Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа

Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники изобретения

Вакцины против разных и эволюционирующих штаммов вирусов гриппа имеют важное значение с точки зрения здравоохранения и коммерции, поскольку каждый год большое число субъектов инфицируется разными штаммами и типами вируса гриппа. Риск смерти от таких инфекций особенно высок у детей младшего возраста, пожилых людей, субъектов, не получающих достаточную медицинскую помощь, и больных СПИДом. Сложность проблемы инфицирования вирусом гриппа заключается в том, что новые штаммы вируса гриппа легко эволюционируют и могут распространяться среди разных видов, что требует непрерывной разработки новых вакцин.

Многочисленные вакцины, способные обеспечивать защитный иммунный ответ, специфичный для разных вирусов/штаммов вирусов гриппа, производятся более 50 лет и включают в себя цельно-вирионные вакцины, вакцины из разрушенных вирусов, вакцины на основе поверхностного антигена и живые ослабленные вирусные вакцины. Однако, хотя подходящие композиции всех указанных типов вакцин могут генерировать системный иммунный ответ, живые ослабленные вирусные вакцины обладают преимуществом, которое заключается в способности стимулировать мукозальный иммунитет в респираторном тракте. Авторами настоящего изобретения и их коллегами была проведена большая работа по получению вирусов гриппа и их фрагментов, которые можно использовать для производства вакцин; см., например, заявку США № 60/420708, поданную 23 октября 2002 г., заявку США № 10/423828, поданную 25 апреля 2003 г., и заявку США № 60/574117, поданную 24 мая 2004 г., имеющие общий заголовок "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus".

Из-за непрерывного появления (или повторного появления) разных штаммов вируса гриппа, постоянно требуются новые вакцины против гриппа. Такие вакцины обычно получают, используя антигенные фрагменты новых вирусных штаммов, следовательно, полипептиды и полинуклеотиды новых, недавно появившихся, или повторно появившихся вирусных штаммов (особенно, последовательности антигенных генов) вызывают большой интерес. Кроме того, большое внимание уделяется предпочтительным векторам, содержащим такие последовательности.

Настоящее изобретение предлагает новые и/или недавно выделенные варианты гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа, необязательно в составе предпочтительных векторов, которые можно использовать для получения разных типов вакцин, а также для исследовательских, диагностических и других целей. Многочисленные другие преимущества станут ясны из нижеследующего описания.

Сущность изобретения

В некоторых аспектах данное изобретение предлагает выделенный или рекомбинантный полипептид, выбранный из группы, включающей в себя: полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую одной из нуклеотидных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую одной из нуклеотидных последовательностей, включающих в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25, остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28; полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, включающую в себя: остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26; любой полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с практически полноразмерной полинуклеотидной последовательностью из списка последовательностей; а также фрагмент любого из вышеуказанных полипептидов, последовательность которого включает в себя полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или фрагмент полипептида гемагглютинина или нейраминидазы. В разных воплощениях выделенные или рекомбинантные полипептиды данного изобретения являются практически идентичными фрагменту любого из вышеуказанных полипептидов, содержащему примерно 300 смежных аминокислотных остатков. В следующих воплощениях данное изобретение предлагает выделенные или рекомбинантные полипептиды (включающие в себя гемагглютинин или нейраминидазу, или фрагменты гемагглютинина или нейраминидазы), которые содержат аминокислотную последовательность, практически идентичную, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 500 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 502 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 550 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 559 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 565 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 566 аминокислотам, образующим непрерывную цепь, любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28. В следующих воплощениях данное изобретение предлагает выделенные или рекомбинантные полипептиды (например, включающие в себя нейраминидазу, гемагглютинин, или фрагменты нейраминидазы или гемагглютинина), которые содержат аминокислотную последовательность, практически идентичную, по меньшей мере, примерно 350 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 400 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 436 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 450 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 451 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 465 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 466 аминокислотам; по меньшей мере, примерно 469 аминокислотам; или, по меньшей мере, примерно 470 аминокислотам, образующим непрерывную цепь, любой из последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28. Разумеется, в некоторых воплощениях полипептидная последовательность (например, одна из перечисленных здесь последовательностей SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28) содержит менее 565, 559 и т.п. аминокислот. В следующих воплощениях полипептиды данного изобретения необязательно включают в себя гибридные белки, белки, содержащие лидерную последовательность, полипептиды-предшественники, белки, содержащие секреторный сигнал или сигнал локализации, или белки, содержащие маркерный эпитоп, E-маркер, His-маркерный эпитоп и др. В других воплощениях данное изобретение предлагает полипептид, последовательность которого, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, по меньшей мере, на 98,5%, по меньшей мере, на 99%, по меньшей мере, на 99,2%, по меньшей мере, на 99,4%, по меньшей мере, на 99,6%, по меньшей мере, на 99,8%, или, по меньшей мере, на 99,9% идентична последовательности, по меньшей мере, одного из перечисленных выше полипептидов (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26). В некоторых воплощениях такие полипептиды являются иммуногенными. Последовательности HA данного изобретения могут содержать как немодифицированные, так и модифицированные многоосновные участки расщепления.

В других аспектах данное изобретение предлагает композицию, содержащую один или несколько из перечисленных выше полипептидов или их фрагментов. Изобретение также включает в себя полипептиды, которые специфически связываются поликлональной антисывороткой, полученной против, по меньшей мере, 1 антигена, содержащего, по меньшей мере, одну из описанных выше аминокислотных последовательностей (например, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26), или ее фрагмент. Антитела, специфичные к описанным выше полипептидам, также являются признаками данного изобретения. Полипептиды данного изобретения необязательно являются иммуногенными.

Данное изобретение также охватывает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких из описанных выше полипептидов, а также способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие в себя введение субъекту иммунологически эффективного количества одного или нескольких из описанных выше полипептидов (таких как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 или остатки 363-585 SEQ ID NO:26) в физиологически приемлемом носителе. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую три реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и реассортантный вирус гриппа B. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой трехвалентную иммуногенную композицию, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3 и реассортантный вирус гриппа B. В другом воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую четыре реассортантных вируса гриппа. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую два реассортантных вируса гриппа A и два реассортантных вируса гриппа B. В одном воплощении иммуногенная композиция данного изобретения представляет собой тетравалентную иммуногенную композицию, содержащую реассортантный вирус гриппа A типа H1, реассортантный вирус гриппа A типа H3, реассортантный вирус гриппа B линии Victoria и реассортантный вирус гриппа B линии Yamagata.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает реассортантный вирус гриппа, который содержит сегмент генома, кодирующий один или несколько из описанных выше полипептидов (например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 или остатки 363-585 SEQ ID NO:26), а также иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество такого реассортантного вируса гриппа. Способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, которые включают в себя введение иммунологически эффективного количества такого реассортантного вируса гриппа в физиологически приемлемом носителе, также являются частью данного изобретения. В одном воплощении реассортантный вирус гриппа данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 6:2, который содержит 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как A/AA/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, которые более широко известны как PR8, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и 2 геномных сегмента (кодирующих в основном и предпочтительно HA и NA, или их фрагменты), содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или из нуклеотидной последовательности, подобной, как определено в данном описании, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27. Иммуногенные композиции, содержащие такой реассортантный (рекомбинантный) вирус, также являются признаками данного изобретения.

В других аспектах данное изобретение предлагает выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, выбранный из группы, включающей в себя: полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27, или комплементарных им последовательностей; полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или комплементарную ей последовательность; полинуклеотиды, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, или комплементарные им нуклеотидные последовательности; полинуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с любой из вышеуказанных полинуклеотидных последовательностей практически по всей ее длине, и полинуклеотидную последовательность, содержащую полностью или частично одну из вышеуказанных полинуклеотидных последовательностей, которая кодирует полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или один или несколько фрагментов HA или NA. Такие полинуклеотиды могут представлять собой ДНК, РНК, кРНК, гибриды ДНК:РНК, одноцепочечные полинуклеотиды, двухцепочечные полинуклеотиды и др. Изобретение также включает в себя все вышеуказанные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, или фрагменты гемагглютинина или нейраминидазы. Другие аспекты данного изобретения включают в себя выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептид (необязательно, полипептид гемагглютинина или нейраминидазы), последовательность которого, по меньшей мере, на 95% идентична, по меньшей мере, на 96% идентична, по меньшей мере, на 97% идентична, по меньшей мере, на 98% идентична, по меньшей мере, на 98,5% идентична, по меньшей мере, на 99% идентична, по меньшей мере, на 99,2% идентична, по меньшей мере, на 99,4% идентична, по меньшей мере, на 99,6% идентична, по меньшей мере, на 99,8% идентична, или, по меньшей мере, на 99,9% идентична, по меньшей мере, одному из описанных выше полипептидов. Изобретение также включает в себя выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие полипептид гемагглютинина или нейраминидазы, полученные в результате мутации или рекомбинации одной или нескольких из описанных выше полинуклеотидных последовательностей. Полинуклеотидные последовательности данного изобретения могут необязательно содержать один или несколько элементов, выбранных из группы, включающей в себя, например, лидерную последовательность, последовательность-предшественник, последовательность эпитопного маркера и т.п., и могут необязательно кодировать гибридный белок (например, последовательности, содержащие одну или несколько других нуклеотидных последовательностей). Такие полинуклеотиды данного изобретения могут необязательно кодировать иммуногенные полипептиды.

В следующих воплощениях данное изобретение предлагает представляющую интерес композицию, содержащую два или более из описанных выше полинуклеотидов или их фрагментов (например, библиотеку, содержащую, по меньшей мере, примерно 2, 5, 10, 50 или более полинуклеотидов). Такие композиции можно получить путем расщепления одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов (например, путем механического расщепления, химического расщепления, ферментативного расщепления под действием рестрикционной эндонуклеазы/РНКазы/ДНКазы и др.). Другие композиции данного изобретения включают в себя, например, композиции, полученные путем инкубации одного или нескольких описанных выше полинуклеотидов в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов термостабильной полимеразы. Иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного из вышеуказанных полинуклеотидов, также входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также охватывает реассортантные вирусы гриппа, содержащие один из вышеуказанных полинуклеотидов. В одном воплощении такие реассортантные вирусы представляют собой реассортантные вирусы 6:2, которые содержат 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как A/AA/6/60, B/AA/1/66 (иногда называемых в данном описании B/Ann Arbor/1/66), B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, или B/England/2608/76 или A/Puerto Rico/8/34) и 2 геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. В одном воплощении два геномных сегмента кодируют гемагглютинин и/или нейраминидазу. Иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективные количества такого реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа, также входят в объем настоящего изобретения.

Векторы, содержащие один или несколько полинуклеотидов, имеющих нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, или их фрагментов, также входят в объем настоящего изобретения. Такие векторы (например, векторы экспрессии) необязательно могут представлять собой плазмиды, космиды, фаги, вирусы, фрагменты вирусов и др. Особенно предпочтительные воплощения включают в себя плазмидные векторы, используемые в способах плазмидной помощи для получения вирусов (например, обычного реассортантного/рекомбинантного вируса для применения в вакцинах). Примеры таких плазмидных систем раскрыты, например, в заявке США № 60/420708, поданной 23 октября 2002 г., заявке США № 10/423828, поданной 25 апреля 2003 г., и заявке США № 60/574117, поданной 24 мая 2004 г., озаглавленных "Multi-Plasmid System for the Production Influenza Virus"; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; опубликованной патентной заявке США № 20020164770, Hoffmann; и патенте США № 6544785, выданном 8 апреля 2003 г., Palese, et al. В объем настоящего изобретения также входят клетки, содержащие такие векторы, а также клетки, трансдуцированные, трансформированные, трансфицированные и т.п. такими векторами.

Данное изобретение также охватывает клетки, содержащие, по меньшей мере, один из описанных выше полинуклеотидов, или его расщепленный или амплифицированный фрагмент или продукт. Такие клетки могут необязательно экспрессировать полипептид, кодируемый таким полинуклеотидом. Другие воплощения данного изобретения включают в себя векторы (например, плазмиды, космиды, фаги, вирусы, фрагменты вирусов и др.), содержащие один из описанных выше полинуклеотидов. В одном воплощении такие векторы представляют собой векторы экспрессии.

Данное изобретение также охватывает вирус (например, вирус гриппа), содержащий один или несколько из описанных выше полинуклеотидов (например, полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и необязательно кодирующий гемагглютинин и/или нейраминидазу), или один или несколько их фрагментов. В одном воплощении такие вирусы представляют собой реассортантные/рекомбинантные вирусы. Иммуногенные композиции, содержащие реассортантный/рекомбинантный вирус данного изобретения, также являются частью настоящего изобретения. В одном воплощении реассортантный вирус данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 6:2, содержащий 6 внутренних геномных сегментов одного или нескольких донорных вирусов (таких как базовый или каркасный донорный вирус, например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76 и др.) и 2 геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. В другом воплощении реассортантный вирус данного изобретения представляет собой реассортантный вирус 7:1, содержащий 6 внутренних геномных сегментов и 1 геномный сегмент, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, из одного или нескольких донорных вирусов (таких как базовый или каркасный донорный вирус, например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, B/England/2608/76 и др.), а также 1 геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. Реассортантные вирусы (необязательно, живые вирусы) данного изобретения могут представлять собой донорные вирусы, включающие в себя один или несколько, например, из термочувствительных (ts), адаптированных к низким температурам (ca) или аттенуированных (att) вирусов. В одном воплощении реассортантные вирусы данного изобретения содержат, по меньшей мере, один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре, по меньшей мере, пять или шесть внутренних геномных сегментов одного из штаммов A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, или B/England/2608/76. Во многих воплощениях полученные вирусы представляют собой живые вирусы (например, используемые для получения вакцин и др.). Другие воплощения включают в себя мертвые или инактивированные вирусы (например, также подходящие для получения вакцин и др.). Клетки, содержащие вирус данного изобретения, также являются предметом данного изобретения.

Способы получения реассортантного/рекомбинантного вируса гриппа посредством культивирования клетки-хозяина, несущей полинуклеотид данного изобретения, также входят в объем настоящего изобретения. В одном воплощении способ данного изобретения включает в себя:

введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность включает в себя, по меньшей мере, 6 внутренних геномных сегментов первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и, по меньшей мере, один геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа;

культивирование популяции клеток-хозяев; и

выделение совокупности вирусов гриппа.

В одном воплощении первый штамм вируса гриппа представляет собой адаптированный к низким температурам, и/или термочувствительный, и/или аттенуированный штамм. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, можно использовать для введения в составе интраназальной вакцинной композиции. В другом воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, можно использовать для введения в виде убитой или инактивированной вакцинной композиции, живой/аттенуированной не назальной вакцинной композиции и др. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, представляет собой вирус гриппа A. В одном воплощении вирус, полученный по способу данного изобретения, представляет собой вирус гриппа B. В таких способах можно использовать клетки-хозяева, включающие в себя, без ограничения, например, клетки Vera, клетки PerC6, клетки MDCK, клетки 293T, клетки COS и др. В одном воплощении способ данного изобретения не включает в себя применение вируса-помощника. В одном воплощении совокупность векторов состоит из восьми плазмидных векторов.

В других воплощениях данное изобретение предлагает иммуногенные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество одного или нескольких из описанных выше реассортантных вирусов гриппа (например, живого вируса). Другие воплощения включают в себя способы стимуляции иммунной системы субъекта с индукцией защитного иммунного ответа против вируса гриппа, включающие в себя введение субъекту иммунологически эффективного количества одного или нескольких описанных выше реассортантных вирусов гриппа (необязательно в физиологически приемлемом носителе).

В других аспектах данное изобретение предлагает способы получения выделенного или рекомбинантного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26, где указанные способы включают в себя культивирование клетки-хозяина, содержащей описанный выше полинуклеотид, в подходящей культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного полипептида, и выделение полипептида из одной или нескольких клеток-хозяев, или из среды, в которой их выращивают.

Иммуногенные композиции также являются признаками данного изобретения. Например, иммуногенные композиции, которые содержат один или несколько полипептидов (например, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, остатки 17-345 SEQ ID NO:2, остатки 346-566 SEQ ID NO:2, остатки 18-343 SEQ ID NO:6, остатки 344-565 SEQ ID NO:6, остатки 18-361 SEQ ID NO:10, остатки 16-361 SEQ ID NO:10 и остатки 362-584 SEQ ID NO:10, остатки 17-345 SEQ ID NO:14, остатки 346-566 SEQ ID NO:14, остатки 18-343 SEQ ID NO:18, остатки 344-565 SEQ ID NO:18, остатки 16-362 SEQ ID NO:22, остатки 363-585 SEQ ID NO:22, остатки 16-362 SEQ ID NO:26 и остатки 363-585 SEQ ID NO:26) и/или полинуклеотидов (например, полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25) данного изобретения и, необязательно, эксципиент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент, или один или несколько фармацевтически приемлемых компонентов для введения. В некоторых воплощениях иммуногенная композиция данного изобретения содержит реассортантный вирус данного изобретения.

Способы получения противовирусной вакцины также входят в объем изобретения. Например, изобретение включает в себя введение совокупности векторов (например, плазмидных векторов), содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа (например, вирусу гриппа A или B), в популяцию клеток-хозяев, которые способны поддерживать репликацию такого вируса, культивирование клеток, выделение совокупности вирусов гриппа и доставку субъекту (например, нуждающемуся в таком лечении) указанного вируса вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Такие вирусы могут необязательно представлять собой адаптированные к низким температурам и/или термочувствительные и/или аттенуированные вирусы и предпочтительно подходят для введения в составе интраназальной вакцинной композиции. В одном воплощении совокупность векторов содержит полинуклеотиды, соответствующие 6 внутренним геномным сегментам первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76) и один или два геномных сегмента, содержащих полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, где один или два геномных сегмента необязательно кодируют иммуногенный поверхностный антиген вируса гриппа второго штамма вируса гриппа. В одном воплощении способ данного изобретения включает в себя: введение совокупности векторов, содержащих полинуклеотиды, соответствующие геному вируса гриппа, в популяцию клеток-хозяев, где совокупность содержит, по меньшей мере, 6 внутренних геномных сегментов первого штамма вируса гриппа (например, A/AA/6/60, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76), и, по меньшей мере, один геномный сегмент, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и где популяция клеток-хозяев способна поддерживать репликацию вируса гриппа; культивирование популяция клеток-хозяев; и выделение совокупности вирусов гриппа.

Способы индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающие в себя введение субъекту эффективного количества любого из описанных выше вирусов, также входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, данное изобретение охватывает способы профилактики или лечения вирусной инфекции (например, вируса гриппа) у субъекта, включающие в себя введение одного или нескольких описанных выше вирусов в количестве, эффективном для получения иммунного ответа против вирусной инфекции. Субъекты, подходящие для такого лечения, могут представлять собой млекопитающих (например, людей). Такие способы также могут включать в себя введение субъекту in vivo и введение in vitro или ex vivo в одну или несколько клеток субъекта. Кроме того, такие способы могут также включать в себя введение субъекту композиции, содержащей вирус и фармацевтически приемлемый эксципиент, в количестве, эффективном для профилактики или лечения вирусной инфекции.

Настоящее изобретение также предлагает представляющие интерес композиции, содержащие одну или несколько последовательностей, выбранных из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25, и выбранный базовый донорный вирус, причем выбранная последовательность и базовый донорный вирус, как правило, содержат рекомбинацию 6:2, т.е. гены HA и NA в данном изобретении рекомбинируют с другими шестью генами вируса гриппа из донорных вирусов. Такие донорные вирусы обычно представляют собой штаммы ca, att, ts. Например, в качестве донорных штаммов обычно используют, например, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 или B/England/2608/76 и их варианты. Для специалистов в данной области очевидно, что донорные штаммы, как правило, могут варьировать от реассортантных до реассортантных. Следовательно, такие вариации также входят в объем настоящего изобретения. Другое воплощение данного изобретения включает в себя такие композиции, содержащие одну или несколько живых аттенуированных противогриппозных вакцин, например, имеющих последовательности, рекомбинированные в соответствии с данным изобретением в соотношении 6:2 с выбранными базовыми донорными вирусами.

Другие аспекты данного изобретения включают в себя представляющие интерес композиции, содержащие полинуклеотид гемагглютинина и/или полинуклеотид нейраминидазы, рекомбинированный с одним или несколькими базовыми донорными вирусами, опять же, обычно представляющими собой ca, att, ts вирусы гриппа, где вирусный штамм, содержащий полинуклеотид, совпадает с одним или несколькими вирусными штаммами, содержащими последовательности, выбранные из группы, включающей в себя SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, остатки 74-1060 SEQ ID NO:1, остатки 1061-1723 SEQ ID NO:1, остатки 81-1058 SEQ ID NO:5, остатки 1059-1724 SEQ ID NO:5, остатки 85-1116 SEQ ID NO:9, остатки 79-1116 SEQ ID NO:9, остатки 1117-1785 SEQ ID NO:9, остатки 78-1064 SEQ ID NO:13, остатки 1065-1727 SEQ ID NO:13, остатки 78-1055 SEQ ID NO:17, остатки 1056-1721 SEQ ID NO:17, остатки 78-1118 SEQ ID NO:21, остатки 1119-1787 SEQ ID NO:21, остатки 75-1115 SEQ ID NO:25 и остатки 1116-1787 SEQ ID NO:25. Такой полинуклеотид гемагглютинина и/или нейраминидазы обычно определяют как относящийся к "такому же штамму", если его титр находится в пределах четырехкратного интервала по сравнению с полинуклеотидом другого вируса (например, имеющим одну из перечисленных здесь последовательностей) по данным анализа ингибирования гемагглютинина. Однако, как описано ниже, для того, чтобы определить, относятся ли полинуклеотиды (т.е. содержащие их вирусы) к одному и тому же штамму, можно использовать и другие традиционные анализы.

Указанные и другие цели и признаки данного изобретения станут более понятны из нижеследующего подробного описания, приведенного в сочетании с прилагающимися чертежами и формулой изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 приведен