Лечение prdc у молодых свиней

Лечение prdc у молодых свиней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перечень последовательностей

В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Перечень последовательностей идентичен перечню, включенному в WO 06/072065.

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции, которая содержит антиген, представляющий собой цирковирус свиней типа 2 (PCV2), для предупреждения и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) у животных, предпочтительно у молодых (не достигших половой зрелости) свиней.

Описание известного уровня техники

Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный кольцевой геном. Последовательность PCV2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Однако в настоящее время установлено, что в отличие от PCV1, который, как правило, является невирулентным, заражение свиней PCV2 ассоциировано с рядом болезненных синдромов, которые в целом обозначают как болезни свиней, связанные с цирковирусом (PCVD) (известные также как ассоциированные с цирковирусом болезни свиней (PCVAD)) (Allan и др., IPVS Congress, 2006). Как правило, основным клиническим проявлением PCVD считается синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) (Harding и др., Swine Health Prod; 5, 1997, сс.201-203; Kennedy и др., J Comp Pathol; 122, 2000, сс.9-24). PMWS поражает свиней возрастом 5-18 недель. С клинической точки зрения PMWS характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой новорожденных и желтухой. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов (Muirhead, Vet. Rec, 150, 2002, с.456). При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах (Allan и Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, сс.3-14). Обнаружена выраженная корреляция между уровнем нуклеиновой кислоты или антигена PCV2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений. Коэффициенты смертности у свиней, пораженных PCV2, могут достигать 80%.

Доля участия PCV2 в болезнях свиней, отличных от PMWS, в настоящее время изучена недостаточно (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336). Из литературы известно несколько потенциально родственных состояний, включая комплекс респираторных болезней свиней (PRDC), синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), снижение репродуктивной функции, грануломатозные энтериты и, возможно, врожденный тремор (СТ-AII) и перинатальный миокардит (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336). Считается, что из них PRDC имеет наибольшее экономическое значение в Европе, в целом из-за широкого распространения болезни, высокого коэффициента заболеваемости (30-70% на пораженных фермах) и коэффициента смертности (4-6% на пораженных фермах) (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256).

Пневмония у молодых свиней, страдающих PRDC, вызывается комбинацией вирусных и бактериальных агентов, таких как вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус свиного гриппа (SIV), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleeuropneumoniae и Pasteurella multocida. Хотя этиология включает несколько патогенов и варьируется от фермы к ферме PRRSV и Mycoplasma hyopneumoniae представляют собой два основных патогена, выделенных из PCV2-позитивных молодых свиней, у которых обнаружен PRDC (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256). К настоящему времени отсутствуют данные о том, является ли PCV2 причинным фактором PRDC или принимает участие в проявлении, серьезности или продолжительности клинических симптомов PRDC.

По сравнению с другими вирусными патогенами PCV2 постоянно диагностируется в легочных повреждениях молодых свиней, страдающих PRDC. В перспективных исследованиях установлено, что пневмония и часто системное заболевание, которое является результатом совместного заражения PCV2 и PRRSV, бывает более серьезным, чем заболевание, ассоциированное с заражением любым из агентом индивидуально, Таким образом, можно предположить, что присутствует выраженный синергизм между PCV2 и другими патогенами в случаях респираторного заболевания в полевых условиях (Ellis и др., Veterinary Microbiol., 98, 2004, сс.159-163). Однако пока не известно, может ли PCV2, если он присутствует у молодых свиней, страдающих PRDC, оказывать влияние на клинические симптомы PRDC у молодых свиней. Из-за повсеместного распространения PCV2, о чем свидетельствует тот факт, что в конце периода откорма количество серопозитивных животных достигает 100%, может также существовать возможность того, что PCV2 вообще не оказывает воздействия на проявление заболевания PRDC, но он точно представляет собой неродственный коинфицирующий агент.

В то время как PMWS главным образом поражает молодых свиней возрастом от 5 до 12 недель, PRDC в основном выявлен у выращенных до стадии завершающего откорма свиней, как правило, возрастом примерно 16-22 недели. Коэффициент заражения составляет 30-70%, а средний коэффициент смертности 4-6% (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256). Клиническими симптомами PRDC являются пролонгированный и необычно серьезный кашель и одышка, не поддающиеся терапии с применением антибиотиков, медленный рост, пониженная эффективность откорма, вялость, анорексия и заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма.

Отличительным признаком микроскопических повреждений при PRDC является бронхоинтерстициальная пневмония с перибронхиальным и перибронхиолярным фиброзом. Альвеолярные перегородки заметно утолщены в результате инфильтратов макрофагов (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336).

Подходы к лечению вызываемых PCV2 инфекций, основанные на применении ДНК-вакцины, описаны в US 6703023. В WO 03/049703 описано получение живой химерной вакцины, содержащей каркас PCV-1, в котором ген каркаса PCV-1 заменен на иммуногенный ген патогенных штаммов PCV2. В WO 99/18214 описано несколько штаммов PCV2 и процедуры получения убитой вакцины против PVC2. Однако отсутствуют данные об их эффективности. Эффективная субъединичная вакцина на основе ОРС-2 (открытая рамка считывания 2) описана в WO 06/072065. Любая из указанных вакцин предназначена для применения с целью вакцинации/лечения свиней или молодых свиней старше 3 недель. Ни для одной из указанных вакцин не описано применение для профилактики или лечения молодых свиней, страдающих PRDC, в частности PCV2-позитивных молодых свиней, страдающих PRDC.

Кроме того, не описано, что такие вакцины обусловливают защитный иммунитет от заражения PCV2 или снижение, уменьшение серьезности или исцеление любых клинических симптомов, ассоциированных с ними у молодых свиней, которые уже имеют антитела к PCV2, предпочтительно которые имеют материнские антитела к PCV2.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - различие в приросте массы в группах, отличающихся друг от друга по возрасту на неделю;

на фиг.2 - динамика различия между массой тела (IVP-CP (обработка исследуемым ветеринарным продуктом/контрольным продуктом)) и средним уровнем вирусной нагрузки (log10) в процессе опыта.

Подробное описание изобретения

PRDC характеризуется несколькими клиническими симптомами, включая пролонгированный и необычно серьезный кашель и одышку, не поддающиеся терапии с применением антибиотиков, медленный рост, пониженную эффективность откорма, вялость, анорексию и заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма. Указанные клинические признаки ассоциированы с широким спектром различных патогенов. Участие в них, и, если это имеет место, то степень участия PCV2 в PRDC к настоящему времени не выяснено. При создании изобретения неожиданно было установлено, что среди различных патогенов PCV2 играет также важную роль в проявлении, серьезности или продолжительности клинических симптомов PRDC. Таким образом, среди прочего PCV2 является одним из причинных факторов PRDC у молодых свиней.

В целом, участие одного из причинных факторов в вызываемом несколькими возбудителями заболевании (многофакторное заболевание) типа PRDC, является не предсказуемым. Причинный фактор может не оказывать воздействия, но также изменять, подавлять, вытеснять, перекрывать или усиливать действие других факторов на проявление, серьезность и продолжительность клинических симптомов многофакторного заболевания типа PRDC. Например, снижение уровня или элиминация одного из причинных факторов многофакторного заболевания типа PRDC, может не оказывать никакого воздействия на клиническое проявление этого заболевания, если присутствует по меньшей мере один из других причинных факторов, но может также существенно снижать клинические симптомы болезни, даже в присутствии любого из других причинных факторов. Чем большее количество причинных факторов принимают участие, тем меньше вероятность того, что снижение уровня или элиминация только одного из причинных факторов окажет положительное воздействие на продолжительность проявления, серьезность или продолжительность болезни. При создании изобретения неожиданно было установлено, что проявление, серьезность или продолжительность клинических симптомов PRDC у молодых свиней можно уменьшать или снижать путем профилактики или лечения имеющих риск возникновения или пораженных животных с помощью антигена PCV2. В частности, серьезность и продолжительность клинических симптомов, ассоциированных PRDC, можно значительно уменьшать или снижать у молодых свиней, зараженных PCV2 в сочетании с патогенами, в отношении которых известно, что они вызывают или могут быть ассоциированы с PRDC у молодых свиней, такими как PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Другими словами, профилактика или лечение молодых свиней, страдающих PRDC, с помощью антигена PCV2 оказывает положительное воздействие на общее состояние здоровья молодых свиней, прирост массы в процессе откорма и смертность молодых свиней в период от средней до завершающей фазы откорма, в частности, известно, что на такие из указанных факторов, как общее состояние здоровья, прирост массы, смертность, оказывают отрицательное воздействие PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida.

Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животных, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении.

Клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, выбирают из группы, включающей кашель и одышку, медленный рост, пониженную эффективность откорма, вялость, анорексию и/или заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма. Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения кашля и одышки, медленного роста, пониженной эффективности откорма, вялости, анорексии и/или заметного повышения смертности, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении. Предпочтительно кашель и одышка не поддаются терапии с применением антибиотиков.

Понятие «антиген» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина. Антиген в контексте настоящего описания включает полноразмерную последовательность любых белков PCV2, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает иммунный ответ у хозяина. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn E. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Например, линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс.3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, сс.709-715. Аналогично этому, конформационные эпитопы легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше).

Понятие включает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие полученные методами рекомбинации или синтеза антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, сс.2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, сс.3242-3249; Suhrbier А., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, сс.402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня - 3 июля 1998 г.).

Понятие «иммунный ответ» относится, но, не ограничиваясь только этим, к формированию в хозяине клеточно- и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющий интерес антиген, композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает, но, не ограничиваясь только ими, одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, B-клеток, T-клеток-хелперов, T-клеток-супрессоров и/или цитотоксических T-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению уровня или серьезности, либо по отсутствию одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заражением хозяина PCV2, замедлению появления вируса в крови (виремия), снижению персистентности вируса, снижению общей вирусной нагрузки и/или снижению вирусной экскреции.

Понятия «иммуногенная композиция» или «вакцина» (оба понятия являются синонимами) в контексте настоящего описания относятся к любой фармацевтической композиции, которая содержит антиген PCV2, при этом, композицию можно применять для предупреждения или лечения ассоциированного с заражением PCV2 заболевания или состояния у животного. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ на PCV2. Под это понятие подпадают как субъединичные иммуногенные композиции, описанные ниже, так и композиции, которые содержат убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.

Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция представляет собой субъединичную иммуногенную композицию, композицию, содержащую полностью обезвреженные или ослабленные и/или инактивированные PCV2.

В контексте настоящего описания понятие «субъединичная иммуногенная композиция» относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, выведенные или являющиеся гомологами антигена PCV2. Такая композиция практически свободна от интактного PCV2. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают по меньшей мере из частично очищенных или фракционированных (предпочтительно практически очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV2, или их рекомбиантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединицу антигена или антигенов, представляющих интерес, которые практически свободны от других антигенов или полипептидов из PCV2 или являются фракционированными. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция содержит белок ОРС-2 PCV2, описанный ниже. Наиболее предпочтительными являются иммуногенные субъединичные композиции, которые содержат любой из антигенов PCV2, представленных в WO 06/072065, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Таким образом, следующим объектом изобретения является иммуногенная композиция, как она определена в контексте настоящего описания, которая наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ОРС-2 PCV2. ДНК ОРС-2 PCV2 и белок, которые применяют согласно изобретению для приготовления композиций и с помощью способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой высоко консервативный домен в изолятах PCV2 и поэтому согласно изобретению любая ОРС-2 PCV2 должна быть эффективной в качестве источника ДНК ОРС-2 PCV и/или полипептида. Предпочтительным белком ОРС-2 PCV2 является белок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:11 в WO 06/072065. Другим предпочтительным полипептидом ОРС-2 PCV является полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 в WO 06/072065. Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что последовательность может варьироваться в пределах 6-10% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, путем экспериментов по контрольному заражению, описанных в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, когда модифицированный антиген обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой антигенный белок ОРС-2 PCV2, который обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:5 в WO 06/072065.

В некоторых вариантах иммуногенные участки белка ОРС-2 PCV2 применяют а качестве антигенного компонента в иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Понятие «иммуногенный участок» в контексте настоящего описания относится к укороченным и/или имеющим замены формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ОРС-2 PCV2 соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. PCV. Две предпочтительные в этом плане последовательности представлены в виде SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в WO 06/072065. Следует понимать также, что указанные последовательности могут представлять собой часть более крупных фрагментов или укороченных форм.

Как указано выше, предпочтительным является также любой полипептид ОРС-2 PCV2, который кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Кроме того, как должно быть очевидно специалистам в данной области, эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. В некоторых вариантах укороченные или имеющие замены формы или фрагменты полипептида ОРС-2 PVC2 применяют в качестве антигенного компонента в композиции. Предпочтительно такие укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.

Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к родству между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости отрезков указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей легко можно рассчитывать с помощью известных методов, включая, но, не ограничиваясь только ими, описанные в: Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A.N., изд-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H.G., изд-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, c.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей для рассматриваемых последовательностей. Примерами таких программ являются, но, не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410). Программа BLASTX является доступной общественности от фирмы NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVINLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того, что получать наиболее высокий уровень идентичности последовательностей для рассматриваемой последовательности и референс-последовательности. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще боле предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще боле предпочтительно на 95% с нуклеотидной референс-последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5′- или 3′-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Аналогично этому, когда упоминают полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, то подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не относят к совместимым при определении идентичности последовательностей.

Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродуцируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того, чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95% гомологию последовательности с референс-последовательностью, 85%), предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%), предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.

Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид, имеющий сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., в результате чего общая функциональность не изменяется существенно.

Понятие «выделенный» означает «измененный человеком» относительно его встречающегося в естественных условиях состояния, т.е., если он встречается в природе, то его изменяют или удаляют из естественного окружения, или осуществляют и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, встречающийся в естественных условиях в живом организме, не является «выделенным», но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материала, вместе с которым он присутствует в своем естественном состоянии, является «выделенным» согласно применяемому в описании понятию.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где белок ОРС-2 PCV2 представляет собой любой из указанных выше белков. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 представляет собой:

I) полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в WO 06/07065;

II) любой полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду, указанному в I);

III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в I) и/или II);

IV) иммуногенный фрагмент, указанный в III), который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, входящих в последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в WO 06/072065,;

V) полипептид, который кодируется ДНК, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065;

VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду, указанному в V);

VII) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, которые кодируются полинуклеотидом, указанным в V) и/или VI);

VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, входящих в последовательности, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065.

Предпочтительно любой из указанных иммуногенных фрагментов имеет иммуногенный характеристики белка ОРС-2 PCV2, кодируемого последовательностями, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/07065.

Таким образом, согласно следующему объекту изобретения белок ОРС-2 PCV2 содержится в иммуногенной композиции с таким уровнем включения антигена, который является эффективным для индукции требуемого иммунного ответа, а именно для снижения количества случаев, уменьшения серьезности или предупреждения или снижения PRDC и/или одного или нескольких клинических симптомов, ассоциированных с PRDC. Предпочтительно уровень включения белка ОРС-2 PCV2 соответствует по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.

Согласно еще одному объекту изобретения уровень включения антигена ОРС-2 PCV составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ОРС-2 PCV2, описанного выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу.

Полипептид ОРС-2 PCV2, применяемый в иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать любым методом, включая выделение и очистку ОРС-2 PCV2, стандартный метод синтеза белков и метод рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы получения полипептида ОРС-2 PCV2 представлены в WO 06/072065, сущность и содержание которой полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В целом, метод состоит в следующем: заражают чувствительные клетки рекомбинантным вирусным вектором, который содержит кодирующие последовательности ДНК ОРС-2 PCV2, экспрессируют полипептид ОРС-2 PCV2 с помощью рекомбинантного вируса и выделяют экспрессируемый полипептид ОРС-2 PCV2 из супернатанта путем фильтрации, и инактивируют общепринятым методом, предпочтительно используя бинарный этиленимин (БЭИ), который затем нейтрализуют для прекращения процесса инактивации.

Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой белок ОРС-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, и II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, иммуногенная композиция может содержать I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей часть вирусного вектора, экспрессирующего белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть супернатанта клеточной культуры.

Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный ОРС-2 PCV2, предпочтительно экспрессируемый в бакуловирусе ОРС-2 PCV2. Предпочтительно рекомбинантные или экспрессируемые в бакуловирусе ОРС-2 PCV2 имеют указанную выше последовательность.

Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания отн