Способ активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных

Способ активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных

Реферат

Изобретение относится к области клеточной биологии и может найти применение в медицине для восстановления гемопоэза у лиц пожилого и старческого возраста.

В настоящее время в современной биомедицине формируется новый раздел - клеточная терапия, которая позволяет с помощью трансплантации клеток восполнить недостаточную функциональную активность тканей и регенерировать поврежденные органы. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют стволовые клетки, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. В связи с этим применение стволовых клеток является наиболее перспективным направлением клеточной терапии (Grossman Т. Latest advances in antiaging medicine. Keio J Med. 2005; 54(2):85-94).

В течение процесса старения стволовые клетки претерпевают как количественные, так и качественные изменения, которые влияют как на скорость старения, так и на продолжительность жизни организма. С возрастом, вследствие угнетения выработки факторов роста, развивается распространенный G1/S блок клеточного цикла, что приводит к прогрессивной убыли стволовых клеток и снижает регенерационные возможности различных тканей и органов. Исследования на человеке и различных животных показали, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) стареют, показывая существенное снижение функциональной способности с увеличением возраста. Поддержание нормальной функции ГСК является критически важным для коагуляции крови, транспорта кислорода, а также в повышении специфической и неспецифической резистентности организма.

Преодоление генерализованного G1/S блока клеточного цикла с целью активации регенерации миелоидной ткани при старении обеспечивается применением заместительной гормональной терапии: стимуляцией оси СТГ-инсулиноподобные факторы роста (ИПФР). Повышение уровня ИПФР приводит к преодолению блока для процессов дифференциации и пролиферации клеток и последующему самообновлению тканей (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).

В то же время, проведенные исследования по восстановлению регенерации тканей в возрастном аспекте с использованием факторов роста зачастую противоречат друг другу. Так было установлено, что пожилые люди с высоким уровнем гормона ИПФР-1 живут дольше и уровень регенерации тканей у них выше, чем у пожилых людей с низким уровнем ИФР-1 (Brugts et al. Low Circulating IGF-I Bioactivity in Elderly Men is Associated with Increased Mortality. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2008; DOI: 10.1210/jc.2007-1633).

Однако исследования на лабораторных мышах установили, что гипофизэктомия (Bartke A., Brown-Borg H., Mattison J. et al. Prolonged longevity of hypopitui-tary mice// Exp. Gerontol. 2001. Vol.36. P.21-28.), a также генетические модификации (Coschigano et al., Endocrinology. 2000, 141(7):2608-2613), направленные на снижение чувствительности рецептора к соматотропному гормону (СТГ) приводят к увеличению продолжительности жизни мышей. На сегодняшний день доказана возможность инсулина и ИПФР-1 существенно снижать устойчивость клеток организма к стрессу через угнетение работы транскрипционных факторов FOXO и SKN-1 вследствие снижения образования агентов периферической стресс-лимитирующей системы (Direct Inhibition of the Longevity-Promoting Factor SKN-1 by Insulin-like Signaling in C. elegans Tullet JMA, Hertweck MT, Ai. JH, Baker J, Hwang JY, Liu S, Oliveira RP, Baumeister R, and Blackwell TK Cell, Vol 132, 1025-1038, 21 March 2008).

Следующим направлением в активации регенерации миелоидной ткани при старении является коррекция антиоксидантного статуса с использованием антиоксидантов (витамин Е, витамин С). Однако все антиоксиданты обладают очень ограниченной «емкостью» для поглощения активных форм кислорода и инактивации продуктов свободнорадикального окисления (А.А. Кишкун. «Биологический возраст и старение: возможности определения и пути коррекции»: Руководство для врачей. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008, - 976).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления миелоидной ткани старых лабораторных животных (лабораторные крысы возраст 3 года, масса 300 г) в физиологических условиях (без воздействия ионизирующего излучения), путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты, в количестве 2 млн клеток на 1 животное (или 6·10⁶ клеток/кг) (Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, на регенерацию миелоидной ткани старых животных в условиях воздействия ионизирующего излучения / А.П. Ястребов, И.Ю. Маклакова, Д.Ю. Гребнев, С.Е. Емельянова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2008. - №4. - С.93-97.) - прототип.

Данный способ обеспечивает активацию регенераторного потенциала тканей, ингибированного при старении. Однако использование трансплантации ММСК оказывает недостаточное действие на активацию регенерации миелоидной ткани у старых лабораторных животных.

Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к активации регенерации миелоидной ткани при старении.

Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в снижении количества цитогенетически измененных клеток.

Технический результат достигается тем, что в способе активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных путем внутривенной аллогенной трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг, дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг.

Сущность изобретения состоит в сочетанной трансплантации лабораторным животным ММСК и ГСК.

Свойство ММСК вырабатывать хемоаттрактант для ГСК (SDF-1) обеспечит увеличение пула ГСК в костном мозге за счет трансплантированных (аллогенных) ГСК, что в свою очередь будет способствовать восстановлению гемопоэза (Журнал Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. Том II, №3, 2007. Страница 21-22. «Регуляция хоуминга клеток-предшественников в область инфаркта миокарда методом пролонгированной секреции фактора SDF-1»).

Доза трансплантируемых ГСК (300 тыс. клеток/кг) подобрана экспериментальным путем.

Плюрипотентность ММСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию ММСК. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и формировать микроокружение для ГСК. ММСК способствуют направленной миграции ГСК: вырабатывая SDF-1 (определяет миграцию ГСК через рецепторы CXCR4 на поверхности ГСК). ММСК способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции ряда цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15, макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста стволовой клетки. Постоянным продуктом секреции ММСК является простагландин Е2 (иммуносупрессивный фактор), способный снижать экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 на поверхности периферических лимфоцитов, что препятствует их активации.

Из анализа научно-технической и патентной литературы сочетанной внутривенной трансплантации ММСК и ГСК, приводящей к снижению количества цитогенетически измененных клеток, оказывающих цитопротективное действие на миелоидную ткань, а следовательно, к повышению активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Эксперименты выполнены на 36 белых лабораторных мышах-самцах возраста 3 года, массой 50 г. Эксперименты по получению культуры ММСК и ГСК выполнены на 18 лабораторных животных мышах-самках возраста 3-4 месяца, массой 30 г, срок гестации 18 дней. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария, предусмотренных «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г. и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения». Манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с положениями Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии.

Количество экспериментальных животных и распределение их по сериям экспериментов представлены в таблице 1.

Животным опытной группы внутривенно однократно вводилась суспензия ММСК и ГСК соответственно в дозе 6 млн кл./кг и 300 тыс. кл./кг, животным контрольной группы внутривенно однократно вводили 0,9% раствор NaCl - 0,2 мл внутривенно (см. Таблицу 1). Кроме того, животным по прототипу вводили ММСК в количестве 6 млн клеток/кг (см. Таблицу 2). Забой животных осуществлялся на 1 и 7 сутки после трансплантации клеток.

Таблица 1
Распределение животных по сериям экспериментов
Животные	Путь введения	Препарат	Время проведения аутопсии органов
24 часа	7 сутки
Старые	в/в	ММСК 6 млн кл./кг и ГСК 300 тыс. кл./кг в 0,2 мл физраствора	9 шт.	9 шт.
в/в	0,9% р-р NaCl 0,2 мл	9 шт.	9 шт.

Таблица 2
Распределение животных по сериям экспериментов
Животные	Путь введения	Препарат	Время проведения аутопсии органов
24 часа	7 сутки
Старые	в/в	ММСК 6 млн кл./кг 0,5 мл физраствора	9 шт.	9 шт.
в/в	0,9% р-р NaCl 0,5 мл	9 шт.	9 шт.

Приготовление, окраску, микроскопию и подсчет микроядер в полихроматофильных нормобластах костного мозга крыс осуществляли следующим образом.

На обезжиренное оптическое стеклышко наносили сыворотку AB₀ (IV) группы крови человека. Далее стеклянной палочкой, круговыми движениями готовили суспензию клеток костного мозга (она должна быть определенной плотности - иметь беловатую опалесцирующую окраску). Затем каплю этой суспензии наносили на край обезжиренного предметного стекла. Распределение материала по стеклу осуществляли перемещением позади шлифованного стекла под углом 45°. Оптимальная длина мазка - 2-3 см.

Мазок высушивался на воздухе в течение суток.

Окрашивание мазков по Паппенгейму производили на следующий день с последующей фиксацией в метаноле в течение 1 минуты. (Краситель - Май-Грюнвальд (спиртовой раствор) смешивался с фосфатным буфером 1:1. Время покраски - 1,5 мин.)

Затем сливаем краску и без промывания заливаем раствором красителя Романовского-Гимзы. Время покраски - 10 минут.

Раствор Романовского-Гимзы готовили на водопроводной воде 1:6 (10 мл Романовского + 60 мл воды). Краску готовили непосредственно перед окрашиванием.

Затем промывали в гистологичеких стаканчиках под струей воды (струя не на стекла).

Цитологические препараты костного мозга анализировались с помощью микроскопа Micros МС-50(Австрия) при увеличении 100*15.

Микроядерный тест (МЯТ) рассчитывали как отношение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами к 1000 подсчитанных полихроматофильных эритроцитов, выраженное в промилях (Методические рекомендации по оценке мутагенной активности химических веществ микроядерным тестом, подготовлены Всесоюзным научно-исследовательским институтом дезинфекции и стерилизации Министерства здравоохранения СССР, Москва 1984).

М Я Т = Ч и с л о   п о л и х р о м а т о ф и л ь н ы х   э р и т р о ц и т о в   с   м и к р о я д р а м и 1000   п о л и х р о м а т о ф и л ь н ы х   э р и т р о ц и т о в * 1000 %

Получение культуры ММСК

Производилось выделение плаценты (срок гестации 18 дней), образец ткани массой 1 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при pH 7.2, без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед./мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин. при 37°C). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных не измельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-МЕМ, содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g.

Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл./см² на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания).

1.1. Условия культивирования ММСК

Культивирование производилось при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% СO₂.

1.2. Подсчет клеток

Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле: X=а*10000, где X - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

1.3. Субкультивирование ММСК

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°C. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с СЭК (10%), и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в нужной концентрации (10000 кл./ см²).

1.4. Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).

Выделение ГСК

Для выделения ГСК использовали набор Mouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set-DM. (StemCell Technologies, Канада).

Методы статистической обработки полученных результатов

Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий между подгруппами оценивали с помощью t - критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при p<0,05.

Анализируя данные микроядерного теста старых лабораторных животных, мутагенного действия ММСК не выявлено, т.к. количество ядер соответствует спонтанному уровню мутагенеза (таблица 3).

Таблица 3
Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 1 сутки после введения, М±m (n=9)
Параметры	Значение
Заявляемый способ	Прототип
Микроядерный тест, %	3,37±0,30	8,83±1,83

Как видно из таблицы, по заявляемому способу микроядерный тест в 2,3-2,9 раза ниже по сравнению с прототипом.

Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки по заявляемому способу и способу по прототипу показаны в таблице 4.

Таблица 4
Содержание цитогенетически измененных клеток костного мозга у старых лабораторных животных на 7 сутки после введения, М±m (n=9)
Параметры	Значение
Старые	Прототип
Микроядерный тест, %	1,50±0,30	5,60±1,27

Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу микроядерный тест в 3,6-3,8 раза ниже по сравнению с прототипом, что приводит к снижению спонтанного уровня мутагенеза у старых лабораторных животных. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в физиологических условиях у старых лабораторных животных сочетанная трансплантация ММСК и ГСК на 7 сутки приводит к уменьшению содержания цитогенетически измененных клеток. Сравнивая данные по активации регенерации у старых лабораторных животных после трансплантации ММСК и сочетанной трансплантации ММСК и ГСК, следует отметить существенно большую эффективность сочетанной трансплантации. Так, после сочетанной трансплантации ММСК и ГСК на 7 сутки в физиологических условиях установлено, что содержание цитогенетически измененных клеток уменьшалось после введения ММСК и сочетанной трансплантации соответственно на 41,0% и 57,1%.

Выводы

У старых лабораторных животных в физиологических условиях ММСК и ГСК оказывает цитопротективное действие на миелоидную ткань за счет уменьшения цитогенетически измененных клеток.

Способ активации регенерации миелоидной ткани старых лабораторных животных, включающий внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из плаценты в количестве 6 млн клеток/кг, отличающийся тем, что дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови в количестве 300 тыс. клеток/кг.