Штамм вируса гриппа a/pochard/siberia/249/08-ma h10n7-субтипа для получения антиген-содержащего диагностического препарата и диагностической поликлональной сыворотки, применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе пцр и для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo

Штамм вируса гриппа a/pochard/siberia/249/08-ma h10n7-субтипа для получения антиген-содержащего диагностического препарата и диагностической поликлональной сыворотки, применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе пцр и для изучения противовирусных препаратов in vitro и in vivo

Реферат

Изобретение относится к разделу общей и медицинской вирусологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа H10N7-субтипа адаптированного к мышам, и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н10-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (H1-H17) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа H10-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм также может быть применен в качестве контрольного референс-штамма H10 при проведении апробации тест-систем на основе ПЦР и проверки лечебных и профилактических препаратов против гриппа.

Вирусы гриппа a (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса [1]. Вирусы гриппа A подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (H) и 10 субтипов нейраминидазы (N) [2].

К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа A со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц [3]. В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 [4].

Первые упоминая о вирусе гриппа H10-субтипа, как высокопатогенного для домашней птицы встречаются с 1949 года, тогда он был выделен от мертвой курицы на ферме в Баварии [5]. Этот вирус (A/chicken/Germany/N49) был охарактеризован как H10N7. В дальнейшем сыворотку, полученную с использованием этого вируса стадии применять для серологического субтипирования вирусов гриппа H10-субтипа. В некоторых панелях этот штамм используется до настоящего времени. Позднее были зафиксированы две вспышки гриппа на фермах по выращиванию индюков в Минесоте, в 1979 и 1980 годах [8].

В научной литературе описан случай, произошедший в 1996 году. Тогда во время ежегодного мониторинга в Сингапуре был выделен изолят вируса гриппа, который серологически субтипировали как H10N5. При изучении биологических свойств данного штамма IVPI индекс был равен 1.76, что по современным оценкам позволяет его отнести к высокопатогенным [6].

В марте 2010 года была зарегистрирована вспышка низкопатогенного вируса гриппа субтипа H10N7 на ферме по разведению кур в Австралии. После этой вспышки вирус гриппа Н10 субтипа был выделен у двух сотрудников фермы, из семи человек, которые жаловались на коньюнктивит и слабые респираторные синдромы [7].

Также сообщалось о вспышках низкопатогенного вируса гриппа НЮ субтипа у домашних птиц в других странах. Наиболее характерным он является для таких видов домашней птицы, как индюки и эму в США [8, 9], у китайской утки на фермах в Южной Африке [10], и у кур в Канаде [11]. Также есть информация, о выделении вируса гриппа A субтипа H10N7 от домашней птицы, незаконно ввезенной на территорию Италии из Китая [12].

Неоднократно вирус гриппа Н10 сутбтипа выделялся от диких птиц в таких странах, как Америка [13, 14, 15], Перу - (H10N9) [16], Иран 2003-2007 H10N7 [17]. В Китае также выделяли этот вирус из окружающей среды (вода) [18].

Основываясь на этих данных, можно утверждать, что вирус широко распространен в популяции дикой и домашней птицы. Но литературные данные также свидетельствуют о распространении вируса гриппа Н10 субтипа среди млекопитающих. Так, в 1984 году в Швеции это вирус вызвал эпизоотию на ферме норок, при этом смертность от вируса достигала почти 100%. Серологическое исследование идентифицировало этот вирус как H10N4. Основная симптоматика болезни - анорексия, кашель и насморк [19]. В дальнейшем изучение того вируса методом Oligonucleotide (ON) fingerprinting позволило установить, что его предшественниками послужили вирусы, выделенные от птиц [20]. Филогенетический анализ показал, что NP ген исследуемого вируса также попадает в одну филогенетическую группу (кладу), с вирусами, выделенными от птиц [21].

Более поздние исследования шведских ученых показали, трансмиссия вируса гриппа H10 субтипа может происходить непосредственно от птиц норкам, в дальнейшем вызывая инфекцию в популяции норок на ферме [22].

Вирус, выделенный в Китае из окружающей среды и субтипированный как H10N8, был протестирован на курицах, в результате этого эксперимента, вирус отнесли к низкопатогенным. При исследовании биологических свойств этого же штамма environment/DT/Hunan/3-9/07 у мышей наблюдалась легкая потеря в весе, но при этом на третий и пятый день после заражения было показано высокое содержание вируса в легких. Для дальнейшего изучения патогенности вируса у млекопитающих китайские ученые провели несколько пассажей на мышах, каждый раз заражая животных вирусом, выделенным из легких. Вирулентность изучаемого штамма выросла после второго пассажа и вирус стал вызывать летальную инфекцию у мышей с седьмого по одиннадцатый день после заражения. Во время течения болезни большинство лабораторных животных обнаруживали тяжелые клинические симптомы - такие как сильная потеря в весе, взъерошенность волосяного покрова и потеря подвижности.

После 4-6 вирусного пассажа мыши показывали те же симптомы, но на более ранних сроках, и смерть наступала на 4-5 день после заражения.

Эти факты указывают на актуальность получения адаптированного к мышам штамма H10 и использования его для изучения патогенеза инфекции и тестирования противовирусных препаратов.

Филогенетический анализ environment/DT/Hunan/3-9/07 показал, что все гены относятся к Европейской линии. Но предположительно он является мультиреассортаном между различными вирусами, включая вирусы гриппа H5 и H7 субтипов. При анализе первичных последовательностей всех генов после шести пассажей на мышах было выявлено 22 аминокислотные замены, большинство из которых возникли вследствие адаптации вируса к новому хозяину [18].

Неоднократно вирус гриппа H10 субтипа вызывал слабые респираторные симптомы и коньюктивит у людей. В основном это были работники ферм, где разводили домашнюю птицу или норок, так в Австралии на ферме по разведению норок у двух работников был выделен вирус гриппа H10N7 [7]. А у работников фермы в США были обнаружены специфические антитела к вирусу гриппа H10 субтипа [23]. Также на территории Египта было зафиксировано два случая выделения вируса гриппа H10N7 у людей, при этом о гибели птиц или норок, вызванной этим вирусом, не сообщалось [24, 25].

Первые работы по адаптации вируса гриппа к мышам начались в 1947 году. Тогда основной целью исследования было изучение иммунного ответа и возможности заражения мышей вирусами, наработанными на куриных эмбрионах. Проведенные работы подтвердили, что вирус гриппа типа A, наработанный на РКЭ, может легко реплицироваться в легких мышей [26].

В основном в работах по адаптации вирусов гриппа типа A на мышах используются вирусы гриппа, выделенные от людей, и основой целью является выявление роли различных аминокислотных замен на увеличение патогенности вирусов. Так в 1998 г. канадские ученые изучали роли в вирулентности генов NA, PB1, PB2 вируса A/FM/1/47/H1N1 адаптированного на мышах [27].

Для моделирования летальной инфекции, вызванной вирусом сезонного гриппа H1N1-субтипа, используется адаптированный к мышам штамм A/Puerto Rico/8/1934 [28]. Он часто используется для экспериментальной инфекции хорьков и мышей, чтобы изучить патогенез вируса, иммунный ответ и протестировать противовирусные соединения.

После пандемии, вызванной H1N1 в 2009 году многие лаборатории стали проводить работы по адаптации этого вируса на мышах. Так, в ходе адаптации вирус стал высокопатогенным и вызывал смертность у мышей на 5 и 10 день после заражения. В ходе изучения аминокислотных последовательностей было показано, что ряд AK замен, произошедших в ходе адаптации, влияет на смертность у мышей, в частности в генах РВ, HA и NP [29].

Были получены штаммы пандемического вируса гриппа, адаптированные к мышам, - A/California/04/2009-МА и A/TN/1-560/09-MA [30]. Однако дикие штаммы A/California/04/2009 и A/TN/1 -560/09 были выделены в апреле 2009 г., в самом начале развития пандемии. Вследствие колоссальной изменчивости вируса гриппа уже с осени 2009 г. в мире циркулировали штаммы, отличные по молекулярно-генетическим свойствам от референс-штамма A/California/04/2009. Кроме того, оба штамма выделены в Америке.

Существует также штамм другого субтипа: A/Swine/1976/31(H1N1) -адаптированный к мышам вирус гриппа, выделенный от свиней [31]. Однако указанный штамм генетически и по антигенным свойствам также значительно отличается от штаммов вируса гриппа A (H1N1) 2009 г.

В ходе адаптации сезонного вируса гриппа H1N1 было выделено три AK замены в гемагглютинине (T89I, N125T, и D221G), которые увеличили вирулентность вируса у мышей, но при этом не оказали никакого влияния на такие свойства вируса как рецептороспецифичность и pH-зависимое слияние с мембрной [31].

Также существуют работы, по адаптации вирусов гриппа типа A к разным видам птиц. Например, в ходе 19 кратного пассирования вируса гриппа H3N2, выделенного от утки, на перепеле вирус приобрел ряд мутаций, которые способствовали репликации на бронхиальных эпителиальных клетках человека, в то время как вирус до пассирования таких свойств не показывал. Полученные данные указывают на то, что птицы отряда перепелиных могут служить промежуточными хозяевами между вирусами гриппа птиц и людей [32].

В мировой медицинской и научной практике нет широко применяемого штамма H10 субтипа, адаптированного к мышам (являющегося летальным для мышей, при интраназальном заражении), для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов в культуре клеток и на животных. Это затрудняет оценку эффективности лекарственных препаратов in vivo. При использовании непатогенных для мышей штаммов эффективность используемых противовирусных препаратов оценивают по динамике размножения вируса в легких подопытных мышей, что значительно затрудняет оценку результатов.

Установлено, что большинство известных штаммов вируса гриппа A субтипа H10N7, выделяемые в природе, не являются летальными для мышей. Однако вирус гриппа A H10 субтипа был детектирован у человека, вызывая коньюктивит и респираторное заболевание, в связи с чем представляет потенциальную опасность для млекопитающих, в том числе для человека. Поэтому для моделирования гриппозной инфекции мышей существует необходимость их адаптации к данным хозяевам.

Таким образом, в настоящее время в России отсутствует оригинальный штамм вируса гриппа H10N7-субтипа, адаптированный к мышам и доступный для моделирования летальной гриппозной инфекции с целью исследования профилактической и лечебной эффективности противовирусных препаратов; а также для использования в диагностических препаратах и контрольных референс-образцах.

Анализ известных аналогов.

При совершенствовании методик диагностики и усилении надзора за вирусом гриппа А в природе, вероятно, что новые субтипы HA и NA будут обнаруживаться. Это подтверждается выделением нового субтипа H17N10 от летучих мышей Южной Америки [2].

В связи с этим получение информации по всему спектру субтипов вируса гриппа, циркулирующих в окружающей среде, и развитие новых методов и подходов диагностики, в том числе с использованием предлагаемого штамма A/pochardVSiberia/249/08-МА (H10N7), остаются важными задачами мероприятий по эпиднадзору за гриппом и контролю эпизоотической ситуации животных.

В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции, на основе микрочипов [36, 37, 38, 39, 40]. Однако при апробации этих тест-систем необходимо применять контрольный референс-штамм H10 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа H10 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма H10.

За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.

Для исследования мембранного слияния используют штаммы H10N7 (Dr. David Steinhauer; mailto:dsteinh@emory.edu):

A/turkey/VA/31409/91

A/chicken/Germany/N/49

Штамм A/chicken/Germany/N/49 применялся как контрольный при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа A и B в реальном времени [41].

Оригинальный штамм хранится в коллекции Department of Virology, Erasmus Medical Center, The Netherlands (Drs. R.A.Fouchier; A.D.Osterhaus)

При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован штамм выделенный в Дании A/Chicken Germany/N/1949 (H10N7) [42].

Штамм H10N4-A/Turkey/England/384/79 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа [43].

Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/chicken/Germany/N/1949. Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии [44].

Для апробации экспресс тест-системы H5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа H5 субтипа в качестве контроля был использован штамм A/Mandarin Duck/Singapore/93 H10N5 [45].

На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой является рекомбинантные штаммы H10N3 (A/duck/Hong Kong/786/1979) и H10N9 (A/duck/HongKong/562/1979).

В панели по диагностике вируса гриппа методом РТГА применяют штамм A/Chicken Germany/N/1949 (H10N7).

Исследования методом РТГА нескольких штаммов различных субтипов, выделенных в Северной Америке, показали, что они достоверно антигенно отличны от вирусов, циркулирующих в Евразии [46].

Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований в настоящее время используется несколько штаммов вируса гриппа H10 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков.

Во-первых, все они были выделены в основном более чем 10 лет назад. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа A могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа H10-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа H10-субтипа как компоненты диагностических тест-систем. Этому условию удовлетворяет предлагаемый штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА (H10N7), выделенный в 2008 г.

Во-вторых, известные штаммы, в основном представленные американскими вариантами, антигенно отличны от евроазиатских штаммов, и образуют различные филогенетические линии. Они не проявляют значительной кросс-реактивности со штаммами, циркулирующими в Евразии. Следовательно, они не могут использоваться как референс-штаммы для панели РТГА в этом регионе и необходимо использовать с этой целью современные штаммы, циркулирующие в Евразии. Однако, ввиду большой территории Евразии, очевиден поиск вариантов, локально представленных в Азии. Этому условию удовлетворяет предлагаемый нами штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА (H10N7), выделенный в азиатской части России.

Кроме того, анализ доступной в настоящее время информации показывает, что на рынке отсутствует отечественный аналог референс-штамма вируса гриппа Н10-субтипа для серодиагностики вируса гриппа.

При оценке эффективности разработанных методов ПЦР типирования необходим анализ референс-штаммов, в том числе H10 субтипа. При этом важно, чтобы не было отмечено перекрестного взаимодействия с референс-штаммами других субтипов и результаты полностью совпадали с данными определения вирусного субтипа иммунологическими методами (РТГА).

Предлагаемый штамм может быть использован для этих задач и в полной мере может удовлетворять этим двум условиям апробации тест-систем ПЦР.

Следует отметить, что во многих панелях референс-антисывороток используется в основном старый штамм A/chicken/Germany/N/49 (H10N7), выделенный в 1947 Н10-субтипа [47].

В референс-панели ВОЗ в качестве антигена также используется A/chicken/Germany/N/49 (H10N7) [33].

В международной базе данных Genbank по состоянию на 1 марта 2013 существует следующая информация о 211 сиквенсах гена НА вирусов H10N7.

Ранее вирусы с субтипом H10 были выделены на европейской территории России сравнительно редко - отмечены единичные случаи выделения. При этом данные о выделении вируса H10-субтипа и его характеризации на территории России крайне немногочисленны. Однако это не исключает возможности его появления, поэтому существует необходимость готовности его диагностики.

Упомянутые источники содержат информацию о некоторых свойствах штаммов вируса гриппа H10-субтипа, выделенных в России. Однако в этих работах не была сделана попытка использовать их свойства при разработке диагностических препаратов, в том числе с использованием метода РТГА.

Все вышеперечисленные факты делают актуальным эффективную диагностику вируса гриппа H10-субтипа в области медицины, ветеринарии, экологии.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемого штамма является A/chicken/Germany/N/49 (H10N7), выделенный в 1947. Однако он был выделен более 50 лет назад, и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение его в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение такого штамма-продуцента вируса гриппа птиц H10N7-субтипа, который обладал бы более высоким антигенным сродством к современным вариантам вируса гриппа H10, и был пригоден для получения антигенсодержащего диагностического препарата, поликлональной сыворотки для определения принадлежности вируса гриппа к H10-субтипу, а также мог быть использован как контрольный референс-образец при оценке специфичности тест-систем на основе ПЦР.

Указанный технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, а также для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции и проверки лечебных и профилактических препаратов против гриппа, депонированный в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-592.

Характеристика заявляемого штамма.

Источник получения. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА является представителем вирусов гриппа род Influenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Принадлежность к H10N7-cy6rany определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (Н1-Н16) и нейраминидазу (N1-N9) [33, 34]. Заявляемый штамм изначально выделен из клоакального смыва красноголового нырка. Материал был собран в августе 2008 в Республике Хакасия (Ширинский район, оз. Сухой Иткуль). Выделенный штамм прошел 2 пассажа на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), 8 пассажей на мышах линии BALB/c, а затем 1 пассаж на клетках MDCK. Гибель клеток по апоптотическому пути наблюдалась через 2-3 суток с момента инфицирования. Штамм депонирован в Коллекцию микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под регистрационным номером № V-592.

Индикация вируса была проведена в РГА с эритроцитами гуся. Вирус агглютинировал эритроциты человека и гуся, но не агглютинировал эритроциты петуха: гемагглютинирующая активность составила 3,11±0,15 lg ГАЕ/мл. Инфекционная активность выделенного вируса составляла 6,9±0,09 lg EID50/мл.

Адаптация штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08 к мышам. Штамм A/pochard/Siberia/249/08 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл физиологического раствора, содержащего 100 или 10 TCID50 вируса A/pochard/Siberia/249/08. Эти дозы заражения выбраны, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на четвертые-пятые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. Остальных мышей в группе оставляли в живых для наблюдения возможной клинической картины, а также для получения сывороток крови. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ными гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-ного гомогената на клетках MDCK (табл.1).

Было проведено 7 последовательных пассажей. Клинические признаки заболевания начали проявляться после заражения мышей гомогенатами третьего пассажа. Гибель мышей начала проявляться на 7 пассаже для зараженных штаммом A/pochard/Siberia/249/08(H10N7) В связи с этим было решено определить значение летальной дозы для мышей и инфекционного титра вируса в РКЭ.

Определение летальной дозы для мышей было проведено путем заражения 4 групп мышей различными разведениями вируса (от 0 до -3). Было использовано 12-14 мышей на каждое разведение. Клиническая картина заболевания у мышей начала проявляться на 3 сутки после заражения. На 4-е сутки был отмечен первый случай гибели животных.

Наблюдение за животными проводили до прекращения гибели мышей, которое было отмечено на 11 сутки после заражения, т.е. в следующие дни гибели животных не наблюдалось. В итоге значение летальной дозы для мышей составило: MLD50=2,35±0,1 lgTCIDSO/мл для A/pochard/Siberia/249/08(H10N7). Инфекционный титр составил 7,53 lg EID50/мл.

Таблица 1
Инфекционные титры штамма вируса A/pochard/Siberia/249/08 при пассировании через легкие мышей линии Balb/c на 3 сутки после заражения
Номер пассажа	Титр вируса в легких мышей, IgTCID5o/ml±S.D.
I	4,50±0,16
II	4,63±0,12
III	4,50±0,18
IV	4,50±0,10
V	4,50±0,14
VI	5,37±0,07
VII	5,5±0,10

Как следует из данных, представленных в табл.1, инфекционный титр вируса A/pochard/Siberia/249/08-МА увеличивался от пассажа к пассажу (исключение составил только пятый пассаж вируса через легкие мышей). После того как вирус прошел 7 пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK. Инфекционный титр пула вируса сравнялся с титром исходного вируса и составил 7,38±0,24 lg TCID50/мл. При этом 50%-ная летальная для мышей доза (MLD50) составила 2,35±0,1 lgTCID50/Mn.

Культуральные свойства. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА при культивировании на монослое клеток MDCK вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-3 сутки (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% CO₂). Для культивирования штамма на клетках MDCK используют следующие питательные среды: DMEM, MEM, среда 199, RPMI, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Патогенность для человека. Нет информации о патогенности вируса гриппа субтипа H10, циркулирующего на территории Российской Федерации. В зарубежных работах экспериментальное инфицирование волонтеров показало, что вирус гриппа птиц H10N7 способен реплицироваться в носоглотке человека. Возможен конъюнктивит и незначительные симптомы заболевания верхних дыхательных путей.

Патогенность для млекопитающих. Штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА относится к вариантам вируса гриппа, патогенным для мышей: вызывает тяжелое заболевание и гибель мышей линии BALB/c при интраназальном инфицировании.

Биологические свойства адаптированного и исходного штаммов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Биологические характеристики исходного штамма A/pochard/Siberia/249/08 и его адаптированного к мышам варианта A/pochard/Siberia/249/08-МА
Штамм	число пасса-жей	lgTCID50/мл+S.D.	lgГАЕ/мл+S.D.	lgEID50/мл±S.D.	MLD50(lgTCID50/мл±S.D.)
A/pochard/Siberi а/249/08	2/РКЭ	7,25±0,12	3,11±0,15	6,9±0,09	Не летален
A/pochard/Siberi а/249/08-МА	2/РКЭ, 7/BALB /с, 2/MDC К	7,38±0,24	3,7+0,15	7,53±0,09	2,35±0,1

Была получена поликлональная сыворотка на курах к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08, которая обладает значимым титром в РТГА (Пример 1). Она позволит выявлять вирус гриппа Н10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигеном отношении вариантов. Шести 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного. Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (таблица 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [33].

Для контроля был проведен эксперимент с антигеном и сывороткой, полученными для другого штамма вируса гриппа H10-субтипа. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Результаты проведения РТГА
Сыв. Ag.	A/pochard/Siberia/249/08(H10N7)	A/common teal/Tynda/6114/2008(10N6)
A/pochard/Siberia/249/08(H10N7)	1/640	1/160
A/common teal/Туnda/6114/2008(H10N6)	1/640	1/160

Сыворотка, полученная на предлагаемый антиген, проявляет сродство к антигену штамма A/common teal/Tynda/6114/2008 (H10N6), принадлежность которого к H10 субтипу подтверждена сиквенированием фрагментом гена НА гемагглютинина (GenBank: GU227358). Значение титра является диагностическим [33], в связи с чем возможно использование сыворотки на предлагаемый штамм для диагностики близких антигенно вариантов вируса гриппа H10-субтипа.

Таким образом, поликлональная сыворотка к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08 обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа H10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигенном отношении вариантов.

Для длительного хранения штамм необходимо лиофилизировать с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение не менее 5 лет при хранении на -70°C. Ранее показано, что одним из способов, обеспечивающих длительное хранение жизнеспособности вирусов, является получение лиофилизированных культур (А.Ю.Селезнева, 1978). Для хранения пулы штаммов необходимо разливать в стеклянные ампулы объемом 3-5 мл и лиофильно высушивать [35].

Антиген штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа также можно длительно хранить в лиофилизированном состоянии (см. выше). Для использования его необходимо разводить фосфатно-солевым (pH 7,2) буфером соответствующего объема.

При использовании разведенного готового антигена штамма в течение одной недели допускается его хранение в холодильнике при температуре +4°C.

Таким образом, рекомендуемый штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-субтипа эффективно культивируется на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) в титрах 6,7±0,18 lg EID50/мл и на культуре клеток MDCK - в титрах 7,375±0,24 lg TCID50/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при интраназальном пути введения. Следует отметить стабильное, закономерное проявление клинических признаков заболевания и 100% летальность штамма для мышей в дозе 2,35 lg TCID50/мл. Штамм может быть использован для получения поликлональной сыворотки, используемой в диагностике вируса гриппа методом РТГА.

Анализ показывает актуальность и целесообразность использования штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА H10N7-cy6rana для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа H10-субтипа. Он может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H10-субтипа и диагностики вновь выделяемых изолятов. Кроме того, штамм может быть использован для моделирования гриппозной инфекции и изучения противовирусной активности препаратов.

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 7,53 lg EID50/мл. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/pochard/Siberia/249/08-МА (Н10N7).

В эксперименте штамм имеет одинаковые титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.

Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H10-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

По причине быстрой изменчивости вируса гриппа A, его антигенных свойств, крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа A. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа H10-субтипа в России в РТГА не существует. Отсутствует также отечественный штамм-продуцент H10 субтипа для моделирования гриппозной инфекции на мышах.

Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на основе штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08 H10N7-субтипа.

Шести 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения были у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/pochard/Siberia/249/08. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.

Таблица 4
Титры сывороток крови от куриц в РТГА с антигеном штамма A/pochard/Siberia/249/08.
Животное	Титр сыворотки до инфицирования	Титр сыворотки на 21 сутки после инфицирования
1	≤1/10	1/320
2	≤1/10	1/320
3	≤1/10	1/640
4	≤1/10	1/640
5	≤1/10	1/640
6	≤1/10	1/640

После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (таблица 4). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [33]

Таким образом, получена поликлональная сыворотка к предлагаемому штамму A/pochard/Siberia/249/08, которая обладает значимым титром в РТГА. Она позволит выявлять вирус гриппа H10-субтипа гемагглютинина наиболее близких в антигеном отношении вариантов.

Пример 2. Приготовления антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/pochard/Siberia/249/08.

Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37°С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы - 3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4 - +7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа H10-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа H10-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (таблица 2).

Пример 3. Моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c. Сравнение патогенности A/pochard/Siberia/249/08-МА с диким штаммом

Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.

Пул вируса A/pochard/Siberia/249/08-МА использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятичные разведения вируса в диапазоне концентраций 10-1 - 10-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ную гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина [9]. Рассчитанное значение MLD50 составило 2,35±0,1 lg TCID50/мл.

После определения MLD50 были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали 0,5 и 10 MLD50. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD=Σf(d-1)/n, где f - количество мышей умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае - 15), n - количество мышей в группе.

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7-8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 10±7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD - 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюдения.

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 12±4% наблюдали уже на 4-5 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с седьмого дня после заражения. К 10 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 6,1±0,6 дней.

Дикий штамм A/pochard/Siberia/249/08 в эквивалентных в дозах не оказывал видимого негативного воздействия на мышей. Не было зарегистрировано гибели мышей. При заражении мышей линии BALB/ отмечали снижение активности, потерю аппетита. Однако через 6 сут от момента инфицирования наблюдали полное клиническое выздоровление животных.

Нами была определена кинетика репликации адаптированного штаммов в легких подопытных животных. Гомогенаты легких мышей, зараженных 10 MLD50 штамма A/pochard/Siberia/249/08 -ma и 106 TCID50 штамма A/pochard/Siberia/249/08, титровали через 1,3,6 и 9 сут после заражения. Вирус A/pochard/Siberia/249/08 -ma реплицировался в легких мышей вплоть до 9 сут. Надо отметить, что к этому времени у мышей исчезли клинические симптомы заболевания, что, видимо, напрямую связано со снижением эффективности репликации вируса в легких животных.

Таблица 5
Репликация в легких мышей A/pochard/Siberia/249/08 -ma
Штамм	Титр вируса, lgTCIDSO/мл±S.D.
1 сут	3 сут	6 сут	9 сут
A/pochard/Siberia/249/08 -ma	6,2±0,53	5,5±0,19	5,35±0,9	2,015±0,5

Таким образом, адаптированный к мышам штамм A/pochard/Siberia/249/08-МА вызывает гибель мышей (2,35±0,1 lg TCID50/мл). Он может быть использован для моделирования гриппозной инфекции H10-субтипа и использоваться для исследования эффективности противовирусных препаратов согласно стандартным методикам [48].

Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа H10-субтипа, выделенным на азиатской территории России за последние 5 лет. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.

Использованные источники информации

1. Webster R.G, Bean W.J, Gorman О.Т, Chambers T.M, Kawaoka Y. Evolut