Способы и композиции для улучшенной доставки макромолекул

Способы и композиции для улучшенной доставки макромолекул

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/079586, поданной 10 июля 2008 года, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к композициям и способам, которые облегчают доставку молекул через биологические мембраны, в частности доставку антигенсвязывающих полипептидов через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему (ЦНС).

Уровень техники изобретения

Согласно докладу 2006 года Всемирной Организации Здравоохранения свыше 1 миллиарда людей во всем мире страдают от неврологических нарушений, и такие нарушения ежегодно приводят приблизительно к 6,8 миллионам смертей. Лечебные антигенсвязывающие пептиды, такие как антитела, могли бы применяться для лечения множества, если не большинства, таких неврологических нарушений. Однако лечению неврологических нарушений, применяющему такие терапевтические антигенсвязывающие пептиды, часто препятствуют трудности, связанные с доставкой лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Несмотря на то что были обнаружены соединения, улучшающие доставку молекул через слои эпителиальных клеток, в целом было показано, что они эффективны для облегчения доставки только небольших молекул. Например, было показано, что пептид 4-фенилазобензилоксикарбонил-Pro-Leu-Gly-Pro улучшает перенос небольших молекул через слои эпителиальных клеток, тогда как для макромолекул 10 кДа и более улучшенный эффект проникновения не был продемонстрирован (см. патент США 5534496; Yen et al. 1995, J Control Release, 36:25-37). Несмотря на интенсивные исследования на сегодня нет пригодного и эффективного способа доставки терапевтических антигенсвязывающих полипептидов в ЦНС.

По этой причине существует сохраняющаяся необходимость в данной области в композициях и способах, которые улучшают специфическую доставку терапевтических антигенсвязывающих полипептидов через эпителиальные слои, в частности в ЦНС, для лечения нарушений, связанных с ЦНС.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основывается, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии, что вещества, способствующие проникновению (например, Pz-пептид или FMOC-пептид), способны улучшать специфическую доставку больших макромолекул (т.е. более чем 10 кДа), таких как антигенсвязывающие полипептиды (например, scFv) в ЦНС, в частности при нанесении на слизистую носа. Соответственно, изобретение предоставляет композиции и способы, которые облегчают доставку больших макромолекул (т.е. более чем 10 кДа), таких как антигенсвязывающие полипептиды (например, scFv), через слои эпителия. Такие способы и композиции особенно преимущественны в том, что они дают возможность удобной, эффективной и избирательной доставки антигенсвязывающих полипептидов (например, scFv) в ЦНС посредством интраназального введения для лечения неврологических нарушений.

В одном аспекте изобретение предоставляет композиции, содержащие один или более антигенсвязывающих полипептидов, таких как иммуносвязывающее вещество (например, scFv), и одно или более веществ, способствующих проникновению (например, Pz-пептида или FMOC-пептида). В отдельном варианте осуществления антигенсвязывающий полипептид ковалентно связан с веществом, способствующим проникновению.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид специфически связывается с антигеном-мишенью, выбранным из группы, состоящей из TNF-альфа, амилоида бета, растворимого рецептора лиганда - производного амилоида бета, моноаминооксидазы-B, L-3,4-дигидроксифенилаланиндекарбоксилазы, ацетил-коА-карбоксилазы, рецептора N-метил-D-аспартата (также известного как GRINl), GRINA, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRJN3B, гистаминового рецептора H1, мускаринового рецептора (также известного как CHRM1), CHRM2, CHRM3, CHRM4, гипокретинового рецептора 1, гипокретинового рецептора 2, 5-гидрокситриптамина (также известного как HTR1A), допаминового рецептора (также известного как DRD1), DRD2, DRD3, DRD4, DRD5, адренергического бета-1 рецептора, переносчика норэпинефрина (NET) и допаминового D2-рецептора, в частности TNF-альфа.

В других вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид представляет собой scFv, включающий последовательность аминокислот по меньшей мере с 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью или сходством с одним или более из наборов последовательностей аминокислот, приведенных в таблицах 5, 6 и 7 в данном описании.

В других вариантах осуществления вещество, способствующее проникновению, обеспечивает избирательную интраназальную доставку антигенсвязывающего полипептида в центральную нервную систему.

Композиции по изобретению особенно полезны в качестве лекарственных средств (или для производства лекарственных средств), в частности, для лечения, предупреждения или торможения прогрессирования неврологических нарушений, включая, но без ограничения, мигрень, депрессию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрению, эпилепсию, инсульт, менингит, боковой амиотрофический склероз, бессонницу, нарушение памяти, рассеянный склероз, нарколепсию, удар, травматическое повреждение мозга и стресс.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет набор, содержащий один или более антигенсвязывающих полипептидов (например, scFv), одно или более веществ, способствующих проникновению (например, Pz-пептид или FMOC-пептид), и инструкции по применению.

Описание чертежей

Признаки и преимущества данного раскрытия будут более понятны при прочтении следующего подробного описания, взятого вместе со следующими чертежами, на которых:

Фиг.1 отображает эксперименты по определению зависимости от времени, которые отслеживают концентрации ESBA 105 в (A) обонятельной луковице, (B) головном мозге, (C) мозжечке и (D) стволе мозга после интраназального введения 400 мкг scFv.

На фиг.2 приведено сравнение концентрации ESBA 105 в (A) обонятельной луковице, (B) головном мозге, (C) мозжечке, (D) стволе мозга и (E) сыворотке после либо интраназального (400 мкг/мл), либо внутривенного (40 мкг/мл) введения ESBA 105, а также в (F) сыворотке после либо интраназального, либо внутривенного введения ESBA 105 в равных концентрациях, составляющих 400 мкг/мл.

На фиг.3 показаны (A) C_max (средние значения ± СО, n=4) и (B) воздействие (AUC) соотношения концентраций ESBA l05 ткани мозга-кровь в различных областях мозга после интраназального введения с Pz-пептидом или без него.

Фиг.4 отображает пути перемещения ESBA 105 из носовой полости в ЦНС после интраназальной доставки. Из носовой полости введенное соединение может перемещаться в кровь и проходить гематоэнцефалический барьер, чтобы, в конечном счете, проникать в ткань мозга (нижний путь). Альтернативно, соединение может перемещаться по аксонам N. olfactorius (т.е. внутриклеточно) или периневрально (т.е. внеклеточно) в обонятельную луковицу и впоследствии в головной мозг. Соединение может также перемещаться через N. trigeminus периневрально (т.е. внеклеточно) в ствол мозга и затем в мозжечок.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин "вещество, способствующее проникновению" охватывает любую композицию, которая улучшает переход лекарственного средства через физический барьер, такой как тканевый барьер (например, эпителий). Подходящие вещества, способствующие проникновению, включают, но без ограничения, пептиды Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO:28], Pro-Leu-Gly-Pro-Lys [SEQ ID NO:29], Pro-Leu-Gly-Pro-Glu [SEQ ID NO:30], Pro-Leu-Gly-Pro-Asp [SEQ ID NO:31], Pro-Leu-Gly-Pro [SEQ ID NO:32], Pro-Leu-Gly и Pro-Leu, связанные N-концом с защитной группой, как например 4-фенилазобензилоксикарбонил (Pz), N-метил трет-бутилоксикарбонил (t-Boc), флуоренилметилоксикарбонил (FMOC) и карбобензокси (CBZ) (см. например, патент США 534496, который включен в данное описание посредством ссылки).

Термин "Pz-пептид" относится к Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO:28], связанному N-концом с Pz-группой (см. например, патент США 5534496, который включен в данное описание посредством ссылки).

Термин "FMOC-пептид" относится к Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO:28], связанному N-концом с FMOC-группой (см. например, патент США 5534496, который включен в данное описание посредством ссылки).

Термин "избирательная интраназальная доставка" относится к интраназальному введению молекул (например, антигенсвязывающего полипептида) пациенту в условиях, приводящих к более высоким концентрациям молекул в ЦНС, чем в сыворотке пациента.

Термин "антигенсвязывающий полипептид" относится к полипептидам, размеры которых составляют по меньшей мере 10 кДа, и включает иммуносвязывающие вещества, моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, антитела с пересаженными CDR, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела (scFv) и фрагменты антител, а также антигенсвязывающие полипептиды, основанные на альтернативных клеточных каркасах, известных в данной области, такие как, но не ограничиваясь ими, CTLA-4, тендамистат, фибронектин (FN3), неокрациностатин, CBM4-2, липокалины, T-клеточный рецептор, домен белка A (белок Z), Im9, сконструированные белки с анкириновым повтором (DARPins), сконструированные TPR-белки, цинковые пальцы, pVIII, птичий панкреатический полипептид, GCN4, WW-домен, гомологичный Src домен 3 (SH3), гомологичный Src домен 2 (SH2), PDZ-домены, TEM-I β-лактамаза, GFP, тиоредоксин, стафилококковая нуклеаза, PHD-пальцы, CI-2, BPT1 APPI, HPSTI, экотин, LACI-D1, LDTI, MTI-II, токсины скорпиона, пептид дефенсин A насекомых, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, цитохром b₅₆₂, домен A LdI рецептора, γ-кристаллин, убиквитин, трансферрин и лектиноподобный домен C-типа (см. например, Binz 2005, Curr Opin Biotechnol. Vol. 16 p. 459-69).

Термин "иммуносвязывающее вещество" относится к молекуле, которая содержит всю или часть антигенсвязывающего сайта антитела, например, весь домен или его часть с вариабельной тяжелой и/или легкой цепями, так что иммуносвязывающее вещество специфически распознает антиген-мишень. Неограничивающие примеры иммуносвязывающих веществ включают полноразмерные молекулы иммуноглобулинов и scFv, а также фрагменты антител, включая, но без ограничения, (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из V_L, V_H, C_L и C_H1 доменов; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fab'-фрагмент, который является по существу Fab с частью шарнирной области (см. Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd-фрагмент, состоящий из V_H и C_HI доменов; (v) Fv-фрагмент, состоящий из V_L и V_H доменов из одного плеча антитела, (vi) антитело с единичным доменном, такое как Dab-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)), который состоит из V_H или V_L домена, Камелид (см. например, Hamers-Casterman, et al, Nature 363:446-448 (1993) и Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) или антитело акулы (например, shark Ig-NAR Nanobodies®); и (vii) нанотело, вариабельная область тяжелой цепи, содержащая единичный вариабельный домен и два константных домена.

Термин "антитело", как используется в данном описании, является синонимом для "иммуноглобулина". Антитела согласно настоящему изобретению могут представлять собой целые иммуноглобулины или их фрагменты, содержащие по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, такой как единичные вариабельные домены, Fv (Skerra A. и Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')₂, и другие фрагменты, хорошо известные специалистам в данной области.

Термин "одноцепочечное антитело" или "scFv" относится к молекуле, включающей вариабельную область тяжелой цепи антитела (V_H) и вариабельную область легкой цепи антитела (V_L), соединенные линкером. Такие scFv молекулы могут иметь общие структуры: NH₂-V_L-линкер-V_H-COOH или NH₂-V_H-линкер-V_L-COOH.

Термин "каркасная область антитела", как используется в данном описании, относится к части вариабельного домена, либо VL, либо VH, который служит в качестве клеточного каркаса для антигенсвязывающих петель данного вариабельного домена (Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Примеры подходящих каркасных областей раскрыты в PCT/CH 2009/000219 и PCT/CH 2009/000222, которые включены в данное описание посредством ссылки.

Термин "линкер" относится к линейной последовательности аминокислот, связывающих два домена. Линкеры по изобретению могут быть генетически и/или химически встроены в домен. В некоторых вариантах осуществления линкеры содержат петлю, образованную посредством дисульфидного мостика, сформированного между двумя цистеинами, присутствующими в линкере. Общая структура такого линкера приведена в SEQ ID NO:18 и 19; SEQ ID NO:16 и 17 являются иллюстративными вариантами осуществления указанных линкеров. Дополнительное подходящее состояние в линкерной области состоит из повторяющихся последовательностей аминокислот GGGGS или их вариантов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используется линкер (GGGGS)4 (SEQ ID NO:36) или его производное (например, используется SEQ ID NO:37), но варианты повторений 1-3 также являются возможными (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые могут быть использованы для настоящего изобретения, описаны Alfthan et al. (1995), в Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56, и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59.

Термин "модифицированный" или "модифицирование" применительно к аминокислотной последовательности полипептида относится как к присоединению аминокислот в полипептидную последовательность, так и к замещению имеющихся аминокислот в полипептидной последовательности. Аминокислоты, подходящие для модифицирования полипептида, включают все известные природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и их функционализированные производные (см. например, патенты США 7045337 и 7083970, которые включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте). В определенных вариантах осуществления термин относится к делеции аминокислот из полипептидной последовательности.

"Антиген-мишень" представляет собой молекулу (например, растворимый белок или мембраносвязанный белок, имеющий один или более соединенных с мембранами доменов, полипептид, пептид или углевод), содержащую антигенную детерминанту, с которой антитело специфически связывается.

Термин "неврологическое нарушение" включает заболевания и нарушения, которые могут поражать центральную нервную систему (т.е. головной мозг и спинной мозг).

Термин нарушение со стороны ЦНС относится к нарушению, которое манифестируется в ЦНС. В качестве примера, это может быть опухоль мозга или неврологическое нарушение.

Термин "эффективное количество" определяется как количество лекарственного средства (например, антигенсвязывающего полипептида), достаточного для частичного или полного предупреждения или остановки заболевания или нарушения (например, неврологического нарушения) у пациента. Эффективное количество будет зависеть от тяжести заболевания или нарушения и многообразия фармакокинетических факторов, включая активность конкретной используемой композиции настоящего изобретения, способ введения, время введения, скорость выведения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или вещества, применяемые в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, подвергаемого лечению, и подобные факторы, хорошо известные в медицинских областях.

Термин "пациент" включает человека и других млекопитающих субъектов, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

Термины "специфическое связывание", "избирательное связывание", "избирательно связывается" и "специфически связывается" относятся к антителу, связывающемуся с эпитопом на предварительно заданном антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (Kj) приблизительно менее чем около 10^-7M, например, приблизительно менее чем около 10^-8M, 10^-9M или 10^-10M.

Как используется в данном описании, "идентичность" относится к последовательности, совпадающей у двух полипептидов, молекул или у двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одно и то же основание или мономерная аминокислотная субъединица (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, или положение в каждой из двух полипептидов занимает лизин), то соответствующие молекулы в том положении являются идентичными. "Процент идентичности" между двумя последовательностями представляет собой функцию количества совпадающих положений, общих для двух последовательностей, разделенного на количество сравниваемых положений, ×100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают, то две последовательности обладают 60%-ной идентичностью. В качестве примера последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT имеют 50%-ную идентичность (3 из 6 общих положений совпадают). В большинстве случаев сравнение производят, когда две последовательности выровнены для предоставления максимальной идентичности. Такое выравнивание может быть обеспечено при применении, например, способа Needleman et al. (1970) J MoI. Biol. 48: 443-453, легко осуществляемого с помощью компьютерных программ, таких как Align программа (DNAstar, Inc.). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может также быть определен с применением алгоритма E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), который был включен в программу ALIGN (version 2.0), с использованием таблицы остаточных масс PAM 120, штрафа за длину делеции, равного 12, и штрафа за делецию, равного 4. В дополнение, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с применением алгоритма Needleman и Wunsch (J. MoI. Biol. 48:444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступен на www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250, и массой делеции, равной 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и весой длины, равной 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

"Аналогичными" последовательностями являются последовательности, которые при выравнивании имеют идентичные и одинаковые аминокислотные остатки, где аналогичные остатки представляют собой консервативные заместители для соответствующих аминокислотных остатков в выравненной ссылочной последовательности. В этом отношении "консервативное замещение" остатка в ссылочной последовательности представляет собой замещение остатком, который физически или функционально является аналогичным соответствующему ссылочному остатку, например который имеет аналогичные размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи и т.п. Таким образом, "консервативной замещающей модифицированной" последовательностью является последовательность, которая отличается от ссылочной последовательности или последовательности дикого типа в том, что присутствуют один или более консервативных заместителей. "Процентное сходство" между двумя последовательностями является функцией количества положений, которые содержат совпадающие остатки или консервативные заместители, являющиеся общими для двух последовательностей, разделенных на число сравниваемых положений, ×100. Например, если от 6 до 10 положений в двух последовательностях совпадают и от 2 до 10 положений содержат консервативные заместители, тогда две последовательности обладают 80% положительным сходством.

Как используется в данном описании, термин "консервативные модификации последовательностей" предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые не влияют негативно и не изменяют связывающие характеристики антитела, имеющего в своем составе последовательность аминокислот. Подобные консервативные модификации последовательностей включают заместители нуклеотидов и аминокислот, добавления и делеции. Например, модификации можно вводить посредством стандартных методик, известных в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР опосредованный мутагенез. Консервативные заместители аминокислот включают заместители, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области. Данные семейства включают аминокислоты с щелочными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, прогнозированный второстепенный аминокислотный остаток человеческого анти-VEGF антитела предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями. Способы идентификации консервативных заместителей нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в данной области (см. например, Brummell et al, Biochem. 32:1 180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое значение, которое наиболее понятно специалистам в области, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что при практическом применении или тестировании настоящего изобретения могут быть использованы способы и вещества, аналогичные или эквивалентные способам и веществам, описываемым в данном описании, ниже описаны подходящие способы и вещества. В случае противоречия будет доминировать данное описание, включая определения. В дополнение, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. В следующих разделах более подробно описаны различные аспекты данного изобретения. Следует понимать, что в будущем различные варианты осуществления могут быть объединены.

Усовершенствованные антигенсвязывающие полипептидные композиции

В одном аспекте изобретение относится к композициям для обеспечения доставки терапевтических полипептидов, таких как антигенсвязывающие полипептиды (например, scFv), через тканевые барьеры, более конкретно, через слизистую оболочку носа, в ЦНС. Такие композиции, как правило, содержат антигенсвязывающий полипептид и вещество, способствующее проникновению. Данные композиции являются особенно предпочтительными за счет того, что они имеют возможность избирательной интраназальной доставки антигенсвязывающего полипептида в центральную нервную систему. На сегодняшний день биологические препараты обычно вводят систематически, требуя, таким образом, более высокую дозу лекарственного средства и/или подвергая организм, нуждающийся в этом, действию лекарственного средства; альтернативно, биологический препарат можно вводить через краниальный катетер. По этой причине настоящее изобретение значительно повышает качество жизни больного, нуждающегося в антигенсвязывающем полипептиде.

Любой антигенсвязывающий полипептид подходит для применения в способах по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий полипептид представляет собой иммуносвязывающее вещество, такое как scFv. Такие scFv предпочтительно включают в себя высокостабильные и растворимые каркасные области, такие как области, перечисленные в WO 09/000098, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. В особенно предпочтительном варианте осуществления scFv включает последовательность аминокислот по меньшей мере с 80% сходством (например, 85%, 90%, 95% или 99%) с одной или более последовательностями аминокислот, перечисленными в таблицах 5, 6 и 7. Наиболее предпочтительно scFv включает последовательность аминокислот по меньшей мере с 80% идентичностью, предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью с одной или более последовательностями аминокислот, перечисленных в таблицах 5, 6 и 7.

В предпочтительном варианте осуществления указанный scFv включает каркасную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% сходством (например, 85%, 90%, 95% или 99%), более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью, даже более предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью, с SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:27.

В еще одном варианте осуществления указанный scFv включает VH домен, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере с 80% сходством (например, 85%, 90%, 95% или 99%), более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью, даже более предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью, с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID No:35. Дополнительно или альтернативно указанный scFv включает в себя VL домен, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере с 80% сходством (например, 85%, 90%, 95% или 99%), более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью, даже более предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью, с SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 или SEQ ID No:34. В одном варианте осуществления указанные VH и/или VL связывают линкером для получения молекулы, имеющей общую структуру NH₂-VH-линкер-VL-COOH или NH₂-VL-линкер-VH-COOH. Указанная молекула-линкер может, например, быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:37, или представляет собой последовательность, имеющую по меньшей мере 80% сходство с ней.

В предпочтительном варианте осуществления scFv включает в себя последовательность аминокислот по меньшей мере с 80% сходством (например, 85%, 90%, 95% или 99%), более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью, даже более предпочтительно 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью, с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID No:33.

В композиции по изобретению может быть использовано любое вещество, способствующее проникновению. В некоторых вариантах осуществления, вещество, способствующее проникновению, представляет собой пептид или пептидомиметик, связанный с защитной группой. Пептиды, подходящие для применения в изобретении, могут содержать любые известные аминокислоты, включая природные аминокислоты, не являющиеся природными аминокислоты, D-аминокислоты и производные аминокислот. В отдельном варианте осуществления вещество, способствующее проникновению, представляет собой пептид, выбранный из группы, состоящей из Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO:28], Pro-Leu-Gly-Pro-Lys [SEQ ID NO:29], Pro-Leu-Gly-Pro-Glu [SEQ ID NO:30], Pro-Leu-Gly-Pro-Asp [SEQ ID NO:31], Pro-Leu-Gly-Pro [SEQ ID NO:32], Pro-Leu-Gly и Pro-Leu, связанных N-концом с защитной группой, такой как 4-фенилазобензилоксикарбонил (Pz), N-метил трет-бутилоксикарбонил (t-Boc), флуоренилметилоксикарбонил (FMOC) и карбобензокси (CBZ) (см. например, патент США 5534496, который включен в данное описание посредством ссылки). В предпочтительном варианте осуществления вещество, способствующее проникновению, представляет собой Pro-Leu-Gly-Pro-Arg [SEQ ID NO:28], связанное N-концом с Pz или FMOC группами (см. например, патент США 5534496, который включен в данное описание посредством ссылки).

В пределах объема настоящего изобретения предусматривается, что вещества, способствующие проникновению, и антигенсвязывающие белки могут совместно доставляться в ткань-мишень в виде единой фармацевтической композиции, или их доставку можно разделить во времени посредством введения в виде различных композиций.

Кроме того, в пределах объема настоящего изобретения предусматривается, что вещество, способствующее проникновению, может быть конъюгировано с антигенсвязывающим белком. Предусматриваются все варианты физической или химической конъюгации, известные в данной области. Для конъюгирования могут быть использована химическая группа с аминокислотой, производным аминокислоты или миметиком аминокислоты любого подходящего химического состава, известного в данной области. Конъюгирование может быть с любым аминокислотным остатком антигенсвязывающего белка, включая остатки лизина, цистеина и гистидина.

В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению могут содержать дополнительные соединения, подходящие для совместной доставки с указанными выше антигенсвязывающими белками. Подобные лекарственные средства включают, но без ограничения, небольшие молекулы, ноотропики, полипептиды и олигонуклеотиды.

Композиции по изобретению могут быть использованы для доставки антигенсвязывающих белков через межклеточные контакты любой биологической мембраны, включая, но без ограничения, слизистый эпителий (например, назальный эпителий) и корнеальную ткань. Особо предпочтительной мембраной-мишенью является назальный эпителий, потому что введение композиции по изобретению в назальный эпителий приводит к прямой и конкретной доставке антигенсвязывающего белка в ЦНС, предпочтительно без первоначального попадания в кровоток.

Лечение нарушений ЦНС

Композиции по изобретению особенно подходят для лечения, предупреждения и/или торможения прогрессирования нарушений ЦНС, поскольку такие композиции дают возможность прямой и избирательной доставки антигенсвязывающих полипептидов в ЦНС через слизистую оболочку носа. Нарушения, подходящие для лечения с применением композиций по изобретению включают, но без ограничения, поведенческие/когнитивные синдромы, нарушения по типу головной боли (например, мигрень, кластерную головную боль и головную боль напряжения), эпилепсию, травматическое повреждение мозга, нейродегенеративные нарушения (например, адренолейкодистрофию, алкоголизм, болезнь Александера, болезнь Альпера, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (также известный как болезнь Лу Герига), атаксию-телеангиэктазию, болезнь Баттена (также известную как болезнь Шпильмейера-Фогта-Шегрена-Баттена), губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, болезнь Канавана, корковый паралич, синдром Коккейна, корково-базальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, фатальную семейную инсомнию, лобно-височно-долевую дегенерацию, болезнь Гентингтона, ВИЧ-ассоциированную деменцию, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, болезнь диффузных телец Леви, нейроборрелиоз, болезнь Мачадо-Джозефа (спиномозжечковую атаксию тип 3), множественную системную атрофию, рассеянный склероз, нарколепсию, болезнь Нимана-Пика, болезнь Паркинсона, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный латеральный склероз, прионовые заболевания, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сандхоффа, болезнь Шильдера, подострую сочетанную дегенерацию спинного мозга на фоне пернициозной анемии, спиномозжечковую атаксию, спинальную мышечную атрофию, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, спинную сухотку и токсическую энцефалопатию, цереброваскулярное заболевание (например, транзиторную ишемическую атаку и инсульт), нарушения сна, церебральный паралич, инфекции (например, энцефалит, менингит и миелит), новообразования (например, опухоли головного мозга и спинного мозга), расстройства движения (например, гемибализм, тиковое расстройство и синдром Жилль де ла Туретта), демиелинизирующие заболевания ЦНС (например, рассеянный склероз, синдром Гиллана-Барре и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию), нарушения со стороны периферических нервов (например, миопатию и нервномышечные соединения), измененное психическое состояние (например, энцефалопатию, ступор и кому), речевые и языковые расстройства, перенеопластические неврологические синдромы и синдромы, включающие функциональные неврологические симптомы с невыявленной физиологической причиной.

Соответственно, в еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания или расстройства центральной нервной системы, включающему введение через слизистую оболочку носа субъекта, нуждающегося в таком лечении, эффективного количества композиции, содержащей антигенсвязывающий полипептид (например, scFv) и вещество, способствующее проникновению (например, Pz-пептид), для лечения и предупреждения заболевания или расстройства.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу избирательной доставки антигенсвязывающего полипептида в центральную нервную систему пациента, включающему осуществление контакта композиции, содержащей антигенсвязывающий полипептид (например, scFv) и вещество, способствующее проникновению (например, Pz-пептид), со слизистой оболочкой носа пациента, посредством чего антигенсвязывающий полипептид напрямую и избирательно доставляется в центральную нервную систему.

Антигены-мишени

Антигенсвязывающие полипептиды, применяемые в способах по изобретению, могут связываться с одним или более отдельными антигенами-мишенями. Подходящие антигены-мишени включают, но без ограничения, TNF-альфа (например, Genbank с номером доступа: NP_000585.2), амилоид бета (например, Genbank с номером доступа: NP 000475.1), растворимый рецептор лиганда-производного амилоида бета (см. например, WO/2004/031400), моноаминооксидазу-B (например, Genbank с номером доступа: NP_000889.3), L-3,4-дигидроксифенилаланиндекарбоксилазу (например, Genbank с номером доступа: NP_000781.1), ацетил-коА карбоксилазу (например, Genbank с номером доступа: NP_942131.1), Рецептор N-метил-D-аспартата (также известный как GRIN1)(например, Genbank с номером доступа: NP_000823.4)), GRINA (например, Genbank с номером доступа: NP_000828.1), GRIN2D (например, Genbank с номером доступа: NP_000827.2), GRJN2C (например, Genbank с номером доступа: NP_000826.2), GRIN3B (например, Genbank с номером доступа: NP_619635.1), GRIN2A (например, Genbank с номером доступа: NP_000824.1), GRIN2B (например, Genbank с номером доступа: NP_000825.2), GRIN3A (например, Genbank с номером доступа: NP_597702.2), гистаминовый H1-рецептор (например, Genbank с номером доступа: NP_000852.1), мускариновый рецептор (также известный как CHRM1) (например, Genbank с номером доступа: NP_000729.2), CHRM2 (NP_000730.1), CHRM3 (NP 000731.1), CHRM4 (NP 000732.2), гипокретиновоговый рецептор 1 (например, Genbank с номером доступа: NP_001516.2), гипокретиновый рецептор 2 (например, Genbank с номером доступа: NP_001517.2), 5-гидрокситриптамин (также известный как HTR1 A) (например, Genbank с номером доступа: NP_000515.2), допаминовый рецептор (также известный как DRD1) (например, Genbank с номером доступа: NP_000785.1), DRD2 (например, Genbank с номером доступа: NP_000786.1), DRD3 (например, Genbank с номером доступа: NP_000787.2), DRD4 (например, Genbank с номером доступа: NP_000788.2), DRD5 (например, Genbank с номером доступа: NP_000789.1), норэпинефриновый переносчик (NET) (например, Genbank с номером доступа: NP_001034.1), адренергический бета-1 рецептор (например, Genbank с номером доступа: NP_000675.1) и допаминовый D2-рецептор (например, Genbank с номером доступа: NP_000786.1).

Готовые формы

Другой аспект изобретения относится к фармацевтическим готовым формам композиций по изобретению антигенсвязывающего полипептида/вещества, способствующего проникновению. Такие готовые формы обычно содержат один или более антигенсвязывающих полипептидов, одно или более веществ, способствующих проникновению, и фармацевтически приемлемый носитель. Как используется в данном описании, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые растворители, дисперсионную среду, покрывающие вещества, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель должен подходить, например, для внутривенного, внутримышечного, подкожного, местного (например, в глаза, на кожу или эпителиальный слой), ингаляционного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, посредством инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения композиция антигенсвязывающего полипептида/вещества, способствующего проникновению, может быть покрыта веществом для защиты соединении от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.

Фармацевтическая композиция по изобретению может включать одну или более фармацевтически приемлемых солей. "Фармацевтически приемлемой солью" называют соль, которая сохраняет требуемую биологическую ак