Иммуногенная композиция для применения в вакцинации против стафилококков

Иммуногенная композиция для применения в вакцинации против стафилококков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области стафилококковых иммуногенных композиций и вакцин, их изготовлению и применению таких композиций в медицине. Более конкретно, оно относится к вакцинным композициям, содержащим комбинацию антигенов для лечения или предупреждения стафилококковой инфекции. Также предложены способы применения таких вакцин в медицине и способы их приготовления.

Предшествующий уровень техники

Число как внебольничных, так и внутрибольничных инфекций увеличилось за последние годы с увеличением применения внутрисосудистых устройств. Внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции являются основной причиной заболеваемости и смертности, более конкретно в США, где они поражают более 2 миллионов пациентов ежегодно. Согласно различным исследованиям, примерно 6 процентов американских пациентов приобретают инфекцию во время их пребывания в больнице. Оценили, что экономическое бремя в США в 1992 г.превысило более чем 4,5 биллиона долларов (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Наиболее частыми инфекциями являются инфекции мочеполового тракта (UTI-33% инфекций), затем пневмония (15,5%), хирургические раневые инфекции (14,8%) и первичные инфекции кровообращения (13%) (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428)).

Staphylococcus aureus, коагулазо-отрицательные стафилококки (чаще всего Staphylococcus epidermidis), Enterococcus spp, Esherichia coli и Pseudomonas aeruginosa являются основными нозокомиальными патогенами. Хотя эти патогены вряд ли вызывают одно и то же количество инфекций, тяжесть расстройств, которые они могут вызывать, вместе с частотой устойчивых к антибиотикам изолятов, сдвигают это равновесие в сторону S. aureus и S. epidermidis, как являющихся наиболее значимыми нозокомиальными патогенами.

Staphylococcus aureus является наиболее частой причиной внутрибольничных инфекций со значительной заболеваемостью и смертностью (Romero-Vivas et al., 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Он является причиной некоторых случаев остеомиелита, эндокардита, септического артрита, пневмонии, абсцессов и синдрома токсического шока.

S. epidermidis является нормальным кожным комменсалом, который является также важным оппортунистическим патогеном, ответственным за инфекции имплантированных медицинских устройств и инфекции хирургических ран. Медицинские устройства, инфицированные S. epidermidis, включают в себя водители ритма сердца, цереброспинальные шунты, катетеры для постоянного перитонеального диализа в амбулаторных условиях, ортопедические устройства и искусственные клапаны сердца.

Инфекции S. aureus и S. epidermidis лечат антибиотиками, причем пенициллин является лекарством выбора, тогда как ванкомицин используют для метициллин-устойчивых изолятов. Процент штаммов стафилококков, проявляющих широкий спектр устойчивости к антибиотикам, стал все больше увеличиваться с 1980-х гг.(Panlilo et al., 1992, Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), представляя угрозу для эффективной противомикробной терапии. Кроме того, недавнее появление ванкомицин-устойчивого штамма S. aureus вызвало опасение, что появятся и распространятся метициллин-устойчивые штаммы S. aureus, для которых не существует эффективной терапии.

Исследовали альтернативный подход с использованием антител против стафилококковых антигенов в пассивной иммунотерапии. Терапия, включающая введение поликлональных антисывороток, находится в стадии разработки (WO 00/15238, WO 00/12132), а также лечение моноклональным антителом против липотейхоевой кислоты (WO 98/57994).

Альтернативный подход мог бы представлять собой применение активной вакцинации для индукции иммунного ответа против стафилококков. Идентифицированы несколько кандидатов для включения в качестве вакцинных компонентов. Они включают в себя фибронектин-связывающий белок (US5840846), аналог МНС II (US5648240), фибриноген-связывающий белок (US6008341), GehD (US 2002/0169288), коллаген-связывающий белок (US6288214), SdrF, SdrG и SdrH (WO 00/12689), мутант SEA и экзотоксины SEB (WO 00/02523) и витронектин-связывающий белок 52 кДа (WO 01/60852).

Геном S. aureus секвенирован, и многие кодирующие последовательности идентифицированы (ЕР 786519, WO 02/094868). То же верно и для S. epidermidis (WO 01/34809). Совершенствуя этот подход, другие идентифицировали белки, которые распознаются гипериммунными сыворотками от пациентов, которые перенесли стафилококковую инфекцию (WO 01/98499, WO 02/059148).

Первое поколение вакцин, направленных против S. aureus или против экзопротеинов, которые он продуцирует, не дало больших результатов (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Все еще сохраняется потребность в эффективных вакцинах против стафилококковых инфекций.

Соответственно, в настоящем изобретении предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере два разных белка или их иммуногенных фрагмента, выбранных из по меньшей мере двух групп белков или иммуногенных фрагментов, выбранных из следующих групп:

Группа (а): по меньшей мере одного стафилококкового белка, связывающего внеклеточный компонент, или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из рецептора ламинина, SitC/MntC/связывающего белка слюны, EbhA, EbhB, эластин-связывающего белка (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолизина, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, липазы GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase (нейтральной фосфатазы), IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, витронектин-связывающего белка, фибриноген-связывающего белка, коагулазы, Fig и MAP.

Группа (б): по меньшей мере одного стафилококкового транспортного белка или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из иммунодоминантного ABC-транспортера, IsdA, IsdB, Mg2+ транспортера, Site и Ni ABC-транспортера.

Группа (в): по меньшей мере одного стафилококкового регулятора вирулентности, токсин или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из альфа-токсина (HIa), мутанта альфа-токсина H35R, РНК Ill-активирующего белка (RAP).

Описание графических материалов

Фиг.1. Полипептидные последовательности предпочтительных белков. В Таблице 1 приведена информация, какой белок представлен каждой SEQ ID.

Фиг.2. Нуклеотидные последовательности, кодирующие предпочтительные белки. В Таблице 1 приведена информация, какой белок кодируется каждой SEQ ID.

Фиг.3. Очистка альфа-токсина в нативных условиях. На панели А показан ПААГ-ДСН (полиакриламидный гель с додецил сульфатом натрия), окрашенный кумасси, образцов, полученных в процессе очистки альфа-токсина. Дорожка 1 - маркеры молекулярной массы, дорожка 2 - растворимая фракция, содержащая сверхэкспрессированный альфа-токсин, дорожка 3 - проскок из Ni-NTA колонки, дорожка 4 - фракции, элюированные 10%-ным буфером В, дорожка 5 - фракции, элюированные 20%-ным буфером В, дорожка 6 - фракции, элюированные 30%-ным буфером В, дорожка 7 - фракции, элюированные 50%-ным буфером В, дорожка 8 - фракции, элюированные 75%-ным буфером В, дорожка 9 и 10 - фракции, элюированные 100%-ным буфером В, дорожка 11 - бактерии при Т=0 перед индукцией, дорожка 12 - бактерии при Т=4 часа после индукции, дорожка 13 - клеточный лизат, дорожка 14 - растворимая фракция, дорожка 15 - нерастворимая фракция.

На панели В показан окрашенный кумасси ПААГ-ДСН 10, 5, 2 и 1 мкл очищенного альфа-токсина.

Фиг.4. Очистка SdrC в денатурирующих условиях. На панели А показан окрашенный кумасси ПААГ-ДСН образцов, полученных в процессе очистки альфа-токсина. Дорожка М - маркеры молекулярной массы, дорожка Старт - супернатант, полученный из нерастворимой фракции, содержащей сверхэкспрессированный SdrC, дорожка FT1 - проскок из Ni-NTA колонки, дорожка С - фракции, элюированные промывочным буфером С, дорожка D - фракции, элюированные буфером D, дорожка Е - фракции, элюированные буфером Е. На панели В показан окрашенный кумасси ПААГ-ДСН 1, 2, 5 и 10 мкл очищенного SdrC.

Фиг.5. Результаты ELISA для антисывороток против стафилококковых белков в планшетах, покрытых очищенными белками.

Pool mice pre - результат с использованием объединенных сывороток, взятых у мышей перед вакцинацией. Pool mice Post III - результат с использованием объединенных мышиных сывороток, взятых после иммунизации. Pool rabbit pre - результат с использованием объединенных сывороток, взятых у кроликов перед вакцинацией. Pool rabbit Post III - результат с использованием объединенных кроличьих сывороток, взятых после иммунизации. BIc - отрицательный контроль.

Фиг.6 - результаты ELISA для мышиных антисывороток, полученных против стафилококковых белков, в планшетах, покрытых убитыми стафилококками.

Для панели А используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. aureus серотипа 5. Для панели В используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. aureus серотипа 8. Для панели С используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. epidermidis.

Линия, обозначенная квадратиками, показывает результат ELISA с использованием антисывороток от мышей, иммунизированных три раза указанным стафилококковым белком. Линия, обозначенная ромбиками, показывает результат ELISA для преиммунных мышиных сывороток.

Фиг.7 - результаты ELISA для кроличьих антисывороток, полученных против стафилококковых белков, в планшетах, покрытых убитыми стафилококками.

Для панели А используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. aureus серотипа 5. Для панели В используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. aureus серотипа 8. Для панели С используют планшеты, покрытые убитыми целыми клетками S. epidermidis.

Линия, обозначенная квадратиками, показывает результат ELISA с использованием антисывороток от кроликов, иммунизированных три раза указанным стафилококковым белком (за исключением HarA, где осуществляли только одну иммунизацию). Линия, обозначенная ромбиками, показывает результат ELISA для преиммунных кроличьих сывороток.

Подробное описание

В настоящем изобретении раскрыты конкретные комбинации стафилококковых антигенов, которые при объединении приводят к получению иммуногенной композиции, которая эффективна при лечении или предупреждении стафилококковой инфекции. Иммуногенные композиции по изобретению соответственно включают антигены, которые вовлечены в разные функции стафилококков. Такие иммуногенные композиции нацеливают иммунный ответ на разные аспекты функции стафилококков и поэтому способны индуцировать особенно эффективный иммунный ответ.

Стафилококковые инфекции проходят через несколько разных стадий. Например, жизненный цикл стафилококков включает комменсальную колонизацию, инициацию инфекции путем обеспечения доступа к прилежащим тканям или в кровоток, энаэробное размножение в крови, взаимодействие между эпитопами вирулентности S. aureus и защитными механизмами хозяина, и индукцию осложнений, включающих эндокардит, образование метастатического абсцесса и септический синдром. Различные молекулы на поверхности бактерии будут вовлекаться в разные стадии инфекционного цикла. Нацеливая иммунный ответ против эффективного количества комбинации конкретных антигенов, вовлеченных в разные процессы стафилококковой инфекции, можно получить стафилококковую иммуногенную композицию или вакцину с повышенной эффективностью.

В частности, комбинации некоторых антигенов из разных классов, некоторые из которых вовлечены в адгезию к клеткам хозяина, некоторые из которых вовлечены в поглощение железа или другие транспортные функции, некоторые из которых представляют собой токсины или регуляторы вирулентности, и иммунодоминантных антигенов могут вызывать иммунный ответ, который защищает против многих стадий инфекции.

Эффективность иммунного ответа может быть измерена или в анализах на животных моделях, как описано в примерах, и/или с использованием опсонофагоцитарного анализа, как описано в примерах.

Дополнительное преимущество изобретения состоит в том, что комбинация антигенов по изобретению из разных семейств белков в иммуногенной композиции будет способна защищать против более широкого диапазона штаммов.

Изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим множество белков, выбранных из по меньшей мере двух разных категорий белка, имеющих разные функции в стафилококках. Примерами таких категорий белков являются внеклеточные связывающие белки, транспортные белки, такие как белки, осуществляющие захват Fe; токсины или регуляторы вирулентности и другие иммунодоминантные белки. Вакцинные комбинации по изобретению эффективны против гомологичных штаммов стафилококков (штаммов, из которых происходят данные антигены) и предпочтительно также против гетерологичных штаммов стафилококков.

Иммуногенная композиция по изобретению содержит некоторые белки, количество которых равно или больше 2, 3, 4, 5 или 6, выбранных из 2 или 3 следующих групп:

- группы (а) - по меньшей мере одного стафилококкового белка, связывающего внеклеточный компонент, или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из рецептора ламинина, SitC/MntC/связывающего белка слюны, EbhA, EbhB, эластин-связывающего белка (EbpS), EFB (FIB), SBI, аутолизина, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, липазы GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, витронектин-связывающего белка, фибриноген-связывающего белка, коагулазы, Fig и MAP;

- группы (б) - по меньшей мере одного стафилококкового транспортного белка или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из иммунодоминантного ABC-транспортера, IsdA, IsdB, Mg2+ транспортера, SitC и Ni ABC-транспортера;

- группы (в) - по меньшей мере одного стафилококкового регулятора вирулентности, токсина или его иммуногенного фрагмента, выбранного из группы, состоящей из альфа-токсина (HIa), мутанта альфа-токсина H35R, РНК III-активирующего белка (RAP).

Например, первый белок выбран из группы (а), (б) или (в), и второй белок выбран из группы, выбранной из группы (а), (б) и (в), которая не включает в себя второй белок.

В предпочтительном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один белок, выбранный из группы (а), и дополнительный белок, выбранный из группы (б) и/или группы (в).

В другом воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы (б), и дополнительный белок, выбранный из группы (в) и/или группы (а).

В другом воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы (в), и дополнительный белок, выбранный из группы (а) и/или группы (б).

Иммуногенная композиция по изобретению соответственно содержит белки из S. aureus и/или S. epidermidis.

Белки

Иммуногенные композиции по изобретению содержат выделенный белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97-99%-ную или строгую идентичность с любой последовательностью из фиг.1.

Когда белок конкретно упоминается в данном описании, предпочтительной является ссылка на нативный или рекомбинантный, полноразмерный белок или, возможно, зрелый белок, в котором была удалена сигнальная последовательность. Данный белок может быть выделен непосредственно из стафилококкового штамма или получен методами рекомбинантных ДНК. Иммуногенные фрагменты белка могут быть включены в иммуногенную композицию по изобретению. Они представляют собой фрагменты, содержащие по меньшей мере 10 аминокислот, предпочтительно 20 аминокислот, более предпочтительно 30 аминокислот, более предпочтительно 40 аминокислот или 50 аминокислот, наиболее предпочтительно 100 аминокислот, взятых непрерывно из аминокислотной последовательности белка. Кроме того, такие иммуногенные фрагменты иммунологически реагируют с антителами, полученными против стафилококковых белков, или с антителами, индуцируемыми инфицированием млекопитающего хозяина стафилококками. Иммуногенные фрагменты также включают в себя фрагменты, которые при введении в эффективной дозе (либо отдельно, либо в виде гаптена, связанного с носителем), вызывают защитный иммунный ответ против стафилококковой инфекции, более предпочтительно он является защитным против инфекции S. aureus и/или S. epidermidis. Такой иммуногенный фрагмент может включать, например, белок, не содержащий N-концевой лидерной последовательности, и/или трансмембранного домена, и/или С-концевого якорного домена. В предпочтительном аспекте иммуногенный фрагмент согласно изобретению содержит по существу весь внеклеточный домен белка, который имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную идентичность, более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97-99%-ную идентичность с последовательностью, которая выбрана из фиг.1, по сравнению с полной длиной последовательности фрагмента.

В иммуногенные композиции по изобретению также включены слитые белки, состоящие из стафилококковых белков, или иммуногенные фрагменты стафилококковых белков. Такие слитые белки могут быть получены рекомбинантно и могут содержать один участок из по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 стафилококковых белков. Альтернативно, слитый белок может содержать множество участков из по меньшей мере 2, 3, 4 или 5 стафилококковых белков. Они могут объединять разные стафилококковые белки или их иммуногенные фрагменты в одном и том же белке. Альтернативно, изобретение также включает отдельные слитые белки стафилококковых белков или их иммуногенных фрагментов в виде слитого белка с гетерологичными последовательностями, такими как источник Т-клеточных эпитопов или метки для очистки, например: β-галактозидаза, глутатион-8-трансфераза, зеленые флуоресцентные белки (GFP), эпитопные метки, такие как FLAG, myc-метка, полигистидин, или вирусные поверхностные белки, такие как гемагглютинин вируса гриппа, или бактериальные белки, такие как столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, CRM197.

Таблица 1

В следующей таблице представлены SEQ ID номера предпочтительных белковых последовательностей и последовательностей ДНК, которые находятся на фиг.1 и фиг.2 соответственно. SA указывает на последовательность из S. aureus, и SE указывает на последовательность из S. epidermidis.

Название	Белковая последовательность	Последовательность ДНК
Иммунодоминантный АВС-транспортер
SA	SEQ ID 1	SEQ ID 34
SE	SEQ ID 2	SEQ ID 35
Рецептор ламинина
SA	SEQ ID3	SEQ ID 36
SE	SEQ ID 4	SEQ ID 37
Секреторный антиген A SsaA
SA1	SEQ ID 5	SEQ ID 38
SA2	SEQ ID 6	SEQ ID 39
5Е	SEQ ID 7	SEQ ID 40
SitC
SA	SEQ ID 8	SEQ ID 41
SE	SEQ ID 9	SEQ ID 42
IsaA/PisA (IssA)
SA	SEQID10	SEQ ID 43
SE	SEQID11	SEQ ID 44
EbhA/B
SA EbhA	SEQID12	SEQ ID 45
SA EbhB	SEQID 13	SEQ ID 46
SE EbhA	SEQ ID 14	SEQ ID 47
SE EbhB	SEQID 15	SEQ ID 48
Белок, ассоциированный с накоплением Аар
SA	SEQ ID 16	SEQ ID 49
SE	SEQ ID 17	SEQ ID 50
РНК III-активирующий белок RAP
SA	SEQ ID 18	SEQ ID 51
SE	SEQ ID 19	SEQ ID 52
FIG/SdrG
SA	SEQ ID 20	SEQ ID 53
SE	SEQ ID 21	SEQ ID 54
Эластин-связывающий белок EbpS
SA	SEQ ID 22	SEQ ID 55
SE	SEQ ID 23	SEQ ID 56
Внеклеточный белок EFB SA	SEQ ID 24	SEQ ID 57
альфа-токсин SA	SEQ ID 25	SEQ ID 58
SBI SA	SEQ ID 26	SEQ ID 59
IsdA SA	SEQ ID 27	SEQ ID 60
IsdB SA	SEQ ID 28	SEQ ID 61
SdrC SA	SEQ ID 29	SEQ ID 62
ClfA SA	SEQ ID 30	SEQ ID 63
FnbA SA	SEQ ID 31	SEQ ID 64
ClfB SA	SEQ ID 32	SEQ ID 65
Коагулаза SA	SEQ ID 33	SEQ ID 66
FnbB SA	SEQ ID 67	SEQ ID 71
MAP SA	SEQ ID 68	SEQ ID 72
SdrC SA	SEQ ID 69	SEQ ID 73
SdrG SA	SEQ ID 70	SEQ ID 74

Белки, связывающие внеклеточные компоненты

Белки, связывающие внеклеточные компоненты, представляют собой белки, которые связываются с внеклеточными компонентами хозяина. Термин включает, но не ограничивается адгезинами.

Примеры белков, связывающих внеклеточные компоненты, включают в себя рецептор ламинина (Naidu et al. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), SitC/MntC/связывающий белок слюны (US5801234, Wiltshire and Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, эластин-связывающий белок (EbpS) (Park et al., 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt and Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), аутолизин (Rupp et al., 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (US6008341, McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000, 146; 1535), липазу GehD (US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock et al. Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth et al., 2001 Infec. Immun. 69; 345), коллаген-связывающий белок Cna (Visai et al., 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al., 1988 J. Gen Microbiol. 134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain and Hermann symposium on Staph Denmark 14-17th 2000), SSP-1 (Veenstra et al., 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al., 1996, J. Bacteriol. 178; 537), гепарин-связывающий белок HBP 17 кДа (Fallgren et al., 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), витронектин-связывающий белок (Li et al., 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), фибриноген-связывающий белок, коагулазу, Fig (WO 97/48727) и MAP (US 5648240) SitC/MntC/связывающий белок слюны

Он представляет собой ABC-транспортный белок, который является гомологом адгезина PsaA в S. pneumoniae. Он представляет собой высоко иммуногенный липопротеин 32 «Да, который распределен по бактериальной клеточной стенке (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). Он экспрессируется в S. aureus и S. epidermidis в виде липопротеина 32 «Да, а гомолог 40 кДа присутствует в S. hominis. В S. epidermidis он представляет собой компонент железо-регулируемого оперона. Он демонстрирует значительную гомологию для обоих адгезинов, включая FimA Streptococcus parasanguis, и с липопротеинами семейства ABC-транспортеров с доказанными или предполагаемыми транспортными функциями металла железа. Поэтому SitC включают в качестве внеклеточного связывающего белка и в качестве транспортера ионов металлов.

Связывающий белок слюны, раскрытый в US 5801234, также представляет собой форму SitC и может быть включен в иммуногенную композицию по изобретению.

ClfA и ClfB

Оба этих белка обладают фибриноген-связывающей активностью и стимулируют S. aureus к образованию колоний в присутствии плазмы. Они содержат LPXTG-мотив, общий для белков, ассоциированных со стенкой.

ClfA описан в US6008341, и ClfB описан в WO 99/27109. Коагулаза (FppA)

Она представляет собой фибриноген-связывающий белок, который индуцирует S. aureus к образованию колоний в присутствии плазмы. Она описана в ссылках, относящихся к коагулазам: Phonimdaeng et al.. (J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393-404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) и Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456).

Предпочтительные фрагменты для включения в иммуногенную композицию по изобретению включают в себя зрелый белок, в котором был удален сигнальный пептид (аминокислоты от 27 до С-конца).

Коагулаза имеет три разных домена. Аминокислоты 59-297, которые представляют собой биспиральный участок, аминокислоты 326-505, которые представляют собой пролин- и глицин-обогащенный участок, и С-концевой домен из аминокислот 506-645, который имеет бета-слойную конформацию. Каждый из этих доменов является предпочтительным фрагментом по изобретению.

SdrG - Fbe - EfB/FIG

Fbe представляет собой фибриноген-связывающий белок, который обнаружен во многих изолятах S. epidermidis и имеет выведенную молекулярную массу 119 кДа (Nilsson et al., 1998. Infect, Immun. 66; 2666). Его последовательность родственна последовательности фактора агглютинации из S. aureus (ClfA). Антитела против Fbe могут блокировать связывание S. epidermidis с фибриноген-покрытыми планшетами и с катетерами (Pei and Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Этот белок также описан как SdrG в WO 00/12689. SdrG обнаружен в коагулазо-отрицательных стафилококках и представляет собой ассоциированный с клеточной стенкой белок, содержащий LPXTG-последовательность.

SdrG содержит сигнальный пептид (аминокислоты 1-51), участок, содержащий фибриноген-связывающие сайты и коллаген-связывающие сайты (аминокислоты 51-825), два CnaB домена (аминокислоты 627-698 и 738-809), повторяющийся участок SD (аминокислоты 825-1000) и якорный домен (аминокислоты 1009-1056).

Fbe имеет предполагаемую сигнальную последовательность с сайтом расщепления между аминокислотами 51 и 52. Поэтому предпочтительный фрагмент Fbe содержит зрелую форму Fbe, продолжающуюся от аминокислоты 52 до С-конца (аминокислота 1092).

Домен Fbe от аминокислоты 52 до аминокислоты 825 отвечает за связывание с фибриногеном. Поэтому предпочтительный фрагмент Fbe состоит из аминокислот 52-825 или содержит их.

Участок между аминокислотами 373 и 516 Fbe демонстрирует наибольшую консервативность между Fbe и ClfA. Поэтому предпочтительный фрагмент будет содержать аминокислоты 373-516 Fbe.

Аминокислоты 825-1041 Fbe содержат высоко повторяющийся участок, состоящий из тандемно повторяющихся остатков аспарагиновой кислоты и серина.

Предпочтительные фрагменты SdrG включают в себя полипептиды, в которых сигнальный пептид и/или повторы SD и якорный домен были удалены. Они включают в себя полипептиды, содержащие или состоящие из аминокислот 50-825, аминокислот 50-633, аминокислот 50-597 (SEQ ID NO 2 из WO 03/76470), аминокислот 273-597 (SEQ ID NO 4 из WO 03/76470), аминокислот 273-577 (SEQ ID NO 6 из WO 03/76470) аминокислот 1-549, аминокислот 219-549, аминокислот 225-549, аминокислот 219-528, аминокислот 225-528 из SEQ ID ON:70.

Предпочтительно, полипептид SdrG, имеющий последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологичную последовательности из SEQ ID 70, 20 или 21, включен в иммуногенную композицию по изобретению.

Композиции по изобретению возможно содержат фрагмент полипептидов SdrG, описанных выше.

Предпочтительные фрагменты имеют делетированный сигнальный пептид и/или повторяющийся домен SD, и/или якорный домен. Например, последовательности, соответствующие аминокислотам 1-713, 1-549, 225-549, 225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 из SEQID 76 или последовательностей, имеющих 85%-, 90%-, 92%-, 95%-, 97%-, 98%-, 99%- или 100%-ную идентичность с SEQ ID 70, или 20, или 21.

Предпочтительный фрагмент с делетированным сигнальным пептидом имеет метиониновый остаток на N-конце фрагмента для обеспечения правильной трансляции.

Более предпочтительный фрагмент имеет следующую последовательность:

MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTINVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSQYTNIDEKISNQDE

LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLYDSFTIPKIKDNSDEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNVNISGNGDEDST

IIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQYVTNQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEQPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTMPALDSEGNSVWVTINGQDDNTIDSGFYQTPKYSLGNY

VWYDTNKDGIQGDDEKDISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDE

EbhA и EbhB

EbhA и EbhB представляют собой белки, которые экспрессируются как в S. aureus, так и в S. epidermidis (Clarke and Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680, Williams et al. Infect. Immun. 2002, 20; 6805), и которые связываются с фибронектином. Поскольку фибронектин является важным компонентом внеклеточного матрикса, EbhA и EbhB осуществляют важную функцию в прикреплении стафилококков к внеклеточному матриксу хозяина.

Белки Ebh являются большими, имеющими молекулярную массу 1,1 мегадальтон. Предпочтительно использовать фрагмент белка Ebh, а не полную последовательность из-за легкости получения и приготовления в виде препарата. Центральный участок белка содержит неполные повторы, которые содержат фибронектин-связывающие сайты. Фрагменты, содержащие один или более повторяющихся доменов, описанных ниже, представляют собой предпочтительные фрагменты для включения в иммуногенную композицию по изобретению.

Белки Ebh содержат неполные повторяющиеся единицы длиной 127 аминокислот, которые характеризуются содержанием консенсусной последовательности:

L.G.{10}А.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

Предпочтительно,

.{19}L.G.{10}A.{13}Q. {26}L...M..L.{33}A.{12}

Более предпочтительно,

.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......

Где '.' означает любую аминокислоту, а '.{10}' означает любые 10 аминокислот, и I/V указывает на альтернативный выбор аминокислоты.

Посредством ссылки на последовательность, раскрытую в Kuroda et al., (2001) Lancet 357; 1225-1240, и Таблицу 2, легко выводят повторяющиеся последовательности в белках Ebh.

Предпочтительные фрагменты, которые могут быть включены в иммуногенную композицию по изобретению, включают в себя полипептиды, содержащие одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более 10 127-аминокислотных повторяющихся единиц. Такие фрагменты могут состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов 127-аминокислотного повторяющегося участка или могут состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более повторов с дополнительными аминокислотными остатками, присутствующими либо на одном, либо на обоих концах данного фрагмента. Другой предпочтительный фрагмент представляет собой полипептид Н2 примерно 44 кДа, охватывающий три повтора (аминокислоты 3202-3595), как описано в Clarke et al. Infection and Immunity 70, 6680-6687, 2002. Такие фрагменты предпочтительно будут способны связывать фибронектин и/или активировать антитела, которые являются реактивными против целого белка Ebh.

Полипептиды Ebh способны связываться с фибронектином. Предпочтительные фрагменты этих полипептидных последовательностей сохраняют способность связываться с фибронектином. Связывание с фибронектином можно оценить с помощью ELISA, как описано у Clarke с соавт.(Infection and Immunity 70; 6680-6687 2002).

Еще одни предпочтительные фрагменты представляют собой фрагменты, которые содержат В-клеточный или Т-хелперный эпитоп, например те фрагменты/пептиды, которые описаны в Таблицах 3 и 4.

ТАБЛИЦА 2. Повторяющиеся последовательности в полноразмерной последовательности Ebh.

Полноразмерная последовательность Ebh раскрыта в Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225-1240. В следующей таблице показаны аминокислотные остатки, в которых 127-аминокислотные повторы начинаются и заканчиваются в пределах полноразмерной последовательности.

	Начало	Конец
1	3204	3330
2	3331	3457
3	3457	3583
4	3583	3709
5	3709	3835
6	3835	3961
7	3961	4087
8	4200	4326
9	4326	4452
10	4452	4578
11	4578	4704
12	4704	4830
13	4830	4956
14	4956	5082
15	5082	5208
16	5208	5334
17	5334	5460
18	5460	5586
19	5585	5711
20	5711	5837
21	5837	5963
22	5963	6089
23	6089	6215
24	6215	6341
25	6341	6467
26	6467	6593
27	6593	6719
28	6719	6845
29	6845	6971
30	6971	7097
31	7097	7223
32	7223	7349
33	7349	7475
34	7475	7601
35	7601	7727
36	7727	7853
37	7852	7978
38	7978	8104
39	8104	8230
40	8230	8356
41	8356	8482
42	8482	8608
43	8604	8730
44	8858	8984

Таблица 3. Предсказание В-клеточного эпитопа для 127-аминокислотного повтора:

Полноразмерная последовательность раскрыта в Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 1225-1240. Один из этих повторов, кодируемый аминокислотами 3204-3331 полноразмерной последовательности, был выбран для осуществления предсказания эпитопов:

MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

Начало	Конец	Последовательность эпитопа	Старт	Стоп
5	10	TVNQKA	3208	3213
14	19	KSTKDA	3217	3222
21	33	DGQQNLQRAKTEA	3224	3236
42	51	DLNQAQKNAL	3245	3254
66	74	DIKQTTQSL	3269	3277
100	112	ADTNKKNDYNNAY	3303	3315
117	123	DIINGNA	3320	3326

- Колонки “Начало” и “Конец” представляют положение предсказанных В-клеточных эпитопов в 127-аминокислотном повторе

- Колонки “Старт” и “Стоп” представляют положение предсказанных В-клеточных эпитопов в полноразмерной последовательности Ebh

Таблица 4. Предсказание Т-хелперного клеточного эпитопа в Ebh: Полноразмерная последовательность раскрыта в базе данных TrEMBL, ссылка на последовательность Q8NWQ6. Один из этих повторов, кодируемый аминокислотами 3204-3331 полноразмерной последовательности, был выбран для осуществления предсказания эпитопов:

MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI

Положение повтора	Последовательность эпитопа	Положение последовательности
1	MDVNTVNQK	3204
3	VNTVNQKAA	3206
6	VNQKAASVK	3209
26	LQRAKTEAT	3229
37	ITHASDLNQ	3240
43	LNQAQKNAL	3246
51	LTQQVNSAQ	3254
55	VNSAQNVHA	3258
61	VHAVNDIKQ	3264
64	VNDIKQTTQ	3267
67	IKQTTQSLN	3270
74	LNTAMTGLK	3277
78	MTGLKRGVA	3281
81	LKRGVANHN	3284
85	VANHNQWQ	3288
91	WQSDNYVN	3294
92	VQSDNYVNA	3295
97	YVNADTNKK	3301
98	VNADTNKKN	3302
108	YNNAYNHAN	3311
112	YNHANDIIN	3315
118	IINGNAQHP	3321
119	INGNAQHPV	3322

- Колонка “Положение повтора” представляет положение предсказанных Т-клеточных эпитопов в повторе

- Колонка “Положение последовательности” представляет положение предсказанных Т-клеточных эпитопов в полноразмерной последовательности Ebh

Фрагменты полипептидов по изобретению могут быть использованы для получения соответствующего полноразмерного полипептида посредством пептидного синтеза; поэтому эти фрагменты могут быть использованы в качестве промежуточных для получения полноразмерных полипептидов по изобретению.

Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 или 1 аминокислот(а) замещены, делетированы или добавлены в любой комбинации.

Эластин-связывающий белок (EbpS)

EbpS представляет собой белок, содержащий 486 аминокислот, с молекулярной массой 83 кДа. Он связан с цитоплазматической мембраной S. aureus и имеет три гидрофобных участка, которые удерживают данный белок в мембране (Downer et al., 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al., 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803).

Два участка между аминокислотами 1-205 и 343-486 поверхностно экспонированы на наружной стороне цитоплазматической мембраны. Лиганд-связывающий домен EbpS расположен между остатками 14-34 на N-конце (Park et al., 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

Предпочтительный фрагмент, который может быть включен в иммуногенную композицию по изобретению, может представлять собой поверхностно-экспонированный фрагмент, содержащий эластин-связывающий участок (аминокислоты 1-205). Некоторые предпочтительные фрагменты не содержат полную экспонированную петлю, но должны содержать эластин-связывающий участок (аминокислоты 14-34). Альтернативный фрагмент, который можно было бы использовать, состоит из аминокислот, образующих вторую поверхностно-экспонированную петлю (аминокислоты 343-486). Также возможны альтернативные фрагменты, содержащие вплоть до 1, 2, 5, 10, 20, 50 и менее аминокислот на одном или обоих концах.

Рецепторы ламинина

Рецептор ламинина из S. aureus играет важную роль в патогенности. Отличительным признаком инфекции является инвазия в кровоток, которая делает возможным системное распространение метастатического абсцесса. Для инвазии в кровоток необходима способность проникать через базальную мембрану сосудов. Это достигается посредством связывания с ламинином через рецептор ламинина (Lopes et al. Science 1985, 229; 275).

Рецепторы ламинина экспонированы на поверхности и присутствуют во многих штаммах стафилококков, включая S. aureus и S. epidermidis.

SBI

Sbi представляет собой белок, имеющий lgG-связывающий участок и аролипопротеин Н-связывающий домен, и он экспрессируется в большинстве штаммов S. aureus (Zhang et al., 1998, Microbiology 144; 985).

N-конец последовательности Sbi имеет типичную сигнальную последовательность с сайтом расщепления после аминокислоты 29. Поэтому предпочтительный фрагмент Sbi, который может быть включен в иммуногенную композицию по изобретению, начинается в аминокислотном остатке 30, 31, 32 или 33 и продолжается до С-конца Sbi, например из SEQ ID NO: 26.

lgG-свя