Способы лечения хронической боли

Способы лечения хронической боли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к анти-CGRP антителу для применения в предотвращении и/или лечении хронической боли и/или симптомов хронической боли и к способу лечения и/или предотвращения хронической боли и/или симптомов хронической боли с применением анти-CGRP антитела.

Уровень техники

Хроническая боль представляет собой продолжительную боль, которая сохраняется продолжительнее, чем временное естественное заживление исходного поражения или заболевания, вызывающего боль. Она не содействует полезной или защитной функции, и по оценкам 2,7 миллионов людей в Великобритании становятся нетрудоспособными из-за патологического состояния хронической боли.

Боль, вызванная раковым заболеванием, является одной из наиболее распространенных типов хронической боли и демонстрирует ноцицептивные компоненты благодаря опухолевому росту и невропатические компоненты благодаря нервному поражению, индуцированному опухолью. Она дополнительно включает структурное поражение, ущемление и поражение нерва, воспалительные процессы, которые ведут к нарушению нормального метаболизма ткани, продуцированию простагландинов и цитокинов воспаления и к поражению ткани.

К настоящему времени, основная часть анальгетиков, применяемых для лечения хронической боли, представляет собой опиаты и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). Оба класса лекарственных средств могут производить тяжелые побочные эффекты. НПВС могут вызывать язву желудка и поражение почек, опиаты могут вызывать тошноту, констипацию, спутанность сознания и проблемы зависимости. Опиоиды не способны даже при высоких дозах производить ослабление боли у всех индивидуумов, страдающих хронической болью, и, кроме того, развитие анальгетической устойчивости к опиоидам затрудняет их применимость в течение длительного курса терапии. В частности, лечение боли, связанной с раковым заболеванием, требует использования неприемлемо высокого уровня опиатов с сопутствующими этому побочными эффектами, и при этом, по меньшей мере, 20% подвергнутых лечению пациентов все еще имеют неконтролируемую боль.

Соответственно, существует медицинская необходимость идентификации новых фармацевтически активных соединений, которые препятствуют ключевым стадиям процесса хронической боли, и, в частности, это необходимо для лечения и/или предотвращения хронической ноцицептивной боли и/или симптомов хронической ноцицептивной боли.

К удивлению, авторы обнаружили, что введение анти-CGRP антитела в периферическом месте приложения действия является эффективным для предотвращения и/или лечения хронической боли и, в частности, хронической ноцицептивной боли, такой как боль, связанная с раковым заболеванием.

CGRP (пептид, связанный с геном кальцитонина) представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который действует в качестве нейромедиатора в центральной нервной системе. Он связывается с высокой степенью аффинности с CGRP-рецептором, с рецептором подобным рецептору кальцитонина (CRLR), активируя продуцирование аденилатциклазы и протеинкиназы A.

Было продемонстрировано, что при спинальном введении с центральным проникновением, низкомолекулярные селективные CGRP-антагонисты применимы в лечении патологических состояний невропатической и ноцицептивной боли (Adwanikar et al, Pain 2007), предполагая, что удаление эндогенного CGRP в спинном мозге обладает антиноцицептивным эффектом. Было продемонстрировано, что дополнительное интратекальное введение иммунной сыворотки против CGRP уменьшает ноцицептивное поведение в моделях артрита у грызунов (Kuraishi, Y., et al. Neurosci. Lett (1998) 92, 325-329).

К удивлению, авторы обнаружили, что введение анти-CGRP антитела в периферическом месте приложения действия является эффективным в предотвращении и/или лечении хронической боли и, в частности, хронической ноцицептивной боли, при введении периферически. Этот периферический путь введения обеспечивает явное преимущество по сравнению с требованием интратекального или спинального введения антител, с более высоким риском и затруднительной процедурой.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предлагается применение анти-CGRP антогонистического антитела для производства лекарственного средства для предотвращения и/или лечения хронической боли и/или симптомов хронической боли, где лекарственное средство готовят для введения периферически.

В настоящем изобретении дополнительно предлагается способ предотвращения и/или лечения хронической боли и/или симптомов хронической боли у индивидуума, способ, который включает периферическое введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества анти-CGRP антагонистического антитела.

В одном воплощении, анти-CGRP антагонистическое антитело при введении действует периферически.

Описание фигур

Фигура 1. Эффект антитела G2, оказываемый на механическую гиперчувствительность к 8 граммам стимулов von Frey в модели боли, связанной с раком кости. Крысы с инъецированным MRMT-1 получали антитело G2 или пустой носитель (PBS+0,01% Tween20) на 9 день после операции. Группы были здоровы все время на протяжении послеоперационного периода, что демонстрировалось послеоперационным увеличением прибавки веса (данные не показаны). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная погрешность среднего для 7-9 крыс на группу. *p<0,05 против группы, получавшей пустой носитель в каждый момент времени.

Фигура 2. Эффект антитела G2, оказываемый на механическую гиперчувствительность к 15 граммам стимулов von Frey в модели боли, связанной с раком кости. Крысы с инъецированным MRMT-1 получали G2 или пустой носитель (PBS+0,01% Tween20) на 9 день после операции. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная погрешность среднего для 7-9 крыс на группу. *p<0,05 против группы, получавшей пустой носитель в каждый момент времени.

Фигура 3. Эффект антитела G2, оказываемый на способность передвигаться, измеренную с помощью вращающегося стержня. Исследовали две пограничные точки. Латентный период для ослабления по измерениям ухудшений двигательной координации, индуцированных соединением (A), и балльная оценка согласно тесту вращающегося стержня по измерениям боли, вызванной способностью передвигаться (B) в модели боли, связанной с раком кости. Крысы с инъецированным MRMT-1 получали антитело G2 или пустой носитель (PBS+0,01% Tween20) на 9 день после операции. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная погрешность среднего для 7-9 крыс на группу. *p<0,05 против группы, получавшей пустой носитель в каждый момент времени.

Фигура 4: Данные анализа связывания, демонстрирующие, что антитело G1 ингибирует связывание α-CGRP с CGRP1-рецептором.

Фигура 5a: Уровень концентрации анти-CGRP антитела (мкг/мл) в сыворотке против времени после внутривенного введения 10 мг/кг, измеренный с помощью анти-IgG-ELISA.

Фигура 5b: Уровень концентрации анти-CGRP антитела (мкг/мл) в сыворотке против времени после внутривенного введения 10, 30, 100 мг/кг, измеренный с помощью анти-IgG-ELISA.

Фигура 6: Сканирующий аланином мутагенез с использованием C-концевого фрагмента CGRP (CGRP 25-37). Изменение аффинности выражается в кратной потере аффинности и демонстрирует, что анти-CGRP антитело G1 связывается с C-концевым участком человеческого белка α-CGRP.

Фигура 7: Конкурирование в растворе с помощью Biacore: CGRP, фрагменты CGRP или пептиды, с последовательностью, родственной CGRP, использовали для определения специфичности антитела G1.

Фигура 8: CGRP-последовательности человека, макаки-крабоеда, крысы, собаки и кролика. Подчеркнуты неконсервативные остатки между видами, эпитоп антитела G1 выделен жирным шрифтом.

Фигура 9: Данные демонстрируют, что G1 ингибирует неврогенное воспаление кожи, начиная с 90 мин после обработки. G1 вводили с помощью внутривенного введения (1 мл/кг). Данные собраны от 6-8 или 13 крыс на группу. *p=0,05, **p=0,01 против группы, получавшей пустой носитель (фосфатно-буферный солевой раствор) в каждый момент времени (AVOVA).

Таблица 1: Kd и IC50 анти-CGRP антител, измеренные при 25ºC против человеческого α-CGRP [muMab7E9 = мышиный предшественник G1. Его K_D для крысиного β-CGRP=1 нМ. RN4901 = мышиное средство, распознающее тот же эпитоп, что и G1, но демонстрирующее такую же аффинность и селективность у крыс (β-CGRP K_D=17 нМ); G1=антитело, гуманизированное из muMab7E9 (K_D для крысиного β-CGRP=0,1 нМ).]

Таблица 2: Аффинности связывания G1, определенные с помощью Biacore.

Описание изобретения

Общие методы

При практическом применении настоящего изобретения до тех пор, пока не указано иначе, будут применяться стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в компетенции специалиста в данной области. Такие методы в полном объеме объяснены в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty, ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (VT. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).

Определения

"Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную к специфичному связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством, по меньшей мере, одного сайта распознавания антигена, локализованного в вариабельном участке молекулы иммуноглобулина. При использовании в настоящем документе, термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb), одноцепочечные антитела (ScFv), их мутанты, химерные антитела, диатела, сшитые белки, включающие участок антитела, и охватывает любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подклассы), и антитело необязательно должно принадлежать к какому-то конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует пять главных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называют альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

"Fv" представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. В двухцепочечных вариантах Fv, этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В одноцепочечном варианте Fv, один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен могут быть ковалентно связаны с помощью гибкого пептидного линкера, так что легкая и тяжелая цепи могут быть ассоциированы в димерной структуре, аналогичной структуре двухцепочечных вариантов Fv. В этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют для определения антиген-связывающей специфичности на поверхности димера VH-VL. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающего только 3 CDR, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связываться с антигеном, хотя, как правило, с более низкой активностью, по сравнению с полным сайтом связывания.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов вставкой нескольких остатков в карбокси-конец CH1-домена тяжелой цепи, включающих один или более цистеинов из шарнирных участков антитела. F(ab)₂-фрагмент представляет собой двухвалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке.

Антитело может содержать один или более сайтов связывания (для соединения с антигеном). Если существует более одного сайта связывания, то сайты связывания могут быть идентичны друг другу или могут отличаться. Например, встречающийся в естественной среде иммуноглобулин содержит два идентичных сайта связывания, одноцепочечное антитело или Fab-фрагмент содержат один сайт связывания, в то время как "биспецифичное" или "бифункциональное" антитело (диатело) содержит два различных сайта связывания в отношении последовательности распознавания антигена и/или эпитопа.

"Изолированное антитело" представляет собой антитело, которое (1) не ассоциировано с естественно-ассоциированными компонентами, включающими другие естественно-ассоциированные антитела, которые сопровождают его в нативном состоянии, (2) свободно от других белков из того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, или (4) не встречается в естественной среде.

"Моноклональное антитело" обозначает гомогенную популяцию антител, где моноклональное антитело состоит из аминокислот (встречающихся в естественной среде или не встречающихся в естественной среде), которые вовлечены в селективное связывание с антигеном. Популяция моноклональных антител является высоко специфичной, будучи направленной против одного антигенного сайта. Термин "моноклональное антитело" охватывает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные антитела (ScFv), их мутанты, сшитые белки, включающие участок антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности и способности связывания с антигеном. В изобретении не предусмотрено ограничение, касающееся источника антитела или способа его получения (например, с помощью гибридомы, фаговой селекции, рекомбинатной экспрессии, трансгенных животных и т.д.).

При использовании в настоящем документе, "гуманизированные" антитела обозначают формы антител из источников, отличных от человека (например, мышиные), которые представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антиген-связывающие фрагменты последовательностей антител), которые содержат минимальную последовательность, произошедшую из иммуноглобулина, полученного из источника, отличного от человека. По большей части, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки из участка, определяющего комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками CDR из вида, отличного от человека (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, где гуманизированные антитела имеют целевую специфичность, аффинность и биологическую активность. В некоторых случаях, остатки каркасного участка Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют соответствующими остатками вида, отличного от человека. Кроме того, гуманизированное антитело может включать остатки, которые не обнаружены ни в реципиентном антителе, ни в импортируемых CDR или каркасных последовательностях, но они включены для дополнительной коррекции и оптимизации функции антитела. Вообще, гуманизированное антитело будет включать, по существу, все из, по меньшей мере, одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют последовательностям иммуноглобулина из вида, отличного от человека, и все или по существу все FR-участки представляют собой консенсусные последовательности из человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также будет включать, по меньшей мере, часть константного участка или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Антитела могут содержать Fc-участки, описанные в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител содержат один или более участков CDR (один, два, три, четыре, пять, шесть), которые изменены по отношению к исходному антителу, которые также обозначаются как один или более CDR "произошедших из" одного или более CDR из исходного антитела.

При использовании в настоящем документе, "человеческое антитело" обозначает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцированного клетками человека, и/или полученную с использованием любого из методов получения человеческих антител, известного из уровня техники или раскрытого в настоящем документе. Это определение человеческого антитела включает антитела, включающие, по меньшей мере, один человеческий полипептид тяжелой цепи или, по меньшей мере, один человеческий полипептид легкой цепи. Один такой пример представляет собой антитело, включающее мышиный полипептид легкой цепи и человеческий полипептид тяжелой цепи. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных методов, известных из уровня техники. В одном воплощении, человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, которая экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения человеческих иммуноглобулиновых локусов трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные иммуноглобулиновые гены частично или полностью инактивированы. Этот способ описан в Патентах США No. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено с помощью иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело против антигена-мишени (такие B-лимфоциты могут быть получены от индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и Патент США No. 5750373.

Одноцепочечное антитело (scFc) представляет собой антитело, в котором участки VL и VH спарены с образованием одновалентной молекулы посредством синтетического линкера, который дает им возможность существовать в виде одной белковой цепи (Bird et al Science, 242: 423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)).

Диатела представляют собой двухвалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короткий, чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной цепи, заставляя, таким образом, домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антиген-связывающих сайта.

"Химерные антитела" обозначают такие антитела, где одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей гомологична соответствующим последовательностям, произошедшим из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу, в то время как оставшийся сегмент цепей гомологичен последовательностям другого вида или класса. Как правило, в этих химерных антителах вариабельный участок обеих, легкой и тяжелой, цепей имитирует вариабельные участки антител, произошедших из одного вида млекопитающих, в то время как константные участки гомологичны последовательностям антител, произошедших из другого вида. Одно очевидное преимущество таких химерных форм заключается, например, в том, что вариабельные участки могут быть выделены удобным способом из известных в настоящее время источников с использованием легкодоступных гибридом или В-клеток из организмов-хозяев, отличных от человека, в комбинации с константными участками, выделенными, например, из препаратов человеческих клеток. В то время как вариабельный участок имеет преимущество легкого получения, и источник не влияет на специфичность, константный участок, будучи человеческим, с меньшей вероятностью будет вызывать иммунный ответ человека при инъекции антител по сравнению с константным участком из источника, отличного от человека. Однако определение не ограничено этим частным примером.

"Функциональный Fc-участок" обладает, по меньшей мере, одной эффекторной функцией нативной последовательности Fc-участка. В качестве примера "эффекторные функции" включают C1q-связывание; комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даун-регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора; BCR) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют, чтобы Fc-участок был объединен с доменом связывания (например, вариабельным доменом антитела), и могут оцениваться с использованием различных известных из уровня техники анализов для оценки таких эффекторных функций антитела.

"Fc-участок нативной последовательности" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-участка, обнаруженного в естественной среде. "Вариантный Fc-участка" включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной аминокислотной последовательности Fc-участка посредством, по меньшей мере, одной аминокислотной модификации, сохраняя при этом, по меньшей мере, одну эффекторную функцию Fc-участка нативной последовательности. Предпочтительно, вариантный Fc-участок содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-участком нативной последовательности или с Fc-участком родительского полипептида, например, содержит примерно до десяти аминокислотных замен, и предпочтительно, примерно от одной примерно до пяти аминокислотных замен в Fc-участке нативной последовательности или в Fc-участке родительского полипептида. Вариантный Fc-участок согласно настоящему документу предпочтительно будет обладать, по меньшей мере, примерно 80% идентичности последовательности с Fc-участком нативной последовательности и/или с Fc-участком родительского полипептида и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% идентичности последовательности с указанными последовательностями, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% идентичности последовательности с указанными последовательностями.

При использовании в настоящем документе, "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "ADCC" обозначают клеточноопосредованную реакцию, в которой неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные киллерные клетки (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, может оцениваться с использованием in vitro ADCC-анализа, такого как описанный в Патенте США No. 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, применяемые для таких анализов, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC-активность молекулы, представляющей интерес, может оцениваться in vivo, например, в животных моделях, таких как раскрытые у Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652- 656.

При использовании в настоящем документе, "Fc-рецептор" и "FcR" описывают рецептор, который связывается с Fc-участком антитела. Предпочтительный FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой последовательность, которая связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcγRII-рецепторы включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают похожими аминокислотными последовательностями, которые отличаются, главным образом, их цитоплазматическими доменами. FcR рассмотрены у Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; и de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" также включает неонатальный рецептор, FcRn, который ответственен за передачу плоду материнских IgG (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Комплементзависимая цитотоксичность" и "CDC" обозначают лизирование мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется посредством связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с распознанным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть осуществлен CDC-анализ, описанный у Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

При использовании в настоящем документе, термины "G1" и "антитело G1" взаимозаменяемо используются для обозначения антитела, продуцируемого экспрессирующими векторами, имеющими депозитные номера ATCC-PTA-6867 и ATCC-PTA-6866. Аминокислотная последовательность вариабельных участков тяжелой и легкой цепи представлены в SEQ ID No. 1 и 2. CDR-части антитела G1 (включая CDR по Chothia и Kabat) изображены в виде диаграммы на Фигуре 5 WO 2007/054809, содержание которого включено в настоящий документ ссылкой в полном объеме. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, представлены в SEQ ID No. 9 и 10. Характеристика антитела G1 описана в Примерах WO 2007/054809, содержание которого включено в настоящий документ ссылкой в полном объеме. G1 представляет собой гуманизированное моноклональное блокирующее антитело (IgG2), которое блокирует связывание и активность нейропептида CGRP (a и b) и его эффект нейрогенной вазодилатации, вызванной высвобождением CGRP. G1 представляет собой IgG2Δa моноклональное анти-CGRP антагонистическое антитело, произошедшее из мышиного анти-CGRP антагонистического антитела-предшественника, обозначенного muMAb7E9, которое было идентифицировано в скрининге с использованием клеток селезенки, полученных от мыши, иммунизированной человеческим и крысиным CGRP, которые были слиты с клетками плазмоцитомы мыши. G1 было создано путем графтинга CDR легкой и тяжелой цепи, произошедших из muMAb7E9, в непосредственной близости к человеческой зародышевой последовательности с последующим введением, по меньшей мере, 1 мутации в каждый CDR и 2 каркасных мутаций в VH. Две мутации вводили в Fc-домен G1 для подавления активации человеческого Fc-рецептора. Было продемонстрировано, что G1 и muMab7E9 распознают один и тот же эпитоп.

При использовании в настоящем документе, термины "G2" и "антитело G2" взаимозаменяемо используются для обозначения мышиного моноклонального антитела к крысиному CGRP, описанного у Wong HC et al. Hybridoma 12:93-106 (1993). Аминокислотная последовательность вариабельных участков тяжелой и легкой цепи представлена в SEQ ID No. 19 и 20. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, представлены в SEQ ID No. 27 и 28. CDR-участки антитела G2 представлены в SEQ ID No. 21-26. Было продемонстрировано, что G2 распознает тот же эпитоп, что и G1.

При использовании в настоящем документе, "иммуноспецифичное" связывание антител обозначает антиген-специфичное связывающее взаимодействие, которое происходит между антиген-связывающим сайтом антитела и специфичным антигеном, распознаваемым антителом (т.e. антитело вступает в реакцию с белком в ELISA или в другом иммуноанализе и не вступает в реакцию на детектируемом уровне с посторонними белками).

Эпитоп, который "специфично связывается" или "предпочтительно связывается" (используются взаимозаменяемо) с антителом или полипептидом, представляет собой термин, хорошо известный из уровня техники, и методы определения такого специфичного или предпочтительного связывания также хорошо известны из уровня техники. Говорят, что молекула демонстрирует "специфичное связывание" или "предпочтительное связывание", если она вступает в реакцию или ассоциирует с конкретной клеткой или веществом более часто, более быстро, более продолжительно и/или с большей аффинностью по сравнению с другими клетками или веществами. Антитело "специфично связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если оно связывается с мишенью с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или более продолжительно по сравнению с другими веществами. Также из настоящего определения понятно, что, например, антитело (или компонент или эпитоп), которое специфично или предпочтительно связывается с первой мишенью, может или не может специфично или предпочтительно связываться со второй мишенью. "Специфичное связывание" или "предпочтительное связывание" как таковое не является обязательным требованием (хотя оно может им быть) особого связывания. Как правило, но необязательно, ссылка на связывание обозначает предпочтительное связывание.

Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" взаимозаменяемо используются в настоящем документе для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты и он может прерываться компонентами, отличными от аминокислот. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или путем воздействия; например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или путем любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгирование с компонентом мечения. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включающих, например, синтетические аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные из уровня техники. Понятно, что поскольку полипептиды по настоящему изобретению базируются на основе антител, то полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей.

"Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" при взаимозаменяемом использовании в настоящем документе обозначают полимеры нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги или любой субстрат, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификация в нуклеотидной структуре, если она присутствует, может быть привнесена перед или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может прерываться компонентами, отличными от нуклеотидных. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, как например, с помощью конъюгирования с компонентом мечения. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или более из встречающихся в естественной среде нуклеотидов на аналог, межнуклеотидные модификации, такие как, например, нуклеотиды, с образованием незаряженных связей (например, метилфосфонатной, фосфотриэфирной, фосфорамидатной, карбаматной, и т.д.) и с образованием заряженных связей (например, фосфоротиоатной, фосфородитиоатной и т.д.), модификации включают нуклеотиды, содержащие компоненты боковой цепи, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации с использованием интеркалирующих агентов (например, акридина, псоралена и т.д.), модификации с использованием хелаторов (например, металлов, радиоактивных металлов, бора, окисляющих металлов и т.д.), модификации с использованием алкилирующих агентов, модификации включают нуклеотиды с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также включают не модифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любые из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, могут быть замещены, например, фосфатными группами, защищенными стандартными защитными группами или активированными для создания дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или они могут быть конъюгированы с твердой подложкой. 5'- и 3'-концевая OH-группа может быть фосфорилирована или замещена аминами или компонентами органических кэпирующих групп, содержащих от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть модифицированы с использованием стандартных защитных групп. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые, как правило, известны из уровня техники, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилоза или ликсоза, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулоза, ациклические аналоги и нуклеозидные аналоги без основания, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть замещены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, в частности, воплощения, где фосфат замещен P(O)S("тиоатом"), P(S)S ("дитиоатом"), "(O)NR₂ ("амидатом"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталем"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную связь (-O-), арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде обязательно идентичны. Предыдущее описание применимо ко всем полинуклеотидам, обозначенным в настоящем документе, включая РНК и ДНК.

"Вариабельный участок" антитела обозначает вариабельный участок легкой цепи антитела или вариабельный участок тяжелой цепи антитела или индивидуально, или в комбинации. Каждый из вариабельных участков тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных участков (FR), связанных тремя участками, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные участки. CDR в каждой цепи находятся вместе в непосредственной близости от FR и с CDR из другой цепи, способствуя образованию антиген-связывающего сайта антител. Существует, по меньшей мере, два метода для определения CDR: (1) способ на основе межвидовой вариабельности последовательности (т.e. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) способ на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). При использовании в настоящем документе, CDR может обозначать CDR, определенные любым из этих способов или комбинацией обоих способов.

"Константный участок" антитела обозначает константный участок легкой цепи антитела или константный участок тяжелой цепи антитела или индивидуально или в комбинации.

При использовании в настоящем документе, "анти-CGRP антагонистическое антитело" (взаимозаменяемо используется с термином "анти-CGRP антитело") обозначает антитело, которое способно связываться с CGRP и ингибировать биологическую активность CGRP и/или последующий сигнальный каскад(ы). Анти-CGRP антагонистическое антитело охватывает антитела, которые блокируют, противодействуют, подавляют или уменьшают (включая значительное уменьшение) биологическую активность CGRP. Для целей настоящего изобретения совершенно понятно, что термин "анти-CGRP антагонистическое антитело" охватывает все ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, с помощью которых сам CGRP, биологическая активность CGRP или следствия биологической активности, по существу, исчезают, уменьшаются или нейтрализуются в любой значимой степени. В настоящем документе представлены примеры анти-CGRP антагонистических антител.

При использовании в настоящем документе, "по существу чистый" обозначает материал, который является чистым, по меньшей мере, на 50% (т.e. свободен от примесей), более предпочтительно, является чистым, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, является чистым, по меньшей мере, на 95%, более предпочтительно,