Предупреждение и лечение церебральной амилоидной ангиопатии

Предупреждение и лечение церебральной амилоидной ангиопатии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сверхэкспрессия мутантного человеческого белка-предшественника амилоида (АРР) в организме различных трансгенных мышей приводит к некоторым поражениям типа болезни Альцгеймера (AD) (см. обзор D. Games et al., J Alzheimers Dis 9, 133-49 (2006); J. Gotz et al., Mol Psychiatry 9, 664-83 (2004)). Эти поражения включают развитие в паренхиме бета-амилоидных (Ар) бляшек, нейритной патологии, утраты синапсов и глиоза. В ряде сообщений показано, что активные (см. D. Schenk et al., Nature 400, 173-7 (1999); D.L. Dickstein et al., Faseb J 20, 426-33 (2006)) и пассивные (см. F. Bard et al., Nat Med 6, 916-9 (2000); M. Buttini et al., J Neurosci 25, 9096- 101 (2005); D.M. Wilcock et al., J Neuroinflammation 1, 24 (2004)) Аβ иммунотерапевтические методы эффективно уменьшают или/и устраняют эти патологии в преклинических исследованиях (см. R.P. Brendza & D. M. Hoizman, Ahheimer Dis Assoc Disord 20, 118-23 (2006); C.A. Lemere et al., Rejuvenation Res 9, 77-84 (2006)). Кроме того, многими исследователями показано улучшение в различных когнитивных тестах (см. D.M. Wilcock et al., supra; С. Janus et al., Nature 408, 979-82 (2000); D. Morgan et al., Nature 408, 982-5 (2000)). Эти результаты подтверждаются результатами, показывающими возрастающую корреляцию как при тестировании памяти, так и при нейропатологическом исследовании мозга пациентов, которые были зарегистрированы в клинических испытаниях Аβ иммунотерапии (AN1792), см. J.A. Nicoll et al., Nat Med 9, 448-52 (2003); I. Ferrer et al., Brain Pathol 14, 11-20 (2004); S. Oilman et al., Neurology 64, 1553-62 (2005).

В последнее время другой общий аспект AD патологии, сосудистый Aβ (VAβ), стал объектом тщательного изучения в преклинических исследованиях АРР трансгенных животных. Сообщалось, в частности, что пассивная иммунизация ассоциируется с повышением VAβ и микрокровоизлиянием (см. D.M. Wilcock et al., supra; M.M. Racke et al., J Neurosci 25, 629-36 (2005)). Однако прогностическая клиническая роль остается неясной, в особенности в свете предпочтительных поведенческих результатов некоторых из тех же самых исследований (см. D.M. Wilcock et al., supra), отсутствия ультраструктурных различий в морфологии гемосидерин-позитивных сосудов у непролеченных и пролеченных трансгенных мышей (см. G.J. Burbach et al., Neurobiol Aging 28, 202-12 (2007)) и, в особенности, отсутствия данных о заметном кровоизлиянии или сопутствующих удару последствиях в продолжающихся клинических испытаниях. Кроме того, мало известно о том, насколько, до какой степени VAβ в конечном счете поражается при Аβ иммунотерапевтических методах; например, могут ли отличаться результаты (показатели), полученные на моделях лечения хронического случая, от результатов, полученных при изучении случаев острого заболевания. Например, неизвестно, представляют ли сообщаемые увеличения VAβ временное явление, ассоциированное с клиренсом Аβ, так как, по-видимому, относительная доля продуцирования Аβ40 по сравнению с Аβ42 влияет как на агрегационные свойства Аβ, так и на эффективность связывания некоторых антител, в частности антител с C-концевыми эпитопами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение включает способы терапевтического лечения САА (церебральной амилоидной ангиопатии, ЦАА). Способы включают введение агента пациенту, болеющему или предположительно болеющему САА. В некоторых способах агент представляет собой антитело, специфическое к N-концу Аβ и, вследствие этого, "врачует" пациента. Необязательно, агент представляет собой антитело, которое связывается в пределах остатков 1-5 белка Аβ. Необязательно, антитело является "гуманизированным", человеческим или химерным антителом. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой антитело 3D6. Необязательно, 3D6 гуманизированное антитело представляет собой бипинеузумаб. Необязательно, гуманизированное антитело является антителом 12А11.

В некоторых способах агент представляет собой фрагмент Аβ. Необязательно, фрагмент начинается с остатка 1 Аβ и кончается одним из остатков 5-10 Аβ. Необязательно, фрагмент представляет собой Аβ 1-7. Необязательно, Аβ фрагмент вводят с фармацевтически приемлемым адъювантом. Необязательно, Аβ фрагмент связан с носителем, который способствует индукции фрагментом антител к фрагменту. Необязательно, носитель связан с C-концом Аβ-фрагмента.

Некоторые способы по изобретению дополнительно включают установление наличия САА у пациента, причем стадия установления (определения) предшествует стадии (мерам) введения. В некоторых способах на стадии установления определяют, что у пациента наблюдаются клинические симптомы САА.

В некоторых способах терапевтического лечения САА в мозге пациента отсутствуют бляшки, характерные для болезни Альцгеймера. Необязательно, в мозге пациента отсутствуют бляшки, характерные для болезни Альцгеймера, а у пациента отсутствуют симптомы болезни Альцгеймера. В некоторых способах терапевтического лечения САА у пациента наблюдается инфаркт или удар.

Необязательно, способы включают введение дозы антитела, которая составляет, примерно, 0.01-5 мг/кг. Необязательно, способы включают введение дозы антитела, которая составляет, примерно, 0.1-5 мг/кг. Необязательно, способы включают введение дозы около 0.5 мг/кг. Необязательно, способы включают введение дозы около 1.5 мг/кг. Необязательно, способы включают введение дозы антитела, которая составляет, примерно, 0.5-3 мг/кг. Необязательно, способы включают введение дозы антитела, которая составляет, примерно, 0.5-1.5 мг/кг. Необязательно, способы включают многократное введение антитела. Необязательно, антитело вводят по схемам от еженедельной до ежеквартальной (раз в три месяца). Необязательно, антитело вводят каждые 13 недель. Необязательно, антитело вводят внутривенно или подкожно.

Необязательно, антитело вводят по схеме, достаточной для того, чтобы поддерживать среднюю сывороточную концентрацию антитела у пациента в интервале 1-15 мкг антитела/мл сыворотки и тем самым лечить пациента. Необязательно, средняя сывороточная концентрация находится в диапазоне 1-10 мкг антитела/мл сыворотки. Необязательно, средняя сывороточная концентрация находится в диапазоне 1-5 мкг антитела/мл сыворотки. Необязательно, средняя сывороточная концентрация находится в диапазоне 2-4 мкг антитела/мл сыворотки. Необязательно, антитело вводят по схеме, достаточной для поддержания средней сывороточной концентрации антитела по меньшей мере в течение одного года. Необязательно, средняя сывороточная концентрация антитела поддерживается по меньшей мере в течение шести месяцев.

Некоторые способы, в которых агентом является антитело, необязательно, дополнительно включают определение концентрации антитела в сыворотке и корректировку схемы, если определяемая концентрация выпадает из диапазона.

Необязательно, антитело вводят внутривенно по схеме, достаточной для того, чтобы поддерживать среднюю сывороточную концентрацию антитела у пациента в интервале 1-15 мкг антитела/мл сыворотки и тем самым лечить пациента. Необязательно, дозу 0.5-1.0 мг/кг вводят внутривенно ежемесячно. Необязательно, дозу 0.1-1.0 мг/кг вводят внутривенно ежемесячно.

Необязательно, антитело вводят подкожно. Необязательно, антитело вводят подкожно с частотой от еженедельного введения до ежемесячного. Необязательно, антитело вводят подкожно еженедельно или раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.01-0.35 мг/кг. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.25 мг/кг. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.015-0.2 мг/кг еженедельно или раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.15 мг/кг еженедельно или раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.07 мг/кг еженедельно. Необязательно, антитело вводят подкожно в дозе 0.06 мг/кг еженедельно. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.1-0.15 мг/кг раз в две недели.

Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.01-0.6 мг/кг с частотой от еженедельной до ежемесячной. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.25 мг/кг. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.015-0.2 мг/кг еженедельно или раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.15 мг/кг еженедельно или раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.05-0.07 мг/кг еженедельно. Необязательно, антитело вводят подкожно в дозе 0.06 мг/кг еженедельно. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.1-0.15 мг/кг раз в две недели. Необязательно, антитело вводят подкожно в примерной дозе 0.1-0.3 мг/кг ежемесячно. Необязательно, антитело вводят подкожно в дозе 0.2 мг/кг ежемесячно.

Некоторые способы по изобретению дополнительно включают мониторинг изменений признаков или симптомов САА, реагирующих на лечебные меры. Некоторые способы по изобретению дополнительно включают введение второго агента, применимого для эффективного лечения САА.

Изобретение включает способы эффективной профилактики САА. Способы включают введение пациенту, восприимчивому к САА, агента по эффективной схеме. Агент представляет собой антитело, специфическое к N-концу Аβ, или агент, который индуцирует такое антитело после введения пациенту и тем самым позволяет провести профилактику пациента. Изобретение включает применение агента, причем агент представляет собой антитело, специфическое к N-концу Аβ, или агент, который индуцирует такое антитело после введения пациенту, при лечении или профилактике болезни Альцгеймера.

Изобретение включает способы снижения уровня сосудистого амилоида у пациента. Способы включают введение антитела, специфического к N-концу Аβ, по схеме лечения, которая позволяет эффективно удалять сосудистый амилоид и снижать частоту мозговых микрокровоизлияний. Некоторые способы включают дополнительно мониторинг пациента для определения мозгового микрокровоизлияния методом МРТ (ЯМР-томографии, магнито-резонансной томографии, MRI). Некоторые способы дополнительно включают мониторинг пациента методом ПЭТ-сканирования (позитронно-эмиссионной томографии, PET) для определения удаления сосудистого амилоида. Необязательно, в некоторых способах схема лечения является постоянной схемой лечения (хронической). Необязательно, в некоторых способах схема лечения включает дозу антитела 0.01-5 мг/кг массы тела пациента и введение от еженедельного до ежеквартального. Необязательно, в некоторых способах доза антитела составляет 0.1-5 мг/кг. Необязательно, в некоторых способах доза составляет около 0.5 мг/кг. Необязательно, в некоторых способах доза составляет около 1.5 мг/кг. Необязательно, в некоторых способах доза составляет около 0.5-3 мг/кг. Необязательно, в некоторых способах доза составляет 0.5-1.5 мг/кг. Необязательно, в некоторых способах дозу вводят каждые 13 недель. Необязательно, в некоторых способах антитело вводят внутривенно или подкожно. Необязательно, агент представляет собой антитело, которое связывается только с остатками 1-5 Аβ. Необязательно, антитело является гуманизированным, человеческим или химерным антителом. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 3D6. Необязательно, 3D6 гуманизированное антитело представляет собой бапинеузумаб. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 12А11.

Изобретение включает способы лечения болезни Альцгеймера. Способы включают введение антитела, специфического к N-концу Аβ, в дозе, которая снижает или ингибирует развитие сосудистой амилоидогенной патологии, сводит к минимуму микрокровоизлияние (микрогемморагию) и снижает или ингибирует развитие Аβ бляшек. Необязательно, в некоторых способах антитело связывается в пределах остатков 1-5 Аβ. Необязательно, антитело является гуманизированным, человеческим или химерным антителом. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 3D6. Необязательно, 3D6 гуманизированное антитело представляет собой бапинеузумаб. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 12А11.

Изобретение включает способы лечения болезни Альцгеймера, которые включают введение антитела, специфического к N-концу Аβ, в дозе, которая снижает или ингибирует развитие сосудистой амилоидогенной патологии, сводит к минимуму микрокровоизлияние (микрогемморагию) и снижает и/или ингибирует развитие нейритной патологии. Необязательно, в некоторых способах антитело связывается в пределах остатков 1-5 Аβ. Необязательно, антитело является гуманизированным, человеческим или химерным антителом. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 3D6. Необязательно, 3D6 гуманизированное антитело представляет собой бапинеузумаб. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 12А11.

Изобретение включает способы лечения болезни Альцгеймера, которые включают введение антитела, специфического к N-концу Аβ, в дозе, которая снижает или ингибирует развитие сосудистой амилоидогенной патологии, сводит к минимуму микрокровоизлияние (микрогемморагию) и/или улучшает когнитивную функцию у пациента. Необязательно, в некоторых способах антитело связывается с остатками в пределах остатков 1-5 Аβ. Необязательно, антитело является гуманизированным, человеческим или химерным антителом. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 3D6. Необязательно, 3D6 гуманизированное антитело представляет собой бапинеузумаб. Необязательно, гуманизированное антитело представляет собой 12А11.

Необязательно, в некоторых способах лечения болезни Альцгеймера снижение или ингибирование сосудистой амилоидогенной патологии представляет собой предупреждение аккумуляции Аβ в сосудах или клиренс сосудистого Аβ.

Кроме того, изобретение включает диагностические наборы, пригодные для применения в вышеуказанных способах. Такой набор содержит антитело, которое специфически связывается с эпитопом с остатками 1-10 Аβ. Некоторые наборы включают этикетку с описанием применения антитела для in vivo диагностики или мониторинга болезни Альцгеймера.

Помимо этого, изобретение включает наборы для лечения САА, пригодные для применения в вышеуказанных способах. Такой набор включает виалу, содержащую препарат. Некоторые наборы по изобретению включают стеклянную виалу, содержащую препарат, включающий 0.5-3 мг/кг гуманизированного антитела против Аβ.

Некоторые наборы по изобретению включают стеклянную виалу, содержащую препарат, включающий: i) около 10 мг - 250 мг гуманизированного антитела против Аβ, ii) около 4% маннита или около 150 мМ NaCl, iii) около 5 мМ - 10 мМ гистидина и iv) около 10 мМ метионина. Некоторые наборы включают инструкции по мониторингу пациента, которому вводят препарат, на САА. Необязательно, инструкции включают: i) мониторинг у пациента микрокровоизлияний в мозг методом МРТ или ii) мониторинг пациента методом ПЭТ-сканирования для определения удаления сосудистого амилоида.

Помимо этого, изобретение включает наборы для лечения болезни Альцгеймера, пригодные для применения в вышеуказанных способах. Такие наборы включают стеклянную виалу, содержащую препарат, включающий: i) около 10 мг - 250 мг гуманизированного антитела против Ар, ii) около 4% маннита или около 150 мМ NaCl, iii) около 5 мМ - 10 мМ гистидина и iv) около 10 мМ метионина. Некоторые наборы включают инструкции по мониторингу пациента, которому вводят препарат, на болезнь Альцгеймера. Необязательно, инструкции включают: i) мониторинг у пациента микрокровоизлияний в мозг методом МРТ или ii) мониторинг пациента методом ПЭТ-сканирования для определения удаления сосудистого амилоида.

Далее изобретение включает наборы для лечения САА и болезни Альцгеймера, пригодные для применения в вышеуказанных способах. Такие наборы включают стеклянную виалу, содержащую препарат, включающий: i) около 10 мг - 250 мг гуманизированного антитела против AR, ii) около 4% маннита или около 150 мМ NaCl, iii) около 5 мМ - 10 мМ гистидина и iv) около 10 мМ метионина. Некоторые наборы включают инструкции по мониторингу пациента, которому вводят препарат, на САА и болезнь Альцгеймера. Необязательно, инструкции включают: i) мониторинг у пациента микрокровоизлияний в мозг методом МРТ или ii) мониторинг пациента методом ПЭТ-сканирования для определения удаления сосудистого амилоида.

Необязательно, антитело вводят в дозе около 0.05-0.5 мг/кг. Необязательно, антитело вводят в дозе около 1-40 мг с частотой от еженедельной до ежемесячной. Необязательно, антитело вводят в дозе около 5-25 мг с частотой от еженедельной до ежемесячной. Необязательно, антитело вводят в дозе около 2.5-15 мг с частотой от еженедельной до ежемесячной.

Необязательно, антитело вводят в дозе около 2.5-15 мг с частотой от еженедельной до раз в две недели. Необязательно, антитело вводят в дозе около 2.5-10 мг с частотой от еженедельной до раз в две недели. Необязательно, антитело вводят в дозе около 2.5-5 мг еженедельно. Необязательно, антитело вводят в дозе около 4-5 мг еженедельно. Необязательно, антитело вводят в дозе около 7-10 мг раз в две недели.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1а показано окрашивание тиофлавином S, а на Фигуре 1b показано иммунномечение антителом 3D6 Аβ в сосудах срединных (медиальных) структур головного мозга 18-месячных мышей PDAPP. На Фигуре 1с показана человеческая AD ткань, а на Фигуре 1d показаны лептоменингеальные и поверхностные паренхимные сосуды мыши PDAPP с VAβ, иммуномеченными с помощью 3D6. Масштаб = 100 мкм.

На Фигуре 2а показан мозг непролеченной 12-месячной мыши, на Фигуре 2b показан мозг мыши, получавшей контроль, на Фигуре 2c показан мозг мыши, получавшей 3D6 в дозе 3 мг/кг, и на Фигуре 2d показан мозг мыши, получавшей 3 мг/кг 266 с 3D6 иммунномеченными Vaβ в срединных сосудах. Масштаб = 50 мкм. На диаграмме показано количество животных (в процентах) в каждой группе не содержащих/содержащих мало VAβ (незаштрихованные столбцы) и содержащих умеренное число VAβ (заштрихованные столбцы).

На Фигуре 3а показан мозг мыши, получавшей контроль, на Фигуре 3b показан мозг мыши, пролеченной 3D6 в дозе 0.1 мг/кг, на Фигуре 3с показан мозг мыши, пролеченной 3D6 в дозе 0.3 мг/кг, и на Фигуре 3d показан мозг мыши, получавшей 3 мг/кг 3D6 с 3D6 иммунномеченными Vaβ в лептоменингеальных сосудах. Скобки и стрелки, VAβ, Масштаб = 100 мкм. На диаграмме показано количество животных (в процентах) в каждой группе не содержащих/содержащих мало VAβ (незаштрихованные столбцы) и содержащих умеренное число VAβ (заштрихованные столбцы).

На Фигуре 4а показано 3D6 иммуномечение скругленных масс и полос интактного Vaβ, охватывающих непораженный лептоменингеальный сосуд мыши, пролеченной 3D6 в дозе 0.1 мг/кг. На Фигуре 4b показано 3D6 иммуномечение очагового, подвергшегося эрозии VAβ в процессе частичного клиренса у мыши, пролеченной 3D6 в дозе 0.1 мг/кг. Масштаб = 50 мкм.

На Фигурах 5а и 5b показан частичный клиренс или предупреждение Vaβ при пониженных дозах 3D6 без всяких признаков микрокровоизлияния у большинства животных. На Фигуре 5c показан полный клиренс или предупреждение Vaβ при дозе 3D6 3 мг/кг без всяких признаков микрокровоизлияния у большинства животных. На Фигурах 5d и 5е показано микрокровоизлияние в местах частичного клиренса при пониженных дозах 3D6. На Фигуре 5f показано микрокровоизлияние в местах полного клиренса при дозах 3D6 3 мг/кг. Стрелки, макрофаги. Масштаб = 100 мкм.

На Фигуре 6а показаны основные показатели гемосидерина в контрольной и пролеченных группах в Исследовании А. На Фигуре 6b показаны основные показатели гемосидерина в контрольной и пролеченных группах в Исследовании В.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "значительная (практическая) идентичность" означает, что две пептидных последовательности, будучи оптимально выравнены, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с применением средневзвешенного гэпа по умолчанию, имеют последовательности, идентичные по меньшей мере на 65%, предпочтительно, последовательности, идентичные по меньшей мере на 80 или на 90%, более предпочтительно, последовательности, идентичные по меньшей мере на 95% (например, последовательности, идентичные на 99% или более). Предпочтительно, остатки, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

При сравнении последовательностей обычно одна последовательность является эталонной последовательностью, с которой сравнивают тестируемую последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемая и эталонная последовательности вводят в компьютер, при необходимости соответствующие координаты назначают и назначают параметры программы последовательности по алгоритму. Затем по алгоритму сравнения последовательностей рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемой последовательности (тестируемых последовательностей) относительно эталонной последовательности с учетом назначенных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локального выравнивания по гомологии Смита-Ватермана (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), с помощью алгоритма выравнивания по гомологии Нидельмана-Вунша (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), по методу поиска подобия Пирсона-Липмана (Pearson & Lipman, Proc, Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), с помощью компьютерного применения этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или с помощью визуального изучения (см. в целом Ausubel et al., supra). Примером алгоритма, пригодного для определения идентичности последовательностей в процентах и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, который описан Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Программа для BLAST анализов находится на веб-сайте National Center for Biotechnology Information (NCBI). Обычно для сравнения последовательностей можно использовать параметры программы по умолчанию, хотя можно использовать также специальные параметры. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (разрядность, W) 3, математическое ожидание (Е) 10, и матрицу замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).

С целью классификации аминокислотных замен, консервативных или неконсервативных, аминокислоты распределяют по группам следующим образом: Группа I (гидрофобные боковые цепи): norleucine (норлейцин), met, ala, val, leu, ile; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; Группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; Группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro; и Группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами одного класса. Неконсервативные замены представляют собой замену члена одного из этих классов на члена другого класса.

Терапевтические агенты по изобретению обычно являются практически чистыми, не содержащими нежелательных примесей. Это означает, что агент обычно по меньшей мере, примерно, на 50% вес. (вес./вес.) чистый, а также практически не содержит мешающих белков и примесей. Иногда чистота агентов составляет по меньшей мере около 80% вес. и, более предпочтительно, по меньшей мере около 90 или около 95% вес. Однако при использовании обычных методов очистки белков можно получить гомогенные пептиды с чистотой по меньшей мере около 99%.

Выражение молекула "специфически связывается" с мишенью или "специфически иммунореактивна" по отношению к мишени относится к реакции связывания, которая является определяющей для существования молекулы в непосредственной близости от гетерогенной популяции других биологических форм. Таким образом, в предполагаемых условиях иммуноанализа указанная молекула связывается с конкретной мишенью и не связывается в значительной мере с другими биологическими формами в образце. Специфическое связывание антитела с мишенью в таких условиях требует, чтобы антитело было отобрано по его специфичности относительно мишени. Можно применять различные форматы иммуноанализа для отбора антител, специфически иммунореактивных в отношении конкретного белка. Например, обычно для отбора моноклональных антител, специфически иммунореактивных в отношении белка, используют твердофазные иммуноанализы ELISA. См., например, в Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, описание форматов и условий иммуноанализа, которые можно применять для определения специфической иммунореактивности. Специфическое связывание двух частиц означает аффинность по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ М^-1 или 10¹⁰ М^-1. Предпочтительна аффинность более 10⁸ М^-1.

Термин "антитело" или "иммуноглобулин" применяется для обозначения интактных антител и их связывающих фрагментов. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они произошли, за специфическое связывание с фрагментом антигена, включая Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и Fv. Фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативными или химическими методами деления интактных иммуноглобулинов. Термин "антитело" включает также одну или более цепей иммуноглобулина, которые химически конъюгированы в или экспрессируются как белки, слитые с другими белками. Термин "антитело" также включает биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелая/легкая цепь и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ и АРР⁷⁷⁰ относятся, соответственно, к полипептидам длиной 695, 751 и 770 аминокислотных остатков, кодированным человеческим АРР геном. См. Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); и Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Аминокислотам в человеческом амилоидном белке-предшественнике (АРР) присвоены номера, соответствующие номерам в последовательности изоформы АРР770.

Такие термины, как Аβ39, Аβ40, Аβ41, Аβ42 и Аβ43, относятся к Аβ пептиду, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43. Последовательности этих пептидов и их связь с АРР предшественником проиллюстрированы на Фиг.1 в статье Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Например, Аβ42 имеет последовательность:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT

Аβ41, Аβ40 и Аβ39 отличаются от Аβ42 тем, что в них удалены Ala, Ala-Ile и Ala-Ile-Val, соответственно, на С-конце. Аβ43 отличается от Аβ42 наличием остатка Thr на С-конце.

"Антиген" обозначает частицу (объект, элемент, самостоятельную структуру), с которой специфически связывается антитело.

Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, на который реагируют В и/или Т клетки. В-клеточные эпитопы могут образовываться как из соседних аминокислот, так и не из соседних аминокислот, сближающихся (располагающихся рядом) за счет образования третичной структуры (фолдинга, укладки) белка. Эпитопы, образованные из соседних аминокислот, обычно сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, образующиеся за счет фолдинга, образования третичной структуры, обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и более, обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурный анализ (РСА) и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Антитела, которые узнают один и тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью. Т-клетки узнают непрерывные эпитопы, примерно, из девяти аминокислот, для CD8 клеток или, примерно, из 13-15 аминокислот для CD4 клеток. Т-клетки, которые узнают эпитоп, можно идентифицировать анализами in vitro, в которых измеряется антиген-зависимая пролиферация, определяемая с помощью включения ³H-тимидина примированными Т-клетками как реакции на эпитоп (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994)), антиген- зависимого киллинга (анализ цитотоксической Т лимфоцитарной активности, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) или секреции цитокинов.

Термин "иммунологический" или "иммунный" ответ обозначает развитие гуморального (опосредованного антителом) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против амилоидного пептида в организме больного реципиента. Такой ответ может представлять собой активный ответ, индуцированный введением иммуногена, или пассивный ответ, индуцированный введением антитела или примированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ выявляется презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с Класса I и Класса II МНС молекулами для активации антиген-специфических CD4⁺ Т хелперных клеток и/или CD8⁺ цитотоксических Т клеток. Ответ (реакция) может также включать активацию моноцитов, макрофагов, NK клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, клеток макроглии, эозинофилов или других компонентов врожденного иммунитета. Наличие опосредованного иммунологического ответа можно определить анализами пролиферации (CD4⁺ Т клеток) или анализами CTL (цитотоксических Т лимфоцитов) (см. Burke, supra; Tigges, supra). Относительный вклад гуморального и клеточного ответов в протективное или терапевтическое действие иммуногена можно различить, раздельно выделяя антитела и Т-клетки из иммунизированного сингенного животного и определяя защитное (протективное) или терапевтическое действие на второго субъекта.

"Иммуногенный агент" или "иммуноген" способен индуцировать иммунологический ответ на самого себя при введении млекопитающему, необязательно, в сочетании с адъювантом.

Термин "полностью-D" относится к пептидам, имеющим аминокислоты с >75%, >80%, >85%, >90%, >95% или 100% D-конфигурацию.

Термин "незащищенный (голый) полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, не комплексующемуся с коллоидными материалами. "Голые" полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор.

Термин "адъювант" относится к соединению, которое, при введении в конъюгации с антигеном, усиливает иммунный ответ на антиген, но будучи введено самостоятельно, не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъювант может усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В и/или Т клеток и стимуляцию макрофагов.

Термин "эффективная доза" или "эффективная дозировка" определяют как количество, достаточное для достижения заданного эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяется как количество, достаточное для излечивания или по меньшей мере частичного подавления заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего заболеванием. Количество, эффективное для такого применения, зависит от тяжести инфекции и общего состояния собственной иммунной системы пациента.

Некоторые вариации раскрываемых диапазонов (вариантов) в примерах допустимы вследствие ошибок опыта (при измерении). Такие вариации обозначаются термином "около" ("примерно") по отношению к интервалам (диапазонам) или дозам.

Термин "пациент" включает человека и других млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

Конкуренцию между антителами определяют анализом, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с обычным антигеном, таким как Аβ. Известны различные типы анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или "непрямой" радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный прямой или "непрямой" ферментный иммуноанализ (EIA), конкурентный сэндвич-анализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253 (1983)); твердофазный прямой EIA с комплексом биотин - авидин (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986)); твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвич-анализ с меткой (см. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); твердофазный прямой анализ RIA с меткой, с применением метки I-125 (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15 (1988)); твердофазный прямой EIA с комплексом биотин - авидин (Cheung et al., Virology 176: 546-552 (1990)) и прямой RIA с меткой (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82 (1990)). Обычно такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с твердой фазой или клетками, несущими либо немеченый тестируемый иммуноглобулин, либо меченый эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют, определяя количество метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные конкурентным анализом (конкурентные антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, и антитела, связывающиеся с прилегающим эпитопом, достаточно проксимальным к эпитопу, связанному эталонным антителом, так что возникли пространственные затруднения. Обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с обычным антителом по меньшей мере на 50 или 75%.

Термин "симптом" или "клинический симптом" относится к субъективному свидетельству заболевания, такому как измененная походка, подмечаемая пациентом. "Признак" относится к объективному свидетельству заболевания, наблюдаемому врачом.

Композиции или способы, "включающие" один или более перечисленных элементов, могут включать другие элементы, не указанные конкретно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Общие сведения

Изобретение включает способы осуществления профилактики и лечения церебральной амилоидной ангиопатии (САА), заболевания, характеризующегося присутствием отложений Аβ пептида в сосудах. Эти сосудистые отложения отличаются от паренхимных отложений, которые являются отличительным признаком болезни Альцгеймера. У большинства больных болезнью Альцгеймера наблюдается по меньшей мере легкая степень САА. Однако САА может также возникать независимо от симптомов и/или характерной патологии болезни Альцгеймера. САА также ассоциируется с симптомами, обычно не ассоциирующимися с болезнью Альцгеймера, такими как инсульт (удар, нарушение мозгового кровообращения). Изобретение включает способы осуществления профилактики или лечения САА вне зависимости от того, встречается ли она одна или одновременно с болезнью Альцгеймера. У пациентов, больных одновременно болезнью Альцгеймера и САА, эти способы могут лечить обе болезни одновременно. У пациентов, у которых отсутствуют оба заболевания, эти способы позволят осуществить профилактику обоих заболеваний. У пациентов, у которых наблюдается САА, но отсутствует болезнь Альцгеймера, способы позволяют лечить САА и осуществить профилактику болезни Альцгеймера. Эти способы включают активную или пассивную иммунотерапию. При пассивной иммунотерапии вводят антитело, связывающееся с эпитопом в пределах остатков 1-10 Аβ. При активной иммунотерапии вводят агент, такой как Аβ фрагмент, который может индуцировать такое антитело. Хотя понимание механизма не является существенным для практического применения изобретения, полагают, что антитела связываются с сосудистыми отложениями Аβ и тем самым стимулируют клиринг отложений.

II. Агенты

В способах по настоящему изобретению применяется агент, который либо представляет собой антитело к N-концу Аβ (пассивное введение), либо способен индуцировать такое антитело при введении пациенту. Такие агенты были ранее описаны в научной и в патентной литературе в связи с иммунотерапией болезни Альцгеймера (см. Международные патентные заявки WO 98/25386 и WO 00/72880).

А. Активная иммунотерапия

Аβ, также известный как β-амилоидный пептид или А4 пептид (см. патент США 4666829; Glenner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984)), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Аβ образуется при процессировании белка большего размера под действием двух ферментов, называемых β- и γ-секретазами (см. Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Известные мутации в АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, происходят по соседству с сайтом расщепления АРР β- или γ-секретазой при его процессировании в Аβ или в пределах Аβ. Например, положение 717 находится рядом с сайтом расщепления АРР γ-секретазой при процессировании АРР в Аβ, а положения 670/671 являются соседними к сайту расщепления β-секретазой. Полагают, что мутации вызывают AD, воздействуя на реакции расщепления, в результате которых образуется Аβ, таким образом, что повышается количе