Применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины

Применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной вирусологии и микробиологии, расширяет набор адъювантов и может быть использовано в биологической промышленности и научно-исследовательской работе при разработке и производстве иммунизирующих препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней у различных видов домашних и сельскохозяйственных животных.

Иммуногенность и эффективность вакцин в значительной степени увеличивается с использованием в технологии их изготовления неспецифических стимуляторов иммунитета - адъювантов.

Известно применение в качестве адъювантов при изготовлении различных антигенов гидроокиси алюминия Al(ОН)₃, которая является слабым адъювантом в комплексе с антигенами.

Известны масляные адъюванты (типа адъюванта Фрейнда и др.), которые обладают выраженными иммуностимулирующими свойствами, но имеют повышенную реактогенность для животных.

Известны отдельные вещества из группы сапонинов, широко применяемые в настоящее время в качестве адъювантов при производстве различных типов вакцин [1].

В Российской Федерации при изготовлении вакцин чаще всего используют импортный сапонин, изготовленный фирмой «Merck» Германия.

Сапонины являются поверхностно-активными агентами и вызывают гемолиз эритроцитов in vitro. В 1995 году Kensil с коллегами выделил чистую фракцию Quil А сапонина с низкой токсичностью (QS 21) и определил структурные доли, ответственные за адъювантную активность [2].

Было доказано, что QS 21 является адъювантом для выработки цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL), индуцируя цитокины (IL-2 и IFN-y) и антитела Ig G 2а-изотипа [2].

Однако все известные сапонины с адъювантным действием (описанные в литературе и импортируемые из Германии и Англии) изготавливаются из растений, не произрастающих на территории нашей страны. Высокая стоимость импортных препаратов и ежегодное увеличение потребляемого в биопромышленности и научно-исследовательской работе сапонина, увеличивают затраты на его закупку за границей.

В задачу создания настоящего изобретения входил поиск нового адъюванта, обладающего высокими иммуностимулирующими свойствами и способного заменить импортный препарат сапонин при изготовлении различных антигенов, используемых для получения вакцин против инфекционных заболеваний животных и диагностических сывороток. При этом адъювант должен быть свободным от балластных веществ, не иметь в своем составе антигенов, похожих на антигены хозяина, не обладать онкогенными, аллергенными и токсическими свойствами, легко метаболизироваться в организме животных.

Технический результат от применения известного препарата этоний в качестве адъюванта заключается в расширении ассортимента адъювантов для производства эффективных, безопасных и экономически целесообразных сорбированных противоящурных вакцин.

Указанный технический результат достигнут применением препарата этоний в качестве адъюванта при производстве препаратов для активной иммунизации и для диагностики вирусных инфекций животных.

Этоний (Ethonium, Aethonium)

Русское название: Этоний.

Белый кристаллический (аморфный) порошок со специфическим запахом. Легко растворим в воде, растворим в спирте, рН 1% водного раствора 4,5-5,5. Препарат является бисчетвертичным аммониевым основанием, относится к поверхностно-активным соединениям. Активное вещество - этилендецилоксикарбонилметилдиметиламмония дихлорид: 1,2-этилен-бис-(N-диметил-карбдецилоксиметил)-аммония дихлорид. Фарм: C₃₀H₆₂N₂O₄Cl₂.

Фармакологическое действие: обладает бактериостатическим (препятствующим размножению бактерий) и бактерицидным (уничтожающим бактерии) свойством. Эффективен в отношении стрептококков, стафилококков и других микроорганизмов. Оказывает детоксицирующее действие на стафилококковый токсин. Обладает местно-анестезирующей активностью, стимулирует заживление ран.

Показания к применению: в качестве антимикробного, обезболивающего и ускоряющего заживление средства при трофических гнойных язвах (медленно заживающих гнойных дефектах кожи). Трещинах сосков, прямой кишки, при лучевых поражениях кожи, при зудящих дерматозах (кожных заболеваниях); стоматитах (воспаление слизистой оболочки полости рта), гингивитах (воспаление слизистой оболочки десны); при язвах роговицы, кератитах (воспаление роговицы), отитах (воспалении полости уха) и др.

Применение ЭТОНИЙ геля 1% показано как в фазах альтерации и экссудации, так и на этапе регенерации, что позволяет избежать необходимости применения нескольких препаратов с различными механизмами действия и вместе с тем значительно повысить эффективность лечения [3].

Онищук Ф.Д. с соавторами использовали этоний в составе иммуномоделирующего препарата, который применялся в качестве терапевтического средства для повышения иммунитета [4].

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

В качестве тестобъекта использовали вирус ящура. Инактивированную сорбированную вакцину против ящура готовят из вируса, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением 0,15% гемогидролизата и антибиотиков при рН 7,4÷7.6.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025÷0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [5].

Полученный антиген очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,005÷0,007% [6].

Авирулентный и очищенный антигенный материал представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура. При этом к производственному штамму предъявляют требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения вируса при инактивации и длительном его хранении [7, 8].

Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см³ не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Необходимую концентрацию 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 см³ готового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см³ готового препарата в диапазоне от 1132,0 мкг до 2108,0 мкг.

К полученному концентрату добавляют дополнительно 10%-ный водный раствор этония или сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг его содержания в 1 см³ готового препарата.

Готовят 10%-ный раствор этония или сапонина на дистиллированной воде. Раствор автоклавируют при температуре 105°С не более 90 мин. Стерильный раствор хранят при температуре 4-6°С.

Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура представлен в таблице 1.

Допустимо изменять состав вакцины и процентное содержание отдельных ее компонентов, в том числе и этония. Позволительно изменять и пропись самих препаратов.

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

После изготовления вакцину подвергают контролю на стерильность, безвредность и иммуногенность, после чего ее выпускают для практического применения. Авирулентность, безвредность и иммуногенность вакцины проверяют на крупном рогатом скоте.

Пример 2

Адъювантные свойства этония определяли на крупном рогатом скоте массой 250÷300 кг. С этой целью было приготовлено 2 препарата.

Препарат №1 (содержание на одну прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура (КВЯ) типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов;

- этоний в количестве 3 мг. Этоний использовали ФС 42-1599-94, ОТК 6, партия 2 - Шосткинский завод химреактивов.

Препарат №2 (содержание на одну прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов без этония (контроль).

Препараты в дозе 2 см³ вводили подкожно в область шеи. О напряженности иммунитета судили по титрам вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных с гомологичным вирусом ящура типа Азия-1 Шамир 3/89. При этом считали, что чем выше титры вируснейтрализующих антител, тем сильнее адъювантное действие, обусловленное этонием.

Результаты опыта представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что введение в вирусный препарат этония способствует более раннему образованию вируснейтрализующих антител. Так, препарат №1 с этонием в прививной дозе в количестве 3 мкг обуславливает образование вируснейтрализующих антител через 5 суток в титре 3,33±0,68 log₂, 10 суток - 4,25±0,38 log₂, 17 суток 5,08±0,73 log₂, 30 суток - 4,00±0,43 log₂. В эти же сроки титр антител у животных, привитых препаратом №2, не содержащим этония (контроль), был равен: через 5 суток - 1,92±0,08 log₂, 10 суток - 4,00±0,14 log₂, 17 суток - 4,17±0,22 log₂, 30 суток - 3,00±0,14 log₂.

Таким образом, результаты таблицы 2 демонстрируют хорошие адъювантные свойства этония при оценке на крупном рогатом скоте.

Пример 3

В следующих опытах на крупном рогатом скоте определяли адъювантные свойства этония в сравнении с импортным сапонином, фирмы «Merck» Германия, в составе сорбированной противоящурной вакцины. Было приготовлено 4 серии вакцины, как описано ранее в примере 1.

Серия №1 (содержание на прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 5,5 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);

- ГОА в количестве 20 мг;

- этоний в количестве 1,5 мг.

Серия №2 (содержание на прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура Азия-1 Шамир 3/89 в количестве 5,5 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);

- ГОА в количестве 20 мг;

- сапонин в количестве1,5 мг.

Серия №3 (содержание на прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура типа C₅₆₄ в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);

- ГОА в количестве 20 мг;

- этоний в количестве 1,5 мг.

Серия №4 (содержание на прививную дозу):

- антиген культурального вируса ящура типа C₅₆₄ в количестве 6 мкг иммуногенных компонентов (146S+75S);

- ГОА в количестве 20 мг;

- сапонин в количестве 1,5 мг.

Препараты вводили в дозе 2 см³ крупному рогатому скоту подкожно в область шеи. О напряженности иммунитета судили по титрам вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных с гомологичным вирусом ящура типа Азия-1 Шамир 3/89 и типа С₅₆₄. Полученные результаты представлены в таблицах 3, 4.

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 3, сорбированная противоящурная вакцина типа Азия-1 Шамир 3/89 серии №1 с этонием 1,5 мг в прививной дозе обуславливает образование вируснейтрализующих антител: через 10 суток в титре 5,80±0,40 log₂ и через 21 сутки 5,75±0,24 log₂. Титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых сорбированной вакциной типа Азия-1 Шамир 3/89 серии №2 с сапонином 1,5 мг в прививной дозе, был равен: через 10 суток 5,70±0,56 log₂ и 21 сутки 5,60±0,32 log₂. Анализируя титры вируснейтрализующих антител, существенной разницы между адъювантной активностью этония и сапонина практически нет.

В таблице 4 показаны результаты иммуногенной активности сорбированной вакцины типа С₅₆₄. Так, титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых вакциной серии 3 с этонием 1,5 мг в прививной дозе, составляет через 10 суток 5,40±0,39 log₂ и через 21 сутки 5,90±0,30 log₂. Титр вируснейтрализующих антител у животных, привитых вакциной серии 4 с сапонином 1,5 мг в прививной дозе, был равен: через 10 суток 5,75±0,64 log₂ и через 21 сутки 5,81±0,41 log₂. Как видно из таблицы 4, существенной разницы между адъювантной активностью этония и сапонина и в этом опыте также нет.

Таким образом, препарат этоний обладает хорошей адъювантной активностью в составе сорбированной противоящурной вакцины и удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к адъювантам.

Источники информации:

1. Воробьев А.А., Васильев Н.Н. Адьюванты (неспецифические стимуляторы иммуногенеза). М.: «Медицина», 1969 г., с.18.

2. Kensil C.R. Saponins as vaccine adjuvants // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. - 1996. - V.13. - P.1 - 55.

3. Лечение ран и раневых инфекций - URL: http://www.msmg.ru/php/contents.php?id=828 (дата обращения 28.11.12).

4. Заявка на изобретение №99116458, А61К 31/41, 10.06.2001.

5. Патент РФ №594771, А61К 39/12, C12N 7/04, 07.07.1993.

6. Патент РФ №2054039, C12N 7/02, А61К 39/135, 10.02.1996.

7. Ререр Х. Ящур/Перевод с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971-432 с.

8. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/Под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат, 1990. - c.231-250.

Таблица 1
Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура
Оптимальная рецептура противоящурной инактивированной сорбированной вакцины (мкг в 1 см3 готового препарата)
Ингредиенты	минимум	средний	максимум
Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S и 75S) компонентов вируса ящура	3,0	>3,0	>3,0
ГОА	1132,0	1620,	2108,0
Этоний/сапонин	750,0	750,0	750,0
Поддерживающая среда	до 1000000,0	до 1000000,0	до 1000000,0

Таблица 2
Адъювантные свойства этония в опыте на крупном рогатом скоте
№ вакцины	№ животного	Титр ВНА в сыворотке крови против КВЯ типа Азия-1 Шамир 3/89, log2	Результаты контрольного заражения
д/в	5 СПВ	10 СПВ	17 СПВ	30 СПВ
1 Азия-1 Шамир 3/89 - 6 мкг + 3 мг этония в дозе 2 см3	1	н/о	2,00	3,75	5,25	4,75	2/3
2	н/о	3,75	4,00	3,75	3,25
3	н/о	4,25	5,00	6,25	4,00
M±m		3,33±0,68	4,25±0,38	5,08±0,73	4,00±0,43
p<0,05	p<0,01	p<0,025	p<0,025
2 Азия-1 Шамир 3/89 - 6 мкг в дозе 2 см3	4	н/о	1,75	3,75	3,75	2,75	0/3
5	н/о	2,00	4,00	4,50	3,00
6	н/о	2,00	4,25	4,25	3,25
M±m		1,92±0,08	4,00±0,14	4,17±0,22	3,00±0,14
p<0,005	p<0,001	p<0,05	p<0,001
Контроль 1							+
Контроль 2							+
Примечание: числитель - количество защищенных животных;
знаменатель - количество животных в опыте;
н/о - не обнаружено;
д/в - до вакцинации;
СПВ - сутки после вакцинации

Таблица 3
Сравнительное изучение адъювантной активности этония и сапонина в составе сорбированной противоящурной вакцины типа Азия-1
№ серии	Характеристика вакцины	№ животного	Титр вируснейтрализующих антител у крупного рогатого скота, log2
до вакцинации	10 суток после вакцинации	21 сутки после вакцинации
1	Антиген-Азия-1 Шамир 3/89 - 5,5 мкг иммуногенных компонентов ГОА-20 мг Этоний-1,5 мг			5,75	5,25
1	<1	4,50	5,25
2	<1	5,75	6,50
3	<1	6,00	5,75
4	<1	7,00	6,00
5	<1	5,80±0,40	5,75±0,24
		p<0,001	p<0,001
2	Антиген-Азия-1 Шамир 3/89 - 5,5 мкг иммуногенных компонентов ГОА - 20 мг Сапонин - 1,5 мг (контроль)			4,75	5,00
6	<1	4,00	5,25
7	<1	6.75	6,25
8	<1	6,75	6,50
9	<1	6,25	5,00
10	<1	5,75±0,56	5,60±0,32
		p<0,001	p<0,001

Таблица 4
Сравнительное изучение адъювантной активности этония и сапонина в составе сорбированной противоящурной вакцины типа С
№ серии	Характеристика вакцины	№ животного	Титр вируснейтрализующих антител у крупного рогато скота, log2
до вакцинации	10 суток после вакцинации	21 сутки после вакцинации
				5,25	6,25
	Антиген-С564 - 6 мкг	1	<1	6,00	6,00
	иммуногенных	2	<1	4,25	5,00
	компонентов	3	<1	5,00	6,75
3	ГОА - 20 мг	4	<1	6,50	5,50
	Этоний - 1,5 мг	5	<1	5,40±0,39	5,90±0,30
				p<0,001	p<0,001
	Антиген-С564 - 6 мкг			7,25	7,00
	иммуногенных	6	<1	5,25	5,75
4	компонентов	7	<1	4,25	5,25
	ГОА - 20 мг	8	<1	6,25	5,25
	Сапонин - 1,5 мг	9	<1	5,75±0,64	5,81±0,41
	(контроль)			p<0,005	p<0,001

Применение этония в качестве адъюванта для производства сорбированной противоящурной вакцины, где этоний используют в виде 10%-го водного раствора, который вносят в состав противоящурных вакцин в количестве 750 мкг на 1 см³ препарата.