создать недостаточное осаждение клеток, и плотность клеток тогда окажется слишком низкой, тогда как центрифугирование с силой выше 1200 g может вызвать повреждение клеток, поэтому оба этих случая не отнесены к предпочтительным.

[0030] В тех случаях, когда высокая плотность клеток обеспечивается центрифугированием, этот процесс обычно выполняют, приготовив суспензию одиночных клеток в контейнере, например пробирке, используемой для центрифугирования клеток, и надосадочную жидкость удаляют как можно более тщательно, оставляя осадок, состоящий из клеток.

В тех случаях, когда осадок подготавливается центрифугированием, его можно поместить непосредственно внутрь носителя. При этом объем иных компонентов, отличных от подготавливаемых клеток (например, среда культуры, буферный раствор, носитель и т.п.), предпочтительно не должен превышать объем клеток и наиболее предпочтительно, чтобы иные компоненты, отличные от подготавливаемых клеток, отсутствовали. В клеточной массе такой высокой плотности клетки находятся в тесном контакте друг с другом, что позволяет эффективно осуществлять межклеточное взаимодействие. В тех случаях, когда клеточную массу с очень низким содержанием компонентов, отличных от подготавливаемых клеток, помещают внутрь носителя, клетки особенно сильно уплотняются благодаря отверждению носителя и аналогичным процессам, создавая состояние, в котором клетки располагаются очень плотно.

[0031] Чем ближе контакт между первой клеточной массой и второй клеточной массой, тем лучше; особенно предпочтительно, чтобы вторая клеточная масса упиралась в первую клеточную массу. Кроме того, чтобы обеспечить еще более тесный контакт между клеточными массами, эффективным будет покрытие первой клеточной массы и второй клеточной массы твердой оболочкой, проницаемой для среды культуры и кислорода. Предпочтительно также при помещении суспензии клеток высокой плотности в раствор использовать раствор, отличающийся от суспензии по вязкости, который вслед за этим может отвердеть, не претерпевая изменений, что позволит сохранить состояние контакта для клеток. В тех случаях, когда первая клеточная масса представляет собой массу мезенхимальных клеток одиночных зубных зачатков, а вторая клеточная масса представляет собой эпителиальную ткань зубного зачатка, предпочтительно поместить эмалевый узелок эпителиальной ткани зубного зачатка так, чтобы он соприкасался с первой клеточной массой, но настоящее изобретение не ограничивается таким подходом.

[0032] Если применяется носитель в форме геля, раствора или подобной форме, помещение клеток на носитель может предусматривать последующий этап отверждения носителя. Для отверждения носителя могут применяться условия, используемые для отверждения носителя в общем случае, без каких-либо изменений. Так, если в качестве носителя используется способный к отверждению состав, например коллаген, отверждение может быть достигнуто при обычно используемых условиях, например при выдерживании при температуре выращивания в течение от нескольких минут до нескольких десятков минут. Это позволит установить между клетками внутри носителя плотную и устойчивую адгезию.

[0033] Время, которое требуется для формирования зачатка восстанавливаемого зуба в процессе выращивания, зависит от количества клеток, помещенных на носитель, от состояния клеточных масс, от условий выращивания, а также от вида животного и может составлять предпочтительно, по меньшей мере, один день, более предпочтительно - не менее 3 дней. Зачаток восстанавливаемого зуба или восстанавливаемый зуб, полученный выращиванием в течение этого времени, может экструдироваться в виде функционального зуба сразу после его внедрения в область утраченного зуба.

Кроме того, если продлить время выращивания, то продолжится процесс формирования зачатка восстанавливаемого зуба, то есть аккумуляция дентина и эмали, формирование коронки и формирование корня. Таким образом, время выращивания при формировании зачатка восстанавливаемого зуба можно регулировать в зависимости от условий выполнения выращивания, вида животного, состояния зачатка восстанавливаемого зуба и т.п. Например, при выращивании органной культуры, описанной ниже, можно переходить к этапу внедрения через 7 дней или в некоторых случаях через 6 дней выращивания. В других случаях в зависимости от состояния зачатка восстанавливаемого зуба или при использовании другого способа выращивания период выращивания может продолжаться более 30 дней или в некоторых случаях более 50 дней, более 100 дней или же более 300 дней.

[0034] Выращивание на носителе может выполняться либо только с носителем, содержащим в себе первую и вторую клеточные массы, либо в присутствии других животных клеток.

Если выращивание на носителе выполняется только с носителем, могут применяться условия, обычно используемые для выращивания животных клеток. В этом случае как общие условия для выращивания животных клеток, так и упомянутые выше условия могут применяться без каких-либо изменений. Однако дополнительно к культуре могут быть добавлены сыворотка млекопитающих и различные факторы, способствующие росту и дифференцировке этих клеток. Такие факторы могут представлять собой, например, (FGF) или костный морфогенетический белок (BMP).

[0035] Кроме того, с точки зрения газообмена и снабжения тканей и клеточных масс питательными веществами и с учетом того, что весь процесс подготовки может осуществляться в условиях in vitro без контакта с другими животными клетками, выращивание на носителе предпочтительно выполняется как выращивание органной культуры. Обычно в органной культуре выращивание осуществляется путем наложения пористой мембраны на среду культуры, подходящую для выращивания животных клеток, и помещения на мембрану первой и второй клеточных масс, внедренных в носитель. Используемая при этом пористая мембрана предпочтительно представляет собой мембрану с большим количеством пор диаметром от 0,3 до 5 мкм. Примерами таких мембран являются «Cell Culture Insert» (торговое наименование) и «Isopore Filter» (торговое наименование). Время выращивания органной культуры может составлять приблизительно от 1 до 7 дней, предпочтительно от 3 до 6 дней.

[0036] Если выращивание на носителе выполняется в присутствии других животных клеток, зуб со специфическим расположением клеток может быть сформирован на ранней стадии под воздействием различных цитокинов и подобных факторов из животных клеток. Выращивание в присутствии других животных клеток может выполняться в условиях in vivo с использованием выделенных или выращенных клеток.

[0037] В качестве животных в этом процессе предпочтительно использовать таких млекопитающих, как люди, свиньи, мыши, причем предпочтительно использовать тот же вид, от которого был получена ткань зубного зачатка, или же другой вид, состояние которого было изменено и приведено к иммунодефициту. Если используется живой организм, к предпочтительным видам трансплантации в организм относятся трансплантация в подпочечную капсулу, в мезентериальную ткань и подкожная трансплантация, которые позволяют органу или ткани, состоящим из животных клеток, развиваться как можно более нормально. Время выращивания в присутствии таких животных клеток может соответственно регулироваться в зависимости от происхождения клеток, условий выращивания, вида животного, в которое была выполнена трансплантация, и т.п., как и в случае органной культуры, описанном выше.

[0038] Благодаря такому этапу формирования зачатка восстанавливаемого зуба может быть получе