Моноклональные антитела против белка rgm а и их применение

Моноклональные антитела против белка rgm а и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

В настоящей заявке описаны RGM A-связывающие белки, в частности, моноклональные антитела, и, в частности, их CDR-привитые, гуманизированные варианты, которые способны связываться с RGM A и предотвращать связывание белков RGM с рецептором RGM A и другими RGM A-связывающими белками, и, следовательно, нейтрализовать функцию RGM A. Эти антитела могут использоваться для лечения некоторых состояний, включая, но ими не ограничиваясь, рассеянный склероз, травму головного мозга млекопитающих, повреждение спинного мозга, инсульт, нейродегенеративные заболевания и шизофрению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Регенерация аксонов после повреждения или после воспалительных поражений или после нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы млекопитающих (ЦНС) практически всегда является невозможной; результат зависит от баланса между врожденной способностью нервных волокон ЦНС к возобновлению роста и ингибирующими факторами ЦНС, расположенными в сайте поражения или повреждения, которые активно препятствуют возобновлению роста, и, следовательно, регенерации поврежденных путей нервных волокон.

Было установлено, что миелин ЦНС, вырабатываемый олигодендроцитами, и рубцовая ткань повреждения являются наиболее значимыми тормозящими структурами для роста аксонов на ранней фазе повреждения, вследствие коллапса конуса роста и ингибирования роста нейритов in vitro, а также in vivo, что приводит к непосредственному ингибированию роста аксонов. Были идентифицированы белки RGM, главные ингибирующие факторы миелина ЦНС и рубцовой ткани (Monnier et al., Nature 419: 392-395, 2002; Schwab et al., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; в отношении обзоров см.: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Белки RGM стимулированы в участках поражения или повреждения у людей, умерших от травмы головного мозга или ишемического инсульта (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) и стимулированы у крыс с повреждением спинного мозга (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21: 1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006, в отношении обзора см.: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Кроме того, первые результаты с использованием клинических образцов пациентов с рассеянным склерозом и здоровых лиц сделали возможность предположить, что RGM A человека стимулирован в цереброспинальной жидкости пациентов, страдающих MS (данные не показаны).

Для оценки стимулирующего регенерацию эффекта RGM A-специфического поликлонального антитела, эти антитела вводили в умеренную тяжелую модель повреждения спинного мозга, где приблизительно 60% спинного мозга на торакальном уровне 9/10 были рассечены. Гистологическое исследование выявило, что такое повреждение приводило к разрыву всех дорсальных и латеральных волокон кортикоспинального пути. RGM A-специфическое поликлональное антитело, вводимое местно посредством насоса в течение двух недель, индуцировало отдаленную регенерацию поврежденных нервных волокон (Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006).

Сотни нервных волокон, расположенных за пределами участка повреждения, и самые длинные волокна регенерировали более чем на 10 мм за пределами этого повреждения, тогда как регенерирующие волокна не были обнаружены дистально относительно этого повреждения в обработанных контрольным антителом животных. Функциональное восстановление анти-RGM A-обработанных крыс значительно улучшалось в сравнении с обработанными контрольным антителом крысами со спинномозговым повреждением, подтверждая тем самым, что RGM A является мощным ингибитором нейрорегенерации и ценной мишенью для стимуляции восстановления в показаниях, характеризующихся повреждением аксонов или повреждением нервных волокон. (Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007). Кроме того, нейтрализация белка RGM A блокирующим функцию поликлональным антителом не только стимулировала рост поврежденных нервных волокон в крысах со спинномозговым повреждением, но и усиливала образование их синапса, тем самым делая возможным коррекцию или восстановление поврежденных нейронных цепей. (Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007).

Семейство rgm-генов включает три разных гена, два из которых, rgm a и b, экспрессируются в ЦНС млекопитающих, давая начало белкам RGM A и RGM B, тогда как третий член, rgm c, экспрессируется на периферии (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006), где RGM C играет важную роль в метаболизме железа. In vitro, RGM A ингибирует рост нейритов связыванием с Неогенином, который был идентифицирован как рецептор RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). Неогенин впервые был описан как нетринсвязывающий белок (Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996). Это открытие является важным, так как сообщалось, что связывание Нетрина-1 и Неогенина или его близкородственного рецептора DCC (делетирован в колоректальном раке) скорее стимулирует, а не ингибирует рост нейритов (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000). Таким образом, блокирование RGM A запускает RGM-опосредованное ингибирование роста, обеспечивая связывание неогенина с его стимулирующим рост нейритов лигандом Нетрином. На основании этих наблюдений, можно сделать предположение, что нейтрализация RGM A превосходит нейтрализацию неогенина на моделях повреждения спинного мозга человека. Кроме связывания RGM A с Неогенином и индукции ингибирования роста нейритов, связывание RGM A или B с морфогенетическими белками кости BMP-2 и BMP-4 может препятствовать успешной нейрорегенерации и функциональному восстановлению (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006).

В данной области существует необходимость в улучшенных антителах, способных связывать RGM A, предпочтительно, в моноклональном антителе, которое блокирует RGM A и препятствует взаимодействию RGM A и его рецептора, и/или связывающих белков, т.е. Неогенина и BMP-2, BMP-4.

Настоящая заявка относится (a) к получению нейтрализующего моноклонального антитела против RGM A, которое селективно ингибирует связывание RGM A и рецептора, Неогенина и морфогенетических белков кости 2 и 4 (BMP-2, BMP-4), и (b) к получению нейтрализующего моноклонального антитела против RGM A, которое селективно ингибирует связывание RGM A с морфогенетическими белками кости 2 и 4 (BMP-2, BMP-4). Полагают, что эти нейтрализующие моноклональные антитела по настоящему изобретению стимулируют рост пораженных или поврежденных нервных волокон и формирование функциональных синапсов регенерирующих нервных волокон, так как одно из нейтрализующих моноклональных антител по настоящему изобретению, по-видимому, преобразует ингибиторную природу RGM A в состояние, при котором нервные клетки предпочитают мигрировать и расти на RGM А-субстрате, а не на пермиссивном субстрате, таком как Коллаген I. Кроме того, антитело способно индуцировать отдаленную регенерацию на модели in vivo повреждения зрительного нерва крыс, а также усиливает миелинизацию поврежденных и регенерирующих нервных волокон.

Таким образом, было сделано предложение, что нейтрализующие моноклональные антитела по настоящему изобретению стимулируют регенерацию нейронов и рост поврежденных или разрушенных нейронных соединений в поврежденной или воспаленной ЦНС человека, например, при рассеянном склерозе, после острого повреждения спинного мозга, травмы головного мозга или при нейродегенеративных заболеваниях, таких как, например, хорея Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к связывающему белку, который диссоциирует из RGM A человека (hRGM A) с значением K_D, равным 1×10^-7 M или менее, и константой скорости диссоциации k_off, равной 1×10^-2 с^-1 или менее, причем обе константы определяют способом резонанса поверхностных плазмонов.

Согласно другому аспекту изобретение относится к связывающему белку, например, к связывающему белку, имеющему вышеуказанные кинетические свойства, который связывается с RGM A человека и нейтрализует активность, ингибирующую разрастание нейритов RGM A человека, как определено стандартным анализом in vitro, например, анализом нейронного роста Ntera, приведенным в качестве примера 3 ниже.

Настоящее изобретение также относится к связывающему белку, как определено выше, имеющему по меньшей мере одну из следующих дополнительных функциональных характеристик:

способности связывать RGM A крысы,

способности связывать RGM C человека и

способности связывать RGM C крысы.

В частности, описанный в настоящем документе связывающий белок модулирует способность RGM связываться по меньшей мере с одним из его рецепторов.

Такой связывающий белок, в частности, связывается с рецепторсвязывающим доменом RGM A человека. Были идентифицированы N- и C-концевые рецепторсвязывающие домены. Конкретные варианты связывающих белков по изобретению способны связываться с N-концевым рецепторсвязывающим доменом RGM A, как показано с помощью ингибирования связывания N-концевого фрагмента hRGM A, например, 47-168, и молекул рецептора, такими как Неогенин и BMP-4. Указанный N-концевой фрагмент hRGM A может иметь общую длину от приблизительно 30 до приблизительно 150 аминокислотных остатков или от приблизительно 30 до приблизительно 122 аминокислотных остатков. В качестве не ограничивающего примера, можно указать Фрагмент 0 (соответствующий N-концевым остаткам 47-168) hRGM A, как описано в настоящем документе, или любой более короткий рецепторсвязывающий фрагмент.

В частности, указанный связывающий белок модулирует, предпочтительно ингибирует, по меньшей мере одно из следующих взаимодействий:

связывание RGM A человека с BMP-4 человека,

связывание hRGM A с Неогенином человека,

связывание hRGM C с Неогенином человека,

связывание RGM A человека с BMP-2 человека.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления, связывающий белок, определенный в настоящем документе, является гуманизированным антителом.

Описанный выше связывающий белок может иметь антигенсвязывающий домен, причем указанный антигенсвязывающий домен способен связывать эпитоп молекулы RGM и указанный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере один CDR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

GTTPDY	(SEQ ID NO: 59),
FQATHDPLT	(SEQ ID NO: 62),
ARRNEYYGSSFFDY	(SEQ ID NO: 65),
LQGYIPPRT	(SEQ ID NO: 68), и

модифицированных аминокислотных последовательностей CDR, последовательность которых по меньшей мере на 50% идентична одной из указанных последовательностей. В другом варианте осуществления изобретение относится к связывающему белку, содержащему антигенсвязывающий домен, причем указанный связывающий домен способен связывать эпитоп молекулы RGM, причем указанный антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере один CDR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

GTTPDY	(SEQ ID NO: 59),
FQATHDPLT	(SEQ ID NO: 62),
ARRNEYYGSSFFDY	(SEQ ID NO: 65),
LQGYIPPRT	(SEQ ID NO: 68), и

модифицированных аминокислотных последовательностей CDR, последовательность которых по меньшей мере на 50% идентична, например, по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% идентична одной из указанных последовательностей.

Например, указанный связывающий белок может содержать два из указанных CDR, например, SEQ ID NO: 59 и 62; или SEQ ID NO: 65 и 68; где по меньшей мере один из указанных CDR может быть модифицированным и иметь последовательность, которая по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% идентична одной из указанных последовательностей.

Указанный связывающий белок может также содержать по меньшей мере один CDR, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 и модифицированных аминокислотных последовательностей CDR, которые по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% идентичны одной из указанных последовательностей.

Другой вариант осуществления относится к связывающему белку, в котором указанный по меньшей мере один CDR содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SEQ ID NO:57	Остатки 31-35 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:58	Остатки 50-66 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:59	Остатки 99-104 SEQ ID NO:34
SEQ ID NO:60	Остатки 24-39 SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:61	Остатки 55-61 SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:62	Остатки 94-102 SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:63	Остатки 31-35 SEQ ID NO:55
SEQ ID NO:64	Остатки 50-66 SEQ ID NO:55
SEQ ID NO:65	Остатки 97-110 SEQ ID NO:55

SEQ ID NO:66	Остатки 24-34 SEQ ID NO:56
SEQ ID NO:67	Остатки 50-56 SEQ ID NO:56
SEQ ID NO:68	Остатки 89-97 SEQ ID NO:56

В одном из конкретных вариантов осуществления, указанный связывающий белок содержит по меньшей мере 3 CDR, которые выбраны из набора CDR вариабельных доменов, состоящего из:

Набора VH 5F9
VH 5F9 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:57
VH 5F9 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:58
VH 5F9 CDR-H3	Остатки 99-104 SEQ ID NO:34	SEQ ID NO:59
Набора VL 5F9
VL 5F9 CDR-L1	Остатки 24-39 SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:60
VL 5F9 CDR-L2	Остатки 55-61 SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:61
VL 5F9 CDR-L3	Остатки 94-102 SEQ ID NO:10	SEQ ID NO:62
Набора VH 8D1
VH 8D1 CDR-H1	Остатки 31-35 SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:63
VH 8D1 CDR-H2	Остатки 50-66 SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:64
VH 8D1 CDR-H3	Остатки 97-110 SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:65
Набора VL 8D1
VL 8D1 CDR-L1	Остатки 24-34 SEQ ID NO:56	SEQ ID NO:66
VL 8D1 CDR-L2	Остатки 50-56 SEQ ID NO:56	SEQ ID NO:67
VL 8D1 CDR-L3	Остатки 89-97 SEQ ID NO:57	SEQ ID NO:68

или набора вариабельных доменов, в которых по меньшей мере один из указанных 3 CDR является модифицированной аминокислотной последовательностью CDR, которая по меньшей мере на 50%, например, по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% идентична исходной последовательности.

В частности, каждая из вышеуказанных модификаций может быть получена добавлением, делецией или, в частности, заменой одной аминокислоты или нескольких аминокислот, или их комбинациями.

В другом из вариантов осуществления, связывающий белок содержит по меньшей мере два набора CDR вариабельных доменов.

В частности, указанные по меньшей мере два набора CDR выбраны из группы, состоящей из:

VH 5F9-набора & VL 5F9-набора; и

VH 8D1-набора & VL 8D1-набора.

Связывающий белок по настоящему изобретению дополнительно содержит акцепторный каркасный участок человека.

Указанный акцепторный каркасный участок человека может содержать по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 и 33.

Связывающий белок по изобретению может, в частности, содержать по меньшей мере один из наборов каркасных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из наборов:

(1)	Набор VH3-48 (SEQ ID NO:15, 16 и 17)
	Набор VH3-33 (SEQ ID NO:21, 22 и 23)
	Набор VH3-23 (SEQ ID NO:24, 25 и 26)

каждый из которых комбинирован с дополнительной каркасной последовательностью, выбранной из

JH3 (SEQ ID NO:18),

JH4 (SEQ ID NO:19),

JH6 (SEQ ID NO:20);

или

(2)	выбранных из группы, состоящей из наборов
	A18-набор: (SEQ ID NO: 27, 28 и 29)
	A17-набор: (SEQ ID NO: 31, 32 и 33)

каждый из которых объединен с дополнительной каркасной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из JK2 (SEQ ID NO:2).

В соответствии с конкретными вариантами осуществления, связывающий белок любого варианта, описанного выше, содержит по меньшей мере один CDR-привитый вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 и 43; и/или по меньшей мере один CDR-привитый вариабельный домен легкой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 44, 45 и 46.

Более конкретно, связывающий белок по изобретению содержит комбинацию двух вариабельных доменов, где указанные два вариабельные домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из:

SEQ ID NO: 35 & 44; 36 & 44; 37 & 44; 38 & 44; 39 & 44; 40 & 44; 41 & 44; 42 & 44_; 43 & 44;

SEQ ID NO: 35 & 45; 36 & 45; 37 & 45; 38 & 45; 39 & 45; 40 & 45; 41 & 45; 42 & 45; 43 & 45;

SEQ ID NO: 35 & 46; 36 & 46; 37 & 46; 38 & 46; 39 & 46; 40 & 46; 41 & 46; 42 & 46; 43 & 46;

В другом варианте осуществления по изобретению, указанный акцепторный каркасный участок человека связывающего белка содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасного участка в ключевом остатке, причем указанный ключевой остаток выбран из группы, состоящей из:

остатка, смежного с CDR;

остатка сайта гликозилирования;

редкого остатка;

остатка, способного взаимодействовать с эпитопом RGM;

остатка, способного взаимодействовать с CDR;

канонического остатка;

контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи;

остатка в зоне Vernier;

N-концевого остатка, способного образовывать параглутамат, и

остатка в области перекрытия CDR1 вариабельной области тяжелой цепи по Хотиа и первым каркасным участком тяжелой цепи по Кабату.

В частности, указанные ключевые остатки выбраны из группы, состоящей из

(положения в последовательности тяжелой цепи) 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98

(положения в последовательности легкой цепи): 2, 4, 41, 51.

В одном из конкретных вариантов осуществления связывающий белок по изобретению является консенсусным вариабельным доменом человека или содержит консенсусный вариабельный домен человека.

В соответствии с другим вариантом осуществления связывающий белок по изобретению, указанный акцепторный каркасный участок человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области, где аминокислотная последовательность каркасного участка по меньшей мере на 65%, например, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%, идентична последовательности указанного акцепторного каркасного участка человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, например, по меньшей мере 75, 80 или 85 остатков, идентичных указанному акцепторному каркасному участку человека.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления, связывающий белок по изобретению содержит по меньшей мере один вариабельный домен с мутированным каркасным участком, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50; (VH-домен),

и/или выбранную из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 51, 52, 53 и 54 (VL-домен).

В частности, указанный связывающий белок содержит два необязательно мутированных в каркасном участке вариабельных доменов, где указанные два вариабельные домена имеют аминокислотные последовательности, выбранные из групп, состоящих из:

SEQ ID NO: 47 & 44; 47 & 45; 47 & 46; 47 & 51; 47 & 52; 47 & 53; 47 & 54;

SEQ ID NO: 48 & 44; 48 & 45; 48 & 46; 48 & 51; 48 & 52; 48 & 53; 48 & 54;

SEQ ID NO: 49 & 44; 49 & 45; 49 & 46; 49 & 51; 49 & 52; 49 & 53; 49 & 54;

SEQ ID NO: 50 & 44; 50 & 45; 50 & 46; 50 & 51; 50 & 52; 50 & 53; 50 & 54;

Связывающие белки по изобретению, описанные в настоящем описании, способны связывать по меньшей мере одну мишень, выбранную из молекул RGM.

В частности, белки способны связывать RGM A человека и, необязательно, одну дополнительную молекулу RGM человека или собакоподобных обезьян, крысы, курицы, лягушки и рыбы.

Например, белки могут дополнительно связываться с RGM A крысы, RGM C человека и/или RGM C крысы.

В частности, связывающий белок по изобретению способен модулировать, в частности, способен нейтрализовать или ингибировать биологическую функцию мишени, выбранной из молекул RGM, определенных выше.

В частности, связывающий белок по изобретению модулирует, в частности, ингибирует способность RGM связываться по меньшей мере с одним из его рецепторов, например, Неогенином и ВМР, таким как BMP-2 и BMP-4.

Например, указанный связывающий белок модулирует, в частности, уменьшает и, предпочтительно, ингибирует по меньшей мере одно из следующих взаимодействий:

связывание RGM A человека с BMP-4 человека,

связывание hRGM A с Неогенином человека,

связывание hRGM C с Неогенином человека,

связывание RGM A человека с BMP-2 человека.

Связывающие белки с различными комбинациями функциональных признаков и, следовательно, демонстрирующие разные функциональные характеристики, как описано в настоящем описании, входят в рамки настоящего изобретения. Неограничивающие примеры таких характеристик приведены в списке ниже.

	Характеристики
Признак	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	21	22
Связывание с RGM A человека	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Связывание с RGM A крысы	+	-	+	-	+	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+		+
Связывание с RGM С человека	+	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
Связывание с RGM С крысы	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-	+	+	+	+
Ингибирование связывания hRGM A с Неогенином человека	+	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Ингибирование связывания hRGM С с Неогенином человека	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Ингибирование связывания hRGM A с BMP-2 человека	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Ингибирование связывания hRGM A с BMP-4 человека	+	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Например, характеристика 1 встречается в случае антитела 5F9, описанного в настоящем изобретении, и его производных, описанных в настоящем описании.

Например, характеристика 2 встречается в случае антитела 8D1, описанного в настоящем изобретении, и его производных, описанных в настоящем описании.

В частности, связывающий белок по изобретению способен ингибировать по меньшей мере одну биологическую активность RGM, в частности, RGM A, где указанный RGM A выбран из RGM A человека, собакоподобных обезьян, крысы, курицы, лягушки и рыбы.

В соответствии с другим вариантом осуществления, связывающий белок по изобретению имеет один или несколько из следующих кинетических признаков:

(a) константу скорости ассоциации (K_on) для указанной мишени, выбранную из группы, состоящей из: по меньшей мере приблизительно 10² M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10³ M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁴ M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁵ M^-1c^-1; по меньшей мере приблизительно 10⁶ M^-1c^-1 и по меньшей мере приблизительно 10⁷ M^-1c^-1, как измерено способом резонанса поверхностных плазмонов;

(b) константу скорости диссоциации (k_off) для указанной мишени, выбранную из группы, состоящей из: самое большее приблизительно 10^-2 с^-1; самое большее 10^-3 с^-1; самое большее приблизительно 10^-4 с^-1; самое большее 10^-5 с^-1; и самое большее приблизительно 10^-6 с^-1, как измерено способом резонанса поверхностных плазмонов; или

(c) константу диссоциации (K_D) для указанной мишени, выбранную выбрана из группы, состоящей из: самое большее приблизительно 10^-7 M; самое большее приблизительно 10^-8 M; самое большее приблизительно 10^-9 M; самое большее приблизительно 10^-10 M; самое большее приблизительно 10^-11 M; самое большее приблизительно 10^-12 M и самое большее 10^-13 M.

В соответствии с дополнительным аспектом, изобретение относится к конструкции антитела, содержащей вышеописанный связывающий белок, причем указанная конструкция антитела содержит линкерный полипептид или константный домен иммуноглобулина.

Указанная конструкция антитела или связывающий белок по изобретению могут быть выбраны из группы, состоящей из: молекулы иммуноглобулина, моноклонального антитела, химерного антитела, CDR-привитого антитела, гуманизированного антитела, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, дисульфид-связанного Fv, scFv, однодоменного антитела, диатела, мультиспецифического антитела, антитела с двойной специфичностью, иммуноглобулина с двумя вариабельными доменами и биспецифического антитела.

В конструкции антитела по изобретению указанный связывающий белок содержит константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из:

константного домена IgM человека,

константного домена IgG1 человека,

константного домена IgG2 человека,

константного домена IgG3 человека,

константного домена IgG4 человека,

константного домена IgE человека,

константного домена IgD человека,

константного домена IgA1 человека,

константного домена IgA2 человека,

константного домена IgY человека и

соответствующих мутированных константных доменов.

В частности, конструкция антитела по изобретению содержит константный домен иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к конъюгату антитела, содержащему описанную в настоящем описании конструкцию антитела, причем указанное антитело дополнительно содержит средство, выбранное из группы, состоящей из: молекулы иммуноадгезии, средства визуализации, терапевтического средства и цитотоксического средства, причем каждое средство является конъюгированным, например, ковалентно связанным, с указанным связывающим белком.

Например, указанным средством является средство визуализации, выбранное из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В частности, указанным средством визуализации является радиоактивная метка, выбранная из группы, состоящей из: ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm.

Например, указанное средство является терапевтическим или цитотоксическим средством, выбранным из группы, состоящей из: антиметаболита, алкилирующего средства, антибиотика, фактора роста, цитокина, антиангиогенного средства, антимитотического средства, антрациклина, токсина и апоптотического средства.

В соответствии с другим вариантом осуществления, указанный связывающий белок по изобретению, как описано в настоящем описании, имеет характер гликозилирования, характерный для человека.

Кроме того, связывающие белки, конструкции антител и конъюгат антитела по изобретению могут находиться в виде кристалла (в кристаллической форме), предпочтительно, с сохранением биологической активности.

В частности, указанный кристалл представляет собой фармацевтический кристалл, не содержащий носителя с контролируемым высвобождением. Благодаря указанной кристаллической формы связывающий белок, конструкция антитела или конъюгат антитела может иметь большее время полужизни in vivo, чем соответствующая растворимая копия.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность связывающего белка, аминокислотную последовательность конструкции антитела и аминокислотную последовательность конъюгата антитела, как описано в настоящем описании.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему выделенную нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем описании. В частности, вектор выбран из группы, состоящей из pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV и pBJ.

Изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей такой вектор. В частности, указанная клетка-хозяин является прокариотической клеткой, например, E.coli; или эукариотической клеткой и может быть выбрана из группы, состоящей из клетки одноклеточного организма, клетки животного, клетки растения и грибной клетки. В частности, указанной эукариотической клеткой является клетка животного, выбранная из группы, состоящей из: клетки млекопитающего, клетки птицы и клетки насекомого. Предпочтительно, указанная клетка-хозяин выбрана из клеток HEK, клеток CHO, клеток COS и клеток дрожжей. Клеткой дрожжей может быть Saccharomyces cerevisiae, а клеткой насекомого может быть клетка Sf9.

Изобретение также относится к способу получения белка, способного связывать RGM, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, определенной в настоящем описании, в культуральной среде при условиях, достаточных для получения связывающего белка, способного связывать RGM.

Изобретение также относится к белку, получаемому в соответствии с указанным способом.

Изобретение также относится к композиции для высвобождения связывающего белка, причем указанная композиция содержит

(a) композицию, где указанная композиция содержит кристаллизованный продукт-белок, определенный в настоящем описании, и ингредиент; и

(b) по меньшей мере один полимерный носитель.

Указанным полимерным носителем может быть полимер, выбранный из группы, состоящей из: поли(акриловой кислоты), поли(цианоакрилатов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(депсипептида), поли(эфиров), поли(молочной кислоты), поли(сополимера молочной и гликолевой кислот) или PLGA, поли(b-гидроксибутирата), поли(капролактона), поли(диоксанона); поли(этиленгликоля), поли((гидроксипропил)метакрилата, поли[(органо)фосфазена], поли(ортоэфиров), поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, плюрониковых полиолов, альбумина, альгината, целлюлозы и производных целлюлозы, коллагена, фибрина, желатина, гиалуроновой кислоты, олигосахаридов, гликаминогликанов, сульфатированных полисахаридов, их смесей и сополимеров.

Указанный ингредиент может быть выбран из группы, состоящей из альбумина, сахарозы, трегалозы, лактита, желатина, гидроксипропил-β-циклодекстрина, метоксиполиэтиленгликоля и полиэтиленгликоля.

Согласно другому аспекту, изобретение относится к способу лечения млекопитающего, предусматривающий стадию введения млекопитающему эффективного количества композиции, определенной в настоящем описании.

Согласно другому аспекту, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей продукт (в частности, связывающий белок, конструкцию или конъюгат, описанные выше) и фармацевтически приемлемый носитель.

Указанный фармацевтически приемлемый носитель может функционировать в качестве адъюванта, который можно использовать для увеличения абсорбции или дисперсии указанного связывающего белка.

Например, указанным адъювантом является гиалуронидаза.

В соответствии с другим вариантом осуществления, указанный фармацевтический препарат дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство для лечения нарушения, в котором активность RGM оказывает негативное действие. Например, указанное средство выбрано из группы, состоящей из терапевтического средства, средства визуализации, цитотоксического средства, ингибиторов ангиогенеза; ингибиторов киназы; блокаторов молекул костимуляции; блокаторов молекул адгезии; антицитокин-антитела или его функционального фрагмента; метотрексата; циклоспорина; рапамицина; FK506; детектируемой метки или репортера; антагониста TNF; противоревматического средства; миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), аналгезирующего средства, анестетического средства, седативного средства, местного анестетика, нейромышечного блокатора, противомикробного средства, антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, эритропоэтина, иммунизирующего средства, иммуноглобулина, иммуносупрессивного средства, гормона роста, средства заместительной гормональной терапии, радиофармацевтического препарата, антидепрессанта, антипсихотического средства, стимулятора, противоастматического средства, бета-агониста, ингалируемого стероида, эпинефрина или его аналога, цитокина и антагониста цитокина.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения активности RGM A человека, предусматривающему контактирование RGM A человека по меньшей мере с одним продуктом (в частности, связывающим белком, конструкцией или конъюгат, описанными в настоящем описании выше), так что уменьшается по меньшей мере одна активность RGM A человека.

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения связывания hRGM A с рецептором Неогенином у индивида, при необходимости, предусматривающему стадию введения индивиду продукта по изобретению (в частности, связывающего белка, конструкции или конъюгата, описанных в настоящем описании выше).

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения связывания hRGM A с морфогенетическим белком кости 2 и/или морфогенетическим белком кости 4 (BMP-2 и BMP-4) у индивида, при необходимости, предусматривающему стадию введения индивиду продукта по изобретению (в частности, связывающего белка, конструкции или конъюгата, описанных в настоящем описании выше).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения нарушения, связанного с активностью RGM A у индивида, предусматривающему стадию введения одного или в комбинации с другими терапевтическими средствами продукта по изобретению (в частности, связывающего белка, конструкции или конъюгата, описанных в настоящем описании выше).

Настоящее изобретение также относится к способу уменьшения активности RGM A у индивида, страдающего нарушением, при котором активность RGM A оказывает негативное воздействие, предусматривающему введение индивиду продукта по изобретению (в частности, связывающего белка, конструкции или конъюгата, описанных в настоящем описании выше), одного или в комбинации с другими терапевтическими средствами.

Указанное нарушение предпочтительно включает неврологические заболевания, выбранные из группы, состоящей из бокового амиотрофического склероза, повреждения плечевого сплетения, повреждения головного мозга, в том числе травматического повреждения головного мозга, церебрального паралича, болезни Гийена-Барре, лейкодистрофий, рассеянного склероза, поствакцинального полиомиелита, spina bifida (расщелины позвоночника), повреждения спинного мозга, спинально-мышечной атрофии, спинальных опухолей, инсульта, поперечного миелита; деменции, сенильной деменции, легкого когнитивного нарушения, связанной с болезнью Альцгеймера деменции, хореи Хантингтона, поздней дискинезии, гиперкинезий, маний, болезни Паркинсона, синдрома Стила-Ричардсона, синдрома Дауна, тяжелой псевдопаралитической миастении, травмы нерва, сосудистого амилоидоза, кровоизлияния I в головной мозг с амилоидозом, воспаления головного мозга, острого нарушения со спутанностью сознания, бокового амиотрофического склероза, глаукомы и болезни Альцгеймера.

Другие конкретные варианты по изобретению определены ниже:

выделенный связывающий белок, который специфически взаимодействует по меньшей мере с одним эпитопом белка hRGM A;

указанный выделенный белок, являющийся моноклональным нейтрализующим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом;

указанный антигенсвязывающий фрагмент, содержащий домен VH и VL;

указанное нейтрализующее антитело, уменьшающее способность hRGM A связываться с его рецептором;

указанное нейтрализующее антитело, способное ингибировать биологическую активность hRGM A;

указанное антитело, распознающее рецептор RGM A, выбранный из рецептора RGM A человека, собакоподобных обезьян, крысы, курицы, лягушки и рыбы;

указанное антитело, распознающее белок RGM A, аминокислотная последовательность которого на 90% гомологи