Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления

Способ диагностики онкологических заболеваний и иммуноферментный набор для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицинской диагностики, иммунологии и онкологии, в частности к новым онкомаркерам, полезным при ранней диагностике онкологических заболеваний, и способам диагностики онкологических заболеваний. Более конкретно, настоящее изобретение относится к одному из новых универсальных онкомаркеров опухолевых процессов, а именно к аутоантителам против плазминогена или его фрагментов, вырабатываемых в человеческом организме при наличии опухолевого процесса. Изобретение относится также к способам диагностики онкологических заболеваний при помощи выявления названных антител в образце плазмы крови человека. Предложен также набор для иммуноферментного определения указанных аутоантител. Изобретение относится также к антигенам, связывание которых с аутоантителами человека является диагностическим признаком онкологического заболевания.

Терминология

Технические и научные термины, использованные в описании изобретения, имеют тот же смысл и значение, которые обычно применяются в соответствующих областях науки и техники.

Термин "антиген", используемый в изобретении, относится к белкам или их фрагментам, способным связываться с антителами.

Термин "крингл" относится к белковому домену, имеющему структуру, стабилизированную тремя дисульфидными связями.

Термин "домен" относится к участку белка, характеризующемуся определенными структурными или функциональными свойствами.

Термин "иммуноферментный анализ" относится к методам выявления высокомолекулярных соединений, включающий в себя стадии: (а) стадию контактирования антигена с биологическим образцом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.

Термин «онкомаркер» относится к высокомолекулярным соединениям определенной структуры, выявление которых в образцах тканей человека ассоциировано с онкологическими заболеваниями.

Термин «эпитоп» в настоящем изобретении относится к участку белковой молекулы, который способен образовать связь с антителом.

Термин «антитело человека» относится к антителу, обладающему аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком.

Термин «аутоантитела» (аутоагрессивные антитела, аутологичные антитела) - антитела, способные взаимодействовать с аутоантигенами, то есть с антигенами собственного организма.

Уровень техники

Необходимость поиска новых онкомаркеров для проведения диагностики онкологических заболеваний на возможно более ранних сроках не вызывает сомнений. Протекание опухолевых процессов в организме может быть обусловлено различными причинами, и соответственно для их специфической диагностики требуется применение множества различных маркеров, специфичных к каждому виду опухоли. Таким образом, наиболее полезными при ранней диагностике онкологических заболеваний являются универсальные онкомаркеры, появление которых ассоциировано с начинающимся опухолевым процессом любой природы.

Согласно работам Фолкмана, нормальное развитие организма происходит при балансе ангиогенной и антиангиогенной систем. Известно, что опухолевая ткань содержит значительно больше сосудов и капилляров, чем окружающая здоровая ткань. По этим сосудам к быстро растущим опухолевым клеткам поступают питательные вещества и кислород, необходимые им для деления. (Folkman J. ngiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med 1995; 1:27-31. Folkman J. Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res 1985; 43:175-203). Также известно, что раковые клетки в минимальном транзиторном количестве всегда присутствуют в организме, и если возникают условия подходящие для их развития (достаточное количество сосудов, соответствующее микроокружение, и их объем превышает 2 mm²), то опухоль начинает быстро развиваться. Обзор механизмов ангиогенеза и его участия в опухолеобразовании дан в публикации PCT WO 95/29242.

В последнее время в онкогенезе и других системных заболеваниях также активно исследуется роль сериновых протеаз. Секреция опухолевыми клетками сериновых протеаз приводит к разрушению нормальной архитектуры ткани, облегчая инфильтрацию этих клеток в ткани хозяина. Эти ферменты, как эндогенные, так и экзогенные, способны удалять с поверхности клеток определенные белки, что приводит к ликвидации контактного торможения, росту и изменению адгезивных свойств клеток. Сериновые протеиназы, секретируемые из опухолевой ткани в интерстициальную жидкость, могут разрушать первичные мембраны капилляров, способствуя проникновению раковых клеток через стенку сосудов к тканям хозяина и образованию метастазов. Особое внимание, в классе сериновых протеаз было привлечено к системе плазминоген/плазмин. Ангиостатин, а также некоторые другие продукты деградации плазминогена являются компонентами антиангиогенной системы.

Плазминоген - неактивный предшественник основного фермента фибринолиза, плазмина - обнаружен во всех биологических жидкостях организма, некоторых тканях и компонентах крови. Плазмин относится к эндопептидазам - сериновым протеазам трипсиноподобного действия. Физиологическое действие плазмина направлено на поддержание баланса системы свертываемости крови. Плазмин обычно получают из плазминогена путем его активации стрептокиназой, урокиназой. Система плазминоген/плазмин принимает активное участие не только в процессах фибринолиза, но и тесно связана с канцерогенезом. Продемонстрирована тесная взаимосвязь между плазмином и металлопротеазами, которые являются активными участниками онкогенеза (Yves A. DeClerck and Walter Е. Laug: Plasminogen: Structure, Activation, and Regulation, edited by David M. Waisman. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 2003). Функционально значима не только нативная молекула плазминогена (плазмина), но и целый спектр продуктов ее деградации. Ферментативно деградированные формы плазмина по своему действию на низкомолекулярные субстраты даже превосходят цельную молекулу (Ю.Г. Клысь, Н.В. Зайцева, А.И. Кизим, С.В. Веревка. Протеолитические производные плазминогена при развитии злокачественных новообразований, Онкология, Т12, №1, 2010).

В процессе деградации молекулы плазминогена (плазмина) можно получить легкую и тяжелую цепи. Легкая цепь плазмина содержит активный центр, характерный для всего класса сериновых протеаз, и может принимать участие во всех свойственных им процессах. Тяжелая цепь содержит пять крингловых структур. Каждый из этих кринглов или их комбинация имеет свою функциональную специализацию. Описаны варианты существования этих кринглов в плазме: K1-3; K2-3; K1-4; K1-4,85; K1-5 и отдельные кринглы (Perri S, Martineau D, Francois M, et al. Plasminogen kringle 5 blocks tumor progression by antiangiogenic and proinflammatory pathways. Mol Cancer Ther 2007; 6: 441-9). Известно, что все кринглы, а также их комбинации, принимают активное участие в ангиогенезе и онкогенезе. Наиболее изучена функциональная активность первых четырех кринглов (K1-4). Последовательность из этих кринглов представляет ангиостатин (Francis J. Castellino, Victoria A. Ploplis, Structure and function of the plasminogen/plasmin system, Thromb Haemost 2005; 93: 647-54; C. Boccaccio and Paolo M. Comoglio Cancer Res 2005; 65(19): 8579-82; Rijken DC, Lijnen HR. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost 2009; 7: 4-13).

Раскрытие изобретения

Используя протеомные методы исследования, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что плазма крови больных, страдающих различными формами онкологических заболеваний, содержит определенные белки, наличие которых в норме не выявлено. 90% этих белков после масспектрометрической идентификации были определены как фрагменты плазминогена с молекулярной массой меньше 55 кДа. Среди них были фрагменты с молекулярной массой приблизительно 38 кДа, что характерно для ангиостатина, а также иммуноглобулины.

Авторы изобретения предположили, что в зоне хронического воспаления клетки образовываются определенные пептиды, на появление которых организм человека отвечает выработкой аутоантител. Эти аутоантитела, в свою очередь, могут оказывать ингибирующие действие на ангиостатин и другие производные плазминогена, и таким образом смещают баланс в пользу ангиогенной системы, а избыточная сосудистая сеть и является одним из условий, приводящих к возникновению и быстрому развитию опухоли. Эксперименты, проведенные авторами изобретения, показали, что обнаруженные ими иммуноглобулины являются антителами человека против собственного плазминогена и различных продуктов его деградации, в частности ангиостатина. Повышение титра аутоантител к плазминогену и/или продуктам его деградации в плазме является маркером протекания опухолевого процесса на его ранней стадии, и измерение содержания уровня данных аутоантител в плазме крови является диагностическим признаком развивающегося опухолевого процесса.

Опухоли внутренних органов четких симптомов начала патологического роста обычно не имеют. Злокачественный рост в них чаще начинается на фоне хронического воспалительного процесса, без ярких симптомов. Симптомы зависят от локализации и размеров раковой опухоли, а также от того, насколько поражены окружающие органы или ткани человеческого организма. Уже образовавшаяся злокачественная опухоль в I и II стадии роста чаще всего безболезненна, без ярко выраженной симптоматики.

Для развивающего опухолевого процесса описан ряд малых неспецифических симптомов - "синдром малых признаков", одновременное наличие которых у больного является специфическим для злокачественной опухоли: немотивированная слабость, быстрая утомляемость, похудание, анемия (малокровие, проявляющееся бледностью), психическая депрессия. В зависимости от локализации процесса в дополнение к перечисленным признакам появляются другие характерные признаки (А.И. Савицкий. «Вопросы онкологии», 1967. т.13, №8).

Неспецифическая симптоматика является показанием для проведения тщательного обследования пациента, в том числе путем лабораторного исследования плазмы крови для раннего обнаружения онкомаркеров согласно настоящему изобретению.

Поскольку аутоантитела к плазминогену являются поликлональными и молекула плазминогена содержит множество эпитопов, к которым могут быть выработаны аутоантитела, авторы изобретения предлагают использовать различные части молекулы плазминогена для определения титра аутоантител в целях ранней диагностики онкологических заболеваний. В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные, раскрывающие существование взаимосвязи между появлением в плазме крови аутоантител к плазминогену и/или продуктам его деградации при онкологических заболеваниях.

По своей химической природе плазминоген является гликопротеином, молекула которого содержит 791 аминокислотных остатков и 24 дисульфидных мостика. Белок состоит из одной полипептидной цепи, где N-концевой аминокислотой является глютамин, C-концевой аспарагин. В состав молекулы входит 2%-3% углеводов, локализованных в тяжелой цепи. Олигосахариды присоединяются к Асп288 и Тре345. При активации плазминогена, происходит расщепление пептидной связи Арг560-Вал561 и образуются две цепи, легкая и тяжелая, соединенные дисульфидными связями. В легкой цепи (Вал561-Асн790) находится активный протеазный центр, включающий аминокислотную последовательность: серии, гистидин, аспарагин. В тяжелой цепи плазмина (Лиз78-Арг560) имеется 5 близких по аминокислотной последовательности петлеобразных участка - доменов или кринглов, которые представляют собой компактные структуры глобулярного типа с хорошо выраженным гидрофобным ядром. Подобные структуры принимают участие в осуществлении белковых взаимодействий в процессе свертывания крови. Кринглы тяжелой цепи обозначаются K1, K2, K3, K4, K5. В доменах K1-4 локализованы специфические участки, обладающие сильным сродством к лизину, ε-аминокапроновой кислоте, парааминобензойной кислоте и другим ω-карбоновым аминокислотам, обладающими антифибринолитическими свойствами. Лизинсвязывающие участки (ЛСУ) играют важную роль во взаимодействиях между плазмином (плазминогеном) и фибрином, а также плазмином и его ингибитором - ą2-АП (антиплазмин). Любой из фрагментов плазминогена, содержащий крингл, независимо от того, является ли он продуктом естественного расщепления в организме человека или получен в результате расщепления плазминогена in vitro (например, в результате ферментативного воздействия), может быть использован для выявления аутоантител, ассоциированных с онкологическим заболеванием.

Для определения титра аутоантител при онкологических заболеваниях, включающих эпителиальные, соединительнотканные опухоли, опухоли нервной и костной ткани и др., в качестве лиганда, используются фрагменты расщепления плазминогена.

Кринглы плазминогена и различные продукты его расщепления: легкая или тяжелая цепь, и любой из фрагментов, содержащий крингл, могут быть использованы в качестве антигена для создания набора иммуноферментного анализа, определяющего титр аутоантител классов IgG, IgA и IgM к плазминогену человека и его частей в образцах плазмы крови человека. Данные антигены являются производными нативного Glu-плазминогена, либо могут быть получены с помощью генно-инженерных методов, путем синтеза рекомбинантного пептида в эукариотических или бактериальных системах экспрессии. Рекомбинантные антигены соответствуют аминокислотной последовательности плазминогена человека. В частности, антигеном для осуществления раскрытого в изобретении способа диагностики, кроме полноразмерного плазминогена, могут являться также его следующие фрагменты: тяжелая цепь (Glu-H), тяжелая цепь (Lys-H), легкая цепь (L), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530), K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glul64), K2-3 (Cys165-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин, а также любые их сочетания. (Таблица 1.)

Авторы изобретения впервые неожиданно обнаружили и экспериментально подтвердили, что фрагменты плазминогена могут быть использованы в качестве антигенов для определения титра аутоантител человека при постановке иммуноферментной реакции, где исследуемым образцом является образец плазмы крови человека, и результат данной реакции может быть использован для диагностики наличия опухолевого процесса у исследуемого субъекта. Так как раскрытый в настоящем изобретении способ диагностики основан на использовании строго определенных полипептидов, определяемых конкретными аминокислотными последовательностями, квалифицированному специалисту в данной области техники очевидно, что аналогичным образом могут быть использованы любые белки и пептиды, имеющие в своем составе аминокислотные последовательности, идентичные раскрытым в изобретении. Специалисту очевидно также, что в качестве антигенов по настоящему изобретению могут быть использованы любые полипептиды, обладающие частичной гомологией (90% и выше) с заявленными полипептидами, так как замена отдельных аминокислот, не изменяющая пространственной структуры крингла, не является препятствием для образования комплекса антиген-антитело. Применяемые антигены являются специфичными для онкозаболеваний и данных о наличии аутоантител к этим антигенам при других патологиях на сегодняшний день не обнаружено. Настоящие сведения (изобретение) не может быть создано путем объединения сведений, ставших доступными специалисту до даты подачи данного изобретения.

Осуществление изобретения.

Плазминоген и его фрагменты, раскрытые в настоящем изобретении (табл.1), были получены генноинженерным способом, либо очищены из плазмы крови и использованы в качестве антигенов для создания наборов для иммуноферментного анализа для определения уровня аутоантител класса IgG, IgA, IgM к плазминогену и/или его фрагментам в крови пациентов с различными формами злокачественных опухолей, подтвержденных альтернативными методами диагностики. В связи с тем, что рост любых солидных опухолей сопровождается усиленным сосудообразованием, в районе опухоли, как правило, происходит накопление плазминогена и продуктов его распада, что приводит к накоплению аутоантител. Таким образом, несомненным преимуществом раскрытого в настоящем изобретении маркера является его универсальность, так как появление аутоантител у человека ассоциировано с развитием у него опухолевого процесса любой природы. Приведенные примеры подтверждают, что аутоантитела к плазминогену и/или его фрагментам присутствуют в плазме крови больных людей независимо от локализации опухоли.

Выделение антигенов для проведения иммуноферментного анализа.

Получение Тяжелой цепи (Glu-H) Glu¹-Arg⁵⁶¹ и Легкой цепи (L) Val⁵⁶²-Asn⁷⁹¹ цепи плазминогена.

Принцип метода состоит в активации плазминогена в плазмин с последующим восстановлении S-S-связей между тяжелой и легкой цепями в условиях, исключающих автолиз, и выделении фрагментов аффинной хроматографией на Lys-Сефарозе 4B. Урокиназа разрывает активационную связь Arg₅₆₁-Val₅₆₂ в плазминогене. Образующийся плазмин разрывает связь 77-78 и отщепляется N-терминальный пептид (1-77). Меркаптоэтанол восстанавливает связи Cys₅₅₈-Cys₅₆₆ и Cys₅₄₈-Cys₆₆₆, соединяющие тяжелую и легкую цепи.

Первый этап: выделение достаточного количества Glu-Pg из плазмы крови. Glu-Плазминоген выделяли из замороженной донорской плазмы крови человека с помощью аффинной хроматографии на Lys-сефарозе 4B при 4°C и pH 8,0. Плазму крови размораживали в присутствии апротинина, центрифугировали 30 min при 4°C и разбавляли в 2 раза 0,02 M K-фосфатным буфером, pH 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Подготовленную плазму наносили на колонку с Lys-сефарозой 4B, уравновешенную 0,1 M K-фосфатным буфером, pH 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин. Колонку промывали от несвязавшихся белков 0,3 M K-фосфатным буфером, pH 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин, в течение ночи под свободным протоком до A₂₈₀=0,05-0,01. Сорбированный Glu-Pg элюировали раствором 0,2 M 6-аминокапроновой кислоты 0,1 M K-фосфатном буфере, pH 8,0, содержавшем 20 KIU/ml апротинин. Фракции, содержавшие белок, объединяли и подвергали дополнительной очистке осаждением (NH₄)₂SO₄ (0,31 g/ml раствора белка). Осадок оставляли при 4°C на 18-24 часа, после чего отделяли центрифугированием и растворяли в 0,05 M Трис-HCl буфере, pH 8,0 до концентрации порядка 1,5-2,0 mg/ml. Очищенный Glu-Pg диализовали при 4°C против воды (pH 8,0) и лиофилизировали.

Второй этап: получение двухцепочечного плазмина путем активации одноцепочечного Glu-Pg урокиназой (фирмы "Wakamoto Pharmaceutical Co. Ltd." (Корея). К раствору Glu-Pg (5 mg/ml) в 0,05 М Трис-HCl буфере, pH 8,8, содержавшем 0,02 М L-лизин, 0,15 М NaCl, 20% глицерин и 6000 KIU/ml апротинина, добавляли урокиназу до конечной концентрации 600 IU/ml и инкубировали 4 часа при 37°C. Полноту превращения Glu-Pg в плазмин контролировали по росту до максимального значения скорости гидролиза специфического субстрата плазмина S-2251 (HD-Val-Leu-Lys р-nitroanilide, "Sigma", США) в пробах, отобранных из реакционной смеси.

Третий этап: восстановление S-S-связей между тяжелой и легкой цепями плазмина. К полученному раствору плазмина добавляли меркаптоэтанол до конечной концентрации 0,25 mM и инкубировали в токе азота в темноте в течение 20 мин. Образовавшиеся свободные SH-группы блокировали, инкубируя реакционную смесь со свежеприготовленным раствором йодоуксусной кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 8,0 (конечная концентрация 0,315 M) и инкубировали 20 мин.

Четвертый этап: разделение тяжелой и легкой цепей плазмина хроматографией на колонке с Lys-Сефарозе 4B. Реакционную смесь разбавляли до концентрации 1 мг/мл 0,1 M Na-фосфатным буфером, pH 8,0, содержавшим 20 KIU/ml апротинин и наносили на колонку с Lys-Сефарозой 4B, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили при 25°C. Тяжелая цепь плазмина, содержащая кринглы 1-5 и 30 аминокислотных остатков соединительного пептида, сорбируется на аффинном носителе, а легкая цепь не сорбируется и элюируется уравновешивающим буфером Тяжелую цепь (M_r ~56-57 kDa) элюировали раствором 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 8,0. Объединенные фракции диализовали против воды (~pH 8,0) и высушивали лиофильно. При необходимости препарат растворяли в 0,05М Трис-HCl буфере, pH 7,4 и дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75 (1,65×80 cm). Объединенные фракции белкового пика диализовали против воды pH 8,0 и лиофилизировали.

Чистоту и молекулярную массу препаратов оценивали методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии 0,1% SDS. Кроме того,, отсутствие амидазной активности (по S-2251) до и после инкубации ее раствора со стрептокиназой свидетельствовало, что тяжелая цепь не содержит следовых концентраций мини-плазминогена, которые могли не обнаружиться при электрофорезе.

Получение Lys-плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹) и Тяжелой цепи (Lys-H Lys⁷⁸-Arg⁵⁶¹) проводили тем же самым методом, только без добавления ингибитора - апротинина.

Получение миниплазмина (Val⁴⁴²-Asn⁷⁹¹) Миниплазмин включает в себя K5 и легкую цепь плазмина. Его последовательность начинается от Val⁴⁴² и до Asn⁷⁹¹ включительно. Получается он при эластолизе Lys-плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹) дальнейшей доочисткой гель-фильтрацией на сефодексе G-75.

Получение крингла K1-4,5 (Lys⁷⁸-Arg⁵³⁰) проводили по методике, описанной в работе Сао R., Wu H.L., Veitonmaki N., Linden P., Farnedo J., Shi C.Y., and Cao Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,. 96, 5728-5733., с некоторыми модификациями. Glu-плазминоген (10 мг/ мл) активировали урокиназой (600 МЕ/мл) в 0,05 М фосфатном буфере pH 9,0, содержащем 0,02 М L-лизин и 0,1 М NaCL, при 37°. Полноту превращения плазминогена в плазмин контролировали по увеличению амидазной активности раствора до максимального значения. К раствору плазмина добавляли равный объем 0.2 М глицеринового буфера, pH 12,0 и инкубировали в течение 18 ч при 25° и конечном значении pH 10,5. Реакционную смесь разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 0,1 М фосфатный буфер, pH 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, и наносили на колонку с Lys-сефарозой 4B, уравновешенную тем же буфером. После выхода микро-плазмина, сорбированный ангиостатин K1-4,5 элюировали с колонки 0,2 М раствором 6-аминокапроновой кислоты в 0,1 М фосфатный буфер, PH 8,0 и 40 KIU/мл апротинина, диализовали против воды и лиофилизировали. Чистоту препарата проверяли с помощью SDS-ПААГ-электрофореза в 12%-ном геле. Кроме того, K1-4,5 может быть естественным продуктом, включающим кринглы 1-4 плюс 85% K5, (Lys⁷⁸-Arg⁵³⁰). Плазмин превращается в K1-4,5 в две стадии. Сначала плазминоген переходит в плазмин, затем плазмин подвергается аутопротеолизу внутренней петли 5 крингла. Аутопротеолиз может быть вызван свободными сульфгидрильными донорами или щелочной средой. Кроме того, такая деградация плазмина происходит при добавлении к субстрату концентрированной ростовой среды клеток HT 1080, а также ряда других культивированных опухолевых клеток. В этот процесс вовлечена плазмин-редуктаза, которая содержится в ростовой среде опухолевых клеток (Paul Stathakis, Angelina J. Lay, Melinda Fitzgerald, Christian Schlieker, Lisa J. Matthias and Philip J. Hogg, Angiostatin Formation Involves Disulfide Bond Reduction and Proteolysis in Kringle 5 of Plasmin, J. Biol. Chem. Vol.274, No. 13, Issue of March 26, pp.8910-8916,1999; Soff G. A. Angiostatin and angiostatin-related proteins, Cancer Metastasis Rev., 19: 97-107, 2000; Hao Wang, Ryan Schultz, Jerome Hong, Deborah L. Cundiff, Keyi Jiang, and Gerald A. Soff, Cell Surface-Dependent Generation of Angiostatin4.5, Cancer Res January 1, 2004 64; 162).

Получение кринглов K1-4(Tyr⁸⁰-Ala⁴⁴⁰) и K1-3(Tyr⁸⁰-Val³³⁸) K4-5(Val³⁵⁵-Phe⁵⁴⁶) проводили при помощи гидролиза Glu-плазминогена эластазой по методу, описанному в работах Cao Y., Ji R. W., Davidson D., Schaller J., Marti D., Sohndel S., McCanse S.G., O'Reilly M.S., Llinas M., and Folkman J. (1996) J. Biol. Chem., 271, 29461-29467. Glu-плазминоген инкубировали с эластазой при соотношении 50:1 (М/М) в буфере, содержащем 0,05 М Трис-HCl, pH 8,5, 0,5 М NaCl и 200 KIU апротинина, в течение 5 часов при комнатной температуре. Реакцию эластолиза останавливали трехкратным добавлением PMFS для поддержания его концентрации 1 мМ в течение 40-50 мин. Затем проводили гель-фильтрацию смеси на колонке с сефадексом G-75 для отделения низко- и высокомолекулярных примесей. Белковые фракции второго пика, содержащего K1-3, K1-4, K4-5 и Миниплазмин, наносили на аффинную колонку с Lys-сефарозой 4B, уравновешенную буфером с 0,05 М Трис-HCl, pH 8,5 и 0,15 М NaCl. После выхода миниплазмина, который не сорбируется на носителе, сорбированные фрагменты K1-3, K1-4 и K4-5 элюировали раствором 0,2 М 6-аминокапроновой кислоты в том же буфере, диализовали против буфера содержащего 0,02 М Трис-HCl, pH 8,0 и наносили на колонку с гепарин-агарозой, уравновешенной тем же буфером. После элюции несвязавшегося с носителем фрагмента K1-4 и K4-5 уравновешивающим буфером, фрагмент К1-3 элюировали раствором 0,25 М KCl в том же буфере. Полученные фрагмент K1-3 диализовали против воды и лиофилизовали. K1-4 и K4-5 разделяли с помощью гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-75.

Получение кринглов K5 (Ser⁴⁴⁹(Pro⁴⁵²)-Fhe⁵⁴⁶), K1-3(Tyr⁸⁰-Val³³⁸), K-4 (Val³³5-Ala⁴⁴⁰)согласно работе Cao, Y., Chen, A., An, S.S.A., Ji, R.W., Davidson, D., and Llinas, M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 22924-22928). Использовался метод ограниченного эластолиза Lys-Плазминогена (Lys⁷⁸-Asn⁷⁹¹). После обработки эластазой смесь наносили на колонку Mono-S (Bio-Rad) уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ NaOAc, pH 5.0. Связавшиеся фрагменты градиентно элюировали буфером, содержащем 20 мМ NaOAc, 1 М KCl, pH 5.0. Были использованы градиент 0-20%, 20-50%, 50-70%, и 70-100%. K-5 сходил при 50% градиенте. По этой же схеме, но в другом градиенте получили K-4 (Val³³⁵- Ala⁴⁴⁰⁾ крингл и крингл K1-3 (Tyr⁸⁰-Val³⁵⁴)

Вариант получения K5 (Val⁴⁴²-Arg⁵⁶¹) заключается в предварительном получении эластолизом миниплазмина (Val⁴⁴²-Asn⁷⁹¹), содержащего 5-крингл тяжелой цепи, с дальнейшей обработкой этого фрагмента пепсином и после этого использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии согласно работе (Theresa Thewes, Vasudevan Ramesh, Elena L. Simplaceanu and Miguel Llinfis, Isolation, purification and I H-NMR characterization of a kringle 5 domain fragment from human plasminogen, Biochimica et Biophysica Acta 912 (1987), 254-269).

Кринглы K1-4 (Lys⁷⁸-Pro⁴⁴⁶) и K1-4 (Lys⁷⁸-Lys⁴⁶⁸) получались согласно методу Patterson, В.С. and Sang, Q A. (1997) J. Biol. Chem. 272, 28823-28825 с использованием металлопротеиназ.

Крингл K1-4 (Asn⁶⁰-Pro⁴⁴⁷) получен по методу Lijnen, Н.R., Ugwu, F., Bini. A., and Collen, D. (1998) Biochemistry 37, 4699-4702 с использованием металлопротеиназ.

Кринглы K1 (Tyr⁸⁰-Glu¹⁶⁴) и K2-3 (Cys¹⁶⁵-Val³³⁸) были изолированы из K1-3 (Tyr⁸⁰-Val³³⁸) путем обработки его пепсином (или протеазой s.aureus V8) с дальнейшим разделением на lys-Sepharose и гель-фильтрации на Sephadex G-75.

Изготовление диагностической тест-системы для иммуноферментного определения аутоантител

В качестве антигенов для иммуноферментного определения аутоантител использовались полноразмерный плазминоген или его фрагменты, содержащие хотя бы один крингл. Различные виды антигенов, использованные в иммуноферментном анализе для проведения диагностики, перечислены в табл.1. Их первичная аминокислотная последовательность приведена в перечне последовательностей.

Антиген разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,6 в максимальной концентрации 5 мкг/мл для молекул с молекулярным весом более 25 кДа и 10 мкг/мл для молекул с молекулярным весом менее 25 кДа. Данные разведения антигена использовались для определения всех видов иммуноглобулинов.

PBS (phosphate buffered saline, фосфатный солевой раствор):

0,14М NaCl; 0,003М KCl; 0,005М Na2HPO4; 0,002М KH2PO4

Приготовление 1 л 10x PBS:

80г - NaCl 2 г - KCl 18г - Na2HPO4 2 г - KH2PO4

Субстратный буферный раствор (pH 4,3): 31 мМ лимонная кислота, 0,05н NaOH, 3 мМ H202

Раствор ТМБ: 5 мМ 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 70% ДМСО

Субстрат-хромогенный раствор (готовится перед употреблением): смешать 4 части субстратного буферного раствора и одну часть раствора ТМБ.

При создании набора для иммуноферментного анализа проводили предварительную иммобилизацию антигена. Для иммобилизации антигена могут быть использованы различные виды носителей, например нитроцеллюлоза, стеклянные бусы или другие частицы, способные сорбировать белки, иммунологические стрипы или планшеты. На иммунологический планшет в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антигена. Инкубация проводилась в течение 14-16 часов при 4°C во влажной камере. Содержимое лунок удаляли путем вытряхивания, затем планшет дважды промывали раствором, содержащим однократный PBS с 0,05% Tweeen-20, по 200 мкл/на лунку для удаления несвязавшегося антигена. В качестве блокирующего раствора использовали 1% раствор желатина в PBS, по 200 мкл/лунка с инкубацией в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации блокирующую жидкость удаляли, планшет сушили в течение ночи при комнатной температуре и затем использовали в дальнейшей работе.

Исследуемые и контрольные образцы плазмы крови разводили в 100 раз разводящим буфером (0,5% Желатин, 0,001М ЭДТА в PBS), вносили по 100 мкл в соответствующие лунки планшета и инкубировали 1 час при 37°C. После окончания инкубации содержимое лунок удаляли, планшет промывали 4 раза промывочным раствором (PBS с 0,05% Tween-20), каждый раз тщательно удаляя содержимое лунок. Рабочее разведение коньюгата (для определения IgG, IgA, IgM в качестве коньюгата использовали соответственно Mab Fc IgG-peroxidase, Mab Fc IgA-peroxidase, Mab IgM-peroxidase) вносили в соответствующие лунки планшета по 100 мкл/лунка и снова инкубировали 1 час при 37°C. Несвязавшиеся компоненты удаляли 4-х кратной промывкой планшета промывочным раствором. Затем во все используемые лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенного раствора и инкубировали 15 минут при 37°C. Реакцию останавливали, внося во все используемые лунки по 100 мкл стоп-раствора (2М H₂SO₄). Фотометрию проводили на фотометре вертикального сканирования «УНИПЛАН» (фирма «ПИКОН», Россия) с длиной волны 450 нм.

Проведение диагностики онкологических заболеваний при помощи иммуноферментного детектирования аутоантител к плазминогену и/или его фрагментам

Образцы крови больных забирали из локтевой вены с помощью вакутейнеров с цитратом натрия. Затем образцы центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 15 мин. Плазму разливали в пробирки по 100 мкл, замораживали и хранили при температуре -40°.

Контрольную группу составляли образцы плазмы, взятые от 30 здоровых мужчин и 30 здоровых женщин на станции переливания крови. Каждый образец был отрицателен в тестах на гепатиты A, B, C, вирусы ВИЧ, а также туберкулез и сифилис.

Уровень аутоантител класса IgG и IgA в контрольных образцах измерялся при помощи иммуноферментного набора согласно описанной методике. Разведение контрольных образцов плазмы подбиралось таким образом, чтобы оптическая плотность была не более 0,2.

При проведении иммуноферментного анализа контрольных проб опытным путем установлено разведение 1/100, которое в дальнейшем использовалось для анализа всех проб. В качестве антигена использовалась фрагменты плазминогена. Для точности измерения уровень аутоантител в каждой пробе проверяли в дубле. После измерения 30 мужских и 30 женских контрольных проб был вычислен средний уровень оптической плотности для каждой контрольной группы, используемой для тестирования различных фрагментов плазминогена в качестве лиганда.

Иммуноферментный тест контрольных проб проводился с каждым отдельно взятым антигеном. Количество проб выше среднего значения в мужской группе было в пределах от 2% до 5%, а в женской от 3% до 6% при тестировании со всеми исследуемыми антигенами. Для сравнительного исследования контрольной группы с образцами проб больных раком из контрольной группы были взяты 5 образцов с показателями оптической плотности, отличающихся не более 5% от среднего. Эти 5 проб были объединены в одну пулированную пробу - контрольную пробу (K), использованную в качестве эталона уровня аутоантител к плазминогену. Пробы K были разными при исследовании аутоантител класса IgG и IgA.

Примеры

Пример 1. Выявление аутоантител IgG и IgA при раке простаты

Пациенты были разделены на 2 группы по 10 человек в каждой. Первая группа была с подтвержденным диагонозом, сделанном на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим подтверждением и онкологических маркеров (ПСА). Вторая группа состояла из пациентов с подозрением на злокачественный процесс, основанном только на осмотре лечащего врача без гистологического подтверждения и показателей онкологических маркеров.

Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб, взятых у больных раком простаты, и контрольного образца проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА на 20% и более оптической плотности контрольной пробы.

Результаты

В первой группе сопоставление результатов анализов, сделанных по нашей методике с использованием следующих конструкций: тяжелой цепи (Glu-H), тяжелой цепи (Lys-H), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530), совпал с поставленными верифицированными диагнозами у 9 больных из 10 для IgG и 6 из 10 для IgA.

При использовании в качестве антигена легкой цепи (L) у 6 из 10 для IgG и 5 из 10 для IgA.

При использовании конструкций: K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glu164), K2-3 (Cys165-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин у 5 из 10 для IgG и 4 из 10 для IgA.

Во второй группе, состоящей из 10 пациентов, с подозрением на злокачественный процесс, у 7 был поставлен диагноз рака простаты на основании наших анализов для IgG и у 5 для IgA. В дальнейшем он был подтвержден гистологией.

У 2 пациентов после гистологии диагноз рака простаты не подтвердился, что также совпало с результатами нашего теста. При этом были использованы конструкции тяжелой цепи (Glu-H), тяжелой цепи (Lys-H), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530) для IgG. При определении IgA расхождений с поставленными диагнозами было значительно больше. У одного больного при определении аутоантител класса IgG наши результаты не совпали с результатами гистологического исследования.

При использовании в качестве антигена легкой цепи (L) у 5 из 10 для IgG и 4 из 10 для IgA.

При использовании конструкций: K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glul64), K2-3 (Cysl65-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин у 5 из 10 для IgG и 5 из 10 для IgA.

Пример 2. Диагностика рака легких

Пациенты были разделены на 2 группы. В первую группу входило 12 больных с верифицированным диагнозом после бронхоскопии и биопсии. Вторая группа состояла из пациентов с подозрением на злокачественный процесс, основанном только на осмотре лечащего врача без гистологического подтверждения. Эта группа состояла из 16 человек

Иммуноферментный анализ (ИФА) образцов проб, взятых у больных с верифицированным диагнозом, проводился согласно описанной методике. Положительными считались пробы, имевшие оптическую плотность в ИФА на 20% и более оптической плотности контрольной пробы.

Результаты

В первой группе сопоставление результатов анализов, сделанных по нашей методике с использованием следующих конструкций: тяжелой цепи (Glu-H), тяжелой цепи (Lys-H), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530), совпал с поставленными верифицированными диагнозами у 10 больных из 12 для IgG и 7 из 12 для IgA.

При использовании конструкций: K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glul64), K2-3 (Cysl65-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин у 5 из 12 для IgG и 4 из 12 для IgA.

При использовании в качестве антигена легкой цепи (L) у 7 из 12 при определении IgG.

Во второй группе, состоящей из 16 пациентов, с подозрением на злокачественный процесс, у 12 был поставлен диагноз рака легких на основании наших анализов для IgG и у 9 для IgA. В дальнейшем он был подтвержден гистологией.

У 2 пациентов после гистологии диагноз рака легких не подтвердился, что также совпало с результатами нашего теста как при определении иммуноглобулинов класса G, так и класса A. При этом были использованы конструкции тяжелой цепи (Glu-H), тяжелой цепи (Lys-H), K1-4 (Tyr80-Ala440), K1-3 (Tyr80-Val338), K1-3 (Tyr80-Val354), K1-4 (Asn60-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro447), K1-4 (Lys78-Pro446), K1-4 (Lys78-Lys468), K1-4,5 (Lys78-Arg530). У двух больных наши результаты не совпали с результатами гистологического исследования при определении аутоантител класса IgG. При определении аутоантител класса IgA количество проб, не совпавших с диагнозом, было больше.

При использовании в качестве антигена легкой цепи (L) у 8 из 16 для IgG и 7 из 16 для IgA.

При использовании конструкций: K4-5 (Val355-Phe546), K1 (Tyr80-Glul64), K2-3 (Cysl65-Val338), K4 (Val354-Ala440), K5 (Ser441-Fhe546), K5 (Val442-Arg561), мини-плазмин у 7 из 10 класса G.

Пример 3. Диагностика рака молочной железы

Диагнозы больных с раком молочных желез были установлены на основании следующих показателей: клинического обследования с морфологическим (гистологическим) подтверждением поставленного диагноза и на основании онкологических