Способ иммунологического анализа белка cxcl1 человека

Способ иммунологического анализа белка cxcl1 человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-177183RU/071

СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БЕЛКА CXCL1 ЧЕЛОВЕКА

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу количественного определения белка CXCL1 человека (далее в настоящем документе обозначаемого как CXCL1 человека). Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу иммунологического анализа, т.е. способу количественного определения CXCL1 человека, в котором используют комбинацию моноклональных антител или их фрагменты, каждый из которых специфично связывается с участком частичной последовательности в любом из трех специфичных участков аминокислотной последовательности, содержащей CXCL1 человека. Также, настоящее изобретение относится к специфично связывающимся с CXCL1 человека моноклональным антителам или их фрагментам, которые можно использовать в описанном выше способе количественного определения белка CXCL1 человека.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CXCL1 человека представляет собой разновидность хемокина, принадлежащего к семейству CXC. В крови этот белок находится в тромбоцитах, и известно, что CXCL1 подвергается повышенной экспрессии при воспалительных реакциях способом, аналогичным способу повышения экспрессии других членов семейства CXC.

В последние годы было опубликовано, что CXCL1 человека функционирует в качестве фактора, связанного с опухолевым процессом. Таким образом, ожидают, что CXCL1 человека может служить в качестве маркера злокачественной опухоли уротелия за счет определения количества CXCL1 человека в моче (Hiroaki Kawanishi et al, 2008, Clinical Cancer Research, vol. 14, No. 9, 2579-2587; и W02007/026895). Дополнительно опубликовано, что количество CXCL1 человека изменяется на уровне гена и на уровне белка в тканях или в крови пациентов с другими злокачественными опухолями, такими как злокачественная опухоль толстого кишечника, злокачественная опухоль яичников или злокачественная меланома (Gong Yang et al, 2006, PNAS, vol. 103, No. 44, 16472-16477; Yu Wen et al, 2006, Clinical Cancer Research, vol. 12, No. 20, 5951-5959; и Jing Luan et al, 1997, Journal of Leukocyte Biology, vol. 62, No. 5, 588-597). CXCL1 человека, в дополнение к злокачественной опухоли уротелия, дает потенциальную возможность чрезвычайно раннего и/или раннего обнаружения перечисленных выше злокачественных опухолей.

Однако, для обнаружения указанных выше злокачественных опухолей, способы количественного определения с использованием существующего в настоящее время способа иммуноферментного анализа обладают недостаточной чувствительностью. Например, в W02007/026895 описан набор для количественного определения CXCL1 человека, выпускаемый R&D SYSTEMS, Inc. (далее в настоящем документе R&D SYSTEMS), где, несмотря на то, что концентрация на пределе детекции составляет около 20 пг/мл, концентрация CXCL1 человека в моче здорового субъекта не достигает предела детекции. Следовательно, для количественного определения CXCL1 человека необходим способ с более высокой чувствительностью.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, в варианте осуществления настоящего изобретения, задачей настоящего изобретения является разработка способа иммунологического анализа для количественного определения CXCL1 человека с более высокой чувствительностью. Более конкретно, целью настоящего изобретения является осуществление способа количественного определения CXCL1 человека с более высокой чувствительностью посредством иммунологического анализа с использованием комбинации антител или участков распознавания антигена, каждый из которых специфично связывается с последовательностью в любом из 3 определенных положений в аминокислотной последовательности, составляющей CXCL1 человека.

Также, в другом варианте осуществления настоящего изобретения, задачей настоящего изобретения является создание моноклональных антител или их фрагментов, специфично распознающих CXCL1 человека. Более конкретно, другой задачей настоящего изобретения является создание моноклональных антител или их фрагментов, которые можно использовать в описанном выше способе обнаружения CXCL1 человека с более высокой чувствительностью, которые содержат новые аминокислотные последовательности, специфично распознающие CXCL1 человека, и которые обладают более высокой аффинностью к CXCL1 человека по сравнению с аффинностью традиционных антител.

Средства решения задач

В результате тщательных исследований, необходимых для достижения указанных выше задач, авторы настоящего изобретения обнаружили, что CXCL1 человека может быть определен способом с более высокой чувствительностью, чем общепринятые способы, посредством иммунологического определения с использованием комбинации моноклональных антител или участков распознавания антигена, специфично связывающихся с участком частичной последовательности в 3 определенных положениях в аминокислотной последовательности, составляющей CXCL1 человека. Также, авторы настоящего изобретения добились успехов в получении моноклональных антител, содержащих новые аминокислотные последовательности, специфично связывающиеся с частичными последовательностями в 3 положениях указанного выше CXCL1 человека и в получении гибридом, продуцирующих такие антитела. Кроме того, авторы настоящего изобретения выделили гены, кодирующие аминокислотные последовательности, содержащие антитела, и определили нуклеотидные последовательности. Это позволило получить рекомбинантные антитела и фрагменты рекомбинантных антител. Настоящее изобретение выполнено на основе указанных выше результатов с целью обеспечения следующих пунктов (1)-(15).

(1) Способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека, посредством которого CXCL1 человека или его фрагмент в образце количественно определяют, используя два или более типов моноклональных антител к CXCL1 человека или их фрагменты, где:

два или более типов моноклональных антител к CXCL1 человека или их фрагменты специфично распознают любой из участков последовательности в аминокислотных последовательностях, представленных в SEQ ID NO:1-3, которые представляют собой частичные последовательности аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека; и два или более типов моноклональных антител против CXCL1 человека или их фрагменты специфично распознают участки последовательности, которые отличаются друг от друга.

(2) Способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека по (1), посредством которого белок CXCL1 человека или его фрагмент в образце количественно определяют, используя моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает участок аминокислотной последовательности, представленный в SEQ ID NO:3.

(3) Способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека по (1) или (2), посредством которого белок CXCL1 человека или его фрагмент в образце количественно определяют, используя моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает участок аминокислотной последовательности, представленный в SEQ ID NO:1, и моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает участок аминокислотной последовательности, представленный в SEQ ID NO:3.

(4) Способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека по (1) или (2), посредством которого белок CXCL1 человека или его фрагмент в образце количественно определяют, используя моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает участок аминокислотной последовательности, представленный в SEQ ID NO:2, и моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает участок аминокислотной последовательности, представленный в SEQ ID NO:3.

(5) Способ иммунологического анализа белка CXCL1 человека по любому пункту (1)-(4), где образец представляет собой ткань, взятую после оперативного вмешательства, кровь, сыворотку, плазму крови, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, лимфу, слезную жидкость или семенную жидкость.

(6) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает частичную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, в аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека, где:

в составе легких цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6;

в составе тяжелых цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9.

(7) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по (6), содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, в вариабельной области легкой цепи и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, в вариабельной области тяжелой цепи.

(8) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает частичную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, в аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека, где:

в составе легких цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14; и

в составе тяжелых цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17.

(9) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по (8), содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, в вариабельной области легкой цепи и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19, в вариабельной области тяжелой цепи.

(10) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое специфично распознает частичную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, в аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека, где:

в составе легких цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22; и

в составе тяжелых цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25.

(11) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по (10), содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26, в вариабельной области легкой цепи и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27, в вариабельной области тяжелой цепи.

(12) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, которое специфично распознает частичную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, в аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека, где:

в составе легких цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:28, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30; и

в составе тяжелых цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:33.

(13) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по (12), содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:34, в вариабельной области легкой цепи и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:35, в вариабельной области тяжелой цепи.

(14) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, которое представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, которое специфично распознает частичную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, в аминокислотной последовательности, составляющей белок CXCL1 человека, где:

в составе легких цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:36, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:37, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:38; и

в составе тяжелых цепей, CDR1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, CDR2 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:40, и CDR3 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:41.

(15) Моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по (14), содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:42, в вариабельной области легкой цепи и аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:43, в вариабельной области тяжелой цепи.

Эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению концентрацию CXCL1 человека можно количественно определять с более высокой чувствительностью, чем чувствительность общепринятых способов. Также можно получить высокоаффинное моноклональное антитело к CXCL1 человека или его фрагмент, специфично распознающее CXCL1 человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ фигур

На фигуре 1 представлен иммунологический анализ по общепринятому способу с использованием “сэндвич” способа ELISA, в котором используют моноклональное антитело, которое специфично распознает любую из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1-3, и коммерчески доступный набор.

На фигуре 2 представлен “сэндвич” способ ELISA, в котором в качестве меченого антитела используют моноклональное антитело, которое специфично распознает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

На фигуре 3 представлен “сэндвич” способ ELISA для определения CXCL1 человека в моче с использованием моноклонального антитела, которое специфично распознает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или 2, и моноклональное антитело, которое специфично распознает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3.

На фигуре 4 представлен график, показывающий результаты определения CXCL1 человека в буфере посредством иммобилизованного коммерчески доступного антитела, которое специфично распознает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и выполнения “сэндвич” способа ELISA с использованием меченного биотином антитела по настоящему изобретению, распознающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или меченного биотином коммерчески доступного поликлонального антитела к CXCL1 человека.

На фигуре 5 представлен график, показывающий результаты определения CXCL1 человека в буфере посредством иммобилизации 5 типов антител (IgG1-1, IgG1-3, IgG1-10, IgG1-14 и IgG2b-1) по настоящему изобретению и коммерчески доступного антитела, а затем осуществления “сэндвич” способа ELISA с использованием меченного биотином поликлонального антитела к CXCL1 человека.

На фигуре 6 представлен график, показывающий результаты определения CXCL1 человека в плазме крови посредством иммобилизации 5 типов антител по настоящему изобретению и коммерчески доступного антитела, а затем осуществления “сэндвич” способа ELISA с использованием меченного биотином поликлонального антитела к CXCL1 человека.

На фигуре 7 представлен график, показывающий результаты определения CXCL1 человека в моче посредством иммобилизации 5 типов антител по настоящему изобретению и коммерчески доступного антитела, а затем осуществления “сэндвич” способа ELISA с использованием меченного биотином поликлонального антитела к CXCL1 человека.

На фигуре 8 представлено графическое изображение (1) подавления способности к инвазии у злокачественных клеток мочевого пузыря 5 типами антител по настоящему изобретению и коммерчески доступным антителом.

На фигуре 9 представлено графическое изображение (2) подавления способности к инвазии у злокачественных клеток мочевого пузыря 4 типами антител по настоящему изобретению и коммерчески доступного антитела.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее варианты осуществления изобретения будут описаны более подробно.

1. Моноклональное антитело к CXCL1 человека и его фрагмент

Используемый в настоящем описании термин “CXCL1 человека” относится к белку или его природному мутанту, содержащему аминокислотную последовательность в соответствии с NM_001511 в Genbank. Термин “природный мутант” относится к мутанту, существующему в природе. Примеры такого мутанта включают мутант, содержащий аминокислотную последовательность с делецией, заменой, добавлением или инсерцией одной или нескольких аминокислот в указанной выше аминокислотной последовательности CXCL1 человека, и мутант, идентичность аминокислотных последовательностей которого составляет 95% или более, предпочтительно 98% или более и более предпочтительно 99% или более с указанной выше аминокислотной последовательностью CXCL1 человека. В настоящем описании термин “идентичность” относится к проценту (%) общего количества аминокислотных остатков рассматриваемой аминокислотной последовательности, которые являются идентичными аминокислотным остаткам аминокислотной последовательности CXCL1 человека, где выравнивание двух аминокислотных последовательностей проводили таким образом, чтобы достичь максимально возможной степени совпадения между ними. В этом случае, выравнивание последовательностей можно выполнять, вводя или не вводя пропуски, и при расчете процента учитывают количество введенных пропусков. Также, термин «несколько» относится к целому числу между 2 и 10, такому числу, как целое число между 2 и 7, 2 и 5, 2 и 4, и 2 и 3. Конкретные примеры природного мутанта включают мутанты, созданные на основе полиморфизма, такого как SNP (однонуклеотидный полиморфизм), и мутанты, полученные при сплайсинге. Указанная выше замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену. В случае если замена является консервативной аминокислотной заменой, мутант, полученный в результате консервативной аминокислотной замены, может иметь структуру или свойства, по существу эквивалентные структуре и свойствам CXCL1 человека, который имеет указанную выше аминокислотную последовательность. В качестве консервативных аминокислот известны, например, неполярные аминокислоты (глицин, аланин, фенилаланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин и триптофан) и полярные аминокислоты (аминокислоты, отличные от неполярных аминокислот), заряженные аминокислоты (кислые аминокислоты (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) и основные аминокислоты (аргинин, гистидин и лизин)) и незаряженные аминокислоты (аминокислоты, отличные от заряженных аминокислот), ароматические аминокислоты (фенилаланин, триптофан и тирозин), разветвленные аминокислоты (лейцин, изолейцин и валин) и алифатические аминокислоты (глицин, аланин, лейцин, изолейцин и валин).

Используемый в настоящем описании термин “моноклональное антитело” относится к полипептиду, содержащему каркасную область (FR), полученную из иммуноглобулина или его фрагмента, и определяющую комплементарность область (CDR) и обладающему способностью к специфическому связыванию и распознаванию антигена. Таким образом, в настоящем изобретении термин “моноклональное антитело к CXCL1 человека” относится к полипептиду, способному к специфичному связыванию CXCL1 человека или его фрагмента и специфичному распознаванию CXCL1 человека или его фрагмента. Термин “специфичное связывание” относится к связыванию только антигена-мишени (CXCL1 человека или его фрагмента в настоящем изобретении).

Типичная молекула иммуноглобулина состоит из тетрамера, в котором две части, каждая из которой состоит из двух полипептидных цепей, обозначаемых как тяжелая цепь и легкая цепь, соединяются друг с другом посредством дисульфидной связи. Тяжелая цепь на N-конце содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и на С-конце содержит константную область тяжелой цепи (C_H). Легкая цепь на N-конце содержит вариабельную область легкой цепи (V_L) и на C-конце содержит константную область легкой цепи (C_L). Среди этих областей, особенно важными являются V_H и V_L, поскольку они вовлечены в специфичное связывание антитела. Каждая V_H и V_L содержит приблизительно 110 аминокислотных остатков, где представлены три определяющие комплементарность области (CDR1, CDR2 и CDR3), непосредственно вовлеченные в специфичное связывание антигена, и четыре каркасные области (FR1, FR2, FR3 и FR4), которые функционируют как каркасные структуры вариабельных областей. Известно, что определяющая комплементарность область формирует конформационную комплементарность с молекулой антигена и определяет специфичность соответствующего антитела (E. A. Kabat et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol. 1, eds. 5, опубликовано NIH). Тогда как в антителах одинаковых типов аминокислотные последовательности константных областей остаются почти неизменными, аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей в антителах являются высоковариабельными. Таким образом, определяющие комплементарность области также обозначают как гипервариабельные области. В вариабельной области такие определяющие комплементарность области (CDR) и каркасные области располагаются по направлению от аминоконца к карбоксиконцу в порядке FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. V_L и V_H образуют друг с другом димер таким образом, что формируется антигенсвязывающий участок в пределах молекулы иммуноглобулина. Что касается иммуноглобулинов, то известны классы IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. Антитело по настоящему изобретению может принадлежать любому из этих классов и предпочтительно представляет собой IgG.

Антитело, используемое в настоящем изобретении, можно получать от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Примеры такого животного или птицы включают мышей, крыс, морских свинок, кроликов, коз, ослов, овец, верблюдов, лошадей, кур и людей. Кроме того, “моноклональное антитело” в настоящем изобретении может быть синтезировано химически или синтезировано с использованием способа рекомбинантной ДНК. Например, рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, также включены в настоящее изобретение.

Термин “химерное антитело” относится к антителу, полученному путем замены константной области антитела константной областью другого антитела. Пример такого антитела представляет собой антитело, полученное путем замены константной области моноклонального антитела мыши к CXCL1 человека константной областью антитела человека. Более конкретный пример такого антитела представляет собой антитело, в котором V_L содержит любую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, 18, 26, 34 или 42 V_L моноклонального антитела мыши к CXCL1 человека, C_L содержит аминокислотную последовательность C_L произвольного антитела человека, и/или V_H содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, 19, 27, 35 или 43 V_H моноклонального антитела мыши к CXCL1 человека, и C_H содержит аминокислотную последовательность C_H произвольного антитела человека.

Термин “гуманизированное антитело” относится к мозаичному антителу, полученному путем искусственного комбинирования антитела, т.е. участка CDR с FR, происходящего, как правило, из не принадлежащего человеку антитела, такого как антитело мыши, и константной области антитела человека. Пример такого антитела представляет собой антитело, полученное комбинированием каждого CDR моноклонального антитела мыши к CXCL1 человека с каждой FR и константной областью произвольного антитела человека. Участки CDR в вариабельной области являются, в основном, ответственными за антигенсвязывающую специфичность антитела. Таким образом, если получают, как описано выше, рекомбинантное антитело, которое обладает характеристиками связывания, аналогичными характеристикам связывания антитела, то получение полной аминокислотной последовательности антитела не является необходимым. В частности, при использовании существующего способа рекомбинантной ДНК получают мозаичное антитело, заменяя последовательность ДНК, кодирующую каждый участок CDR, происходящий из антитела, на последовательность ДНК, кодирующую соответствующий участок CDR, происходящий из антитела человека, и затем подвергают экспрессии. Таким образом, можно получать рекомбинантное антитело, которое имитирует характеристики антитела. Такой способ обозначают как получение антитела с пересаженным CDR (Nature, 1986, Vol. 321, 522). Кроме того, если для обнаружения CXCL1 человека или его фрагмента используют антитело к CXCL1 человека или его фрагмент по настоящему изобретению, не всегда необходимо, чтобы антитело представляло собой гуманизированное антитело. При использовании способа пересаживания в антителах FR и константная область могут происходить из антитела любого, не являющегося человеком животного.

Кроме того, “антитело” в настоящем изобретении может также представлять собой антитело с множественной специфичностью. Термин “антитело с множественной специфичностью” относится к поливалентному антителу, которое представляет собой специфичное антитело, имеющее множество антигенсвязывающих участков в пределах одной молекулы, в силу чего эти антигенсвязывающие участки связывают различные эпитопы. Примером такого поливалентного антитела является биспецифическое антитело, имеющее два антигенсвязывающих участка, такое как IgG, где два антигенсвязывающих участка связывают различные эпитопы. В настоящем изобретении такое антитело с множественной специфичностью является предпочтительным, в котором антигенсвязывающие участки способны к связыванию различных эпитопов, представленных на CXCL1 человека. Эти антитела можно получать известными способами, используя метод рекомбинантной ДНК, искусственно внося изменения в IgG или подобный.

Используемый в настоящем описании термин “его фрагмент” в выражении “моноклональное антитело или его фрагмент” относится к частичной области антитела и конкретно относится к полипептидной цепи или ее комплексу с активностью, по существу эквивалентной антигенспецифичной активности связывания антитела. Примеры такого фрагмента включают часть антитела, содержащую по меньшей мере один указанный выше антигенсвязывающий участок и, конкретно, полипептидную цепь или ее комплекс, по меньшей мере с одной V_L и по меньшей мере с одной V_H. Конкретные примеры такой полипептидной цепи или ее комплекса включают множество достаточно охарактеризованных фрагментов антител и тому подобное, полученных посредством расщепления иммуноглобулина различными пептидазами. Более конкретные примеры таких фрагментов антител включают Fab, F(ab')₂ и Fab'. Fab представляет собой фрагмент, полученный расщеплением молекулы IgG папаином, который выполняет расщепление в участке, расположенном ближе к N-концевой стороне, чем дисульфидная связь в шарнирной области. Fab состоит из полипептида, содержащего V_H и C_H1, который, из трех доменов (C_H1, C_H2 и C_H3), составляющих С_H, непосредственно граничит с V_H, и легкую цепь. F(ab')₂ представляет собой димер Fab', который получен посредством расщепления молекулы IgG пепсином в участке, расположенном ближе к C-концевой стороне, чем дисульфидная связь в шарнирной области. Fab' имеет структуру, по существу эквивалентную структуре Fab, хотя его цепь H является немного более длинной, чем цепь H Fab, поскольку она содержит шарнирную часть. (Fundamental Immunology, Paul ed., 3d ed., 1993). Fab' может быть получен восстановлением F(ab')₂ в мягких условиях и последующим расщеплением дисульфидной связи в шарнирной области. Все эти фрагменты антител содержат антигенсвязывающие участки, так что они способны специфично связываться с антигенами (т.е. с CXCL1 человека или его фрагментом по настоящему изобретению).

Указанный выше “его фрагмент” по настоящему изобретению можно синтезировать химически или синтезировать, используя способ рекомбинантной ДНК. Примером такого фрагмента является фрагмент антитела, вновь синтезированного с использованием способа рекомбинантной ДНК. Конкретные примеры такого фрагмента включают, но не ограничиваются ими, молекулу мономерного полипептида, полученную искусственным связыванием одного или нескольких V_L и одного или нескольких V_H антитела по настоящему изобретению, посредством линкерного пептида или подобного, имеющего подходящую длину и последовательность, и многомерный полипептид. Примеры такого полипептида включают одноцепочечный Fv (scFv: одноцепочечный фрагмент вариабельной области) (см. каталог Pierce and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical co., Rockford, IL) и синтетические антитела, такие как диатело, триатело и тетратело. В молекуле иммуноглобулина V_L и V_H, как правило, отдельно располагаются на различных полипептидных цепях (легкая цепь и тяжелая цепь). Одноцепочечный Fv представляет собой синтетический фрагмент антитела, имеющий структуру, в которой эти вариабельные области соединены гибким линкером, имеющим достаточную длину, и связанные области располагаются в одной полипептидной цепи. В пределах одноцепочечного Fv обе вариабельные области могут объединяться друг с другом с образованием единого функционального антигенсвязывающего участка. Одноцепочечный Fv можно получить, используя известные способы, включением рекомбинантной ДНК, кодирующей одноцепочечный Fv, в фаговый геном и последующим осуществлением экспрессии ДНК. Диатело представляет собой молекулу, имеющую структуру, основанную на димерной структуре одноцепочечного Fv (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6444-6448). Например, если длина указанного выше линкера короче, чем приблизительно 12 аминокислотных остатков, то два вариабельных участка в пределах одноцепочечного Fv не могут подвергаться самообъединению. Однако два вариабельных участка являются причиной образования диатела, и конкретно, наличие двух одноцепочечных Fv является причиной для их взаимодействия друг с другом, включая объединение V_L одной цепи Fv и V_H другой цепи Fv. Следовательно, могут быть образованы два функциональных антигенсвязывающих участка (Marvin et al., 2005, Acta Pharmacol. Sin., 26: 649-658). Кроме того, к C-концу одноцепочечного Fv добавляют остаток цистеина, так что между двумя цепями Fv может быть образована дисульфидная связь и, тем самым, становится возможным создание стабильного диатела. (Olafsen et al, 2004, Prot. Engr. Des. Sel., 17: 21-27). Как описано выше, диатело представляет собой двухвалентный фрагмент антитела. Однако для каждого антигенсвязывающего участка не является необходимым связывание одних и тех же эпитопов, и они могут обладать биспецифичностью, т.е. антигенсвязывающие участки распознают и специфически связываются с различными эпитопами. Например, один антигенсвязывающий участок может включать V_L, которая содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:36, 37 и 38 (соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и V_H, которая содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:39, 40 и 41 (соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно). Другой антигенсвязывающий участок может включать V_L, которая содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:28, 29 и 30 (соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно), и V_H, которая содержит CDR, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:31, 32 и 33 (соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно). Триатело и тетратело имеют структуру тримера и тетрамера, соответственно, основанную на структуре одноцепочечного Fv аналогичным диателу образом. Триатело и тетратело представляют собой, соответственно, трехвалентный фрагмент антитела и четырехвалентный фрагмент антитела или могут представлять собой антитела с множественной специфичностью.

Кроме того, примеры указанного выше “его фрагмента” включают фрагменты антител, которые идентифицируют, используя библиотеки фаговых дисплеев (например, см. McCafferty et al., 1990, Nature, Vol. 348, 522-554), и которые обладают антигенсвязывающей способностью. Кроме того, см. также, например, Kuby, J., Immunology, 3^rd ed., 1998, W. H. Freeman & Co., New York.

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту с аминокислотными последовательностями, составляющими вариабельные области с желаемой активностью связывания с CXCL1 человека и его CDR. Конкретно, настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, содержащему вариабельную область иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO:4-43.

В антителе или его фрагменте по настоящему изобретению CDR1, CDR2 и CDR3 в составе легких цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:4, 5 и 6, и CDR1, CDR2 и CDR3 в составе тяжелых цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:7, 8 и 9.

Также, в антителе или его фрагменте по настоящему изобретению V_L и V_H могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:10 и 11.

В антителе или его фрагменте по настоящему изобретению CDR1, CDR2 и CDR3 в составе легких цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:12, 13 и 14, и CDR1, CDR2 и CDR3 в составе тяжелых цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:15, 16 и 17.

Также, в антителе или его фрагменте по настоящему изобретению V_L и V_H могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:18 и 19.

В антителе или его фрагменте по настоящему изобретению CDR1, CDR2 и CDR3 в составе легких цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:20, 21 и 22, и CDR1, CDR2 и CDR3 в составе тяжелых цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:23, 24 и 25.

Также, в антителе или его фрагменте по настоящему изобретению V_L и V_H могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:26 и 27.

В антителе или его фрагменте по настоящему изобретению CDR1, CDR2 и CDR3 в составе легких цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:28, 29 и 30, и CDR1, CDR2 и CDR3 в составе тяжелых цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:31, 32 и 33.

Также, в антителе или его фрагменте по настоящему изобретению V_L и V_H могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:34 и 35.

В антителе или его фрагменте по настоящему изобретению CDR1, CDR2 и CDR3 в составе легких цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:36, 37 и 38, и CDR1, CDR2 и CDR3 в составе тяжелых цепей могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:39, 40 и 41.

Также, в антителе или его фрагменте по настоящему изобретению V_L и V_H могут содержать аминокислотные последовательности, представленные, соответственно, в SEQ ID NO:42 и 43.

Антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно модифицировать. Термин “модифицированный или модификация”, используемый в настоящем описании, относится как к функциональной модификации, необходимой для антитела или его фрагмента по настоящему изобретению для обеспечения активности специфического связывания с CXCL1 человека (например, гликозилирование), так и к модификации мечения, необходимой для определения антитела или его фрагмента по настоящему изобретению. Примеры упомянутых выше меток для антитела включают флуоресцентные красители (FITC, родамин, Texas red, Cy3 и Cy5), флуоресцентные белки (например, PE, APC и GFP), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и глюкозооксидаза) и биотин или (стрепт)авид