Способ размножения цимбидиума in vitro
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения цимбидиума in vitro включающий введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, где после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л, затем псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условия ex vitro в грунте с добавлением мха и древесной коры. Изобретение позволяет повысить выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб, при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.3 табл.
Реферат
Изобретение относится к области садоводства и может быть использовано для микроразмножения растений цимбидиума in vitro.
Известен способ размножения цимбидиума in vitro (См: Mohammad Musharof Hossain, Madhu Sharma, Promila Pathak Cost effective protocol for in vitro mass propagation of Cymbidium aloifolium (L.) Sw. a medicinally important orchid // Engineering in Life Sciences. 2009. - V. 9, №. 6. - P. 444-453). В качестве первичного экспланта использовали семена, которые стерилизовали последовательно в 0,1%-ном растворе сулемы (HgCL2) с 1-2 каплями 20% раствора детергента Teepol в течение 10 минут, затем в 70% этиловом спирте в течение 30 секунд, после чего высаживали на среду Mitra et al., дополненную сахарозой 30 г/л и регулятором роста 1 мг/л 6-бензиламинопурина, и культивировали в световой комнате при температуре 25±2°C и 14/10-часовом фотопериоде с освещением белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3000 лк до образования псевдобульб. Процесс ризогенеза индуцировали добавлением в питательную среду индолилуксусной кислоты в концентрации 0,5 мг/л. Растения-регенеранты высаживали в грунт для укоренения, состоящий из смеси керамзита, древесного угля, вермикулита и торфяного мха в соотношении 1:1:0.5:0.5, и выращивали при температуре 25-30°C и относительной влажности 60-70%.
Недостатком данного способа является невысокий коэффициент размножения.
Технический результат заключается в повышении выхода размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.
Технический результат достигается тем, что в способе размножения цимбидиума in vitro, включающем введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л. Псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условиях ex vitro в грунте, состоящем из мха и древесной коры.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве первичного экспланта используют семена, которые стерилизуют последовательно в 0,1%-ном растворе сулемы (HgCl2) с 1-2 каплями 20% раствора детергента Teepol в течение 10 минут, затем в 70% этиловом спирте в течение 30 секунд, после чего высаживают на среду Мурасиге и Скуга и культивируют в световой комнате при температуре 25°C с освещением белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3000 лк до образования псевдобульб. Отделяют псевдобульбы от эксплантов и высаживают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 30 г/л сахарозы и 0,001 мг/л эпибрассинолида. Состав среды, использованный при культивировании псевдобульб, является стандартным для микроразмножения растений в культуре in vitro, за исключением подобранных в предварительных опытах концентраций сахарозы (табл.1) и эпибрассинолида (табл.2). Культивирование осуществляют при постоянном освещении люминесцентными лампами с интенсивностью около 3000 лк и при температуре 25°C (физические условия выращивания близки к оптимальным для культивирования эксплантов растений). При выращивании эксплантов на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга используют 0,001 мг/л эпибрассинолида. В течение 4 недель культивирования образуется максимальное число псевдобульб - 17 штук/эксплант (табл.2).
В последующем псевдобульбы с корнепобегами отделяют от экспланта, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и переносят для укоренения в условия ex vitro в грунт, состоящий из смеси мха и древесной коры в соотношении 1:1. Данная обработка была выбрана как наиболее способствующая укоренению ex vitro пробирочных растений цимбидиума (табл.3). После укоренения размноженные растения выращивают обычным способом.
В результате использования данного способа клонального микроразмножения цимбидиума образовывалось 17 псевдобульб/эксплант независимо от сезонности взятия растения-донора. Процент укоренения в условиях ex vitro составил 80%, что приводит к высокой жизнеспособности растений-регенерантов.
Таким образом, данный способ размножения цимбидиума in vitro повышает выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.
Таблица 1 | |
сахарозы, г/л | Псевдобульбы, штук/эксплант |
10 | 9,8±0,4 |
20 | 12,1±0,3 |
30 | 14,6±0,2 |
40 | 13,8±0,3 |
50 | 13,1±0,3 |
60 | Концентрация 11,3±0,4 |
70 | 10,6±0,4 |
80 | 9,9±0,4 |
90 | 9,6±0,5 |
100 | 9,3±0,5 |
Таблица 2 | ||||||
Вариант средыПсевдобульбы | Концентрация эпибрассинолида, мг/л | |||||
0,0001 | 0,001 | 0,01 | 0,1 | 1 | 10 | |
Количество, штук/эксплант | 15,0±0,6 | 17,5±0,8 | 13,2±0,5 | 12,9±0,7 | 12,3±0,8 | 10,2±0,5 |
Таблица 3 | ||||
Режим обработкиРизогенез X | Индолилуксусная кислота, мг/л | |||
0,1 | 1 | |||
15 минут | 30 минут | 15 минут | 30 минут | |
Процент укоренения | 20,1±3,1 | 30,5±4,3 | 80,3±5,2 | 40,7±3,7 |
Способ размножения цимбидиума in vitro, включающий введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, отличающийся тем, что после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л, затем псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условиях ex vitro в грунте, состоящем из мха и древесной коры.