Вирус диареи крупного рогатого скота с модифицированным белком erns

Вирус диареи крупного рогатого скота с модифицированным белком erns

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым химерным пестивирусам и к их применению в иммуногенных композициях и вакцинах. Оно также относится к способам и наборам для лечения или предупреждения распространения инфекции вирусом диареи крупного рогатого скота. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению химерных пестивирусов в способах и наборах для дифференцировки между вакцинированными животными и животными, инфицированными вирусом дикого типа.

Предшествующий уровень техники

Пестивирусы, включая вирус диареи крупного рогатого скота (вирус BVD или BVDV), были выделены из нескольких видов животных, как домашних, так и диких. Идентифицированные хозяева BVDV включают буйвола, антилопу, северного оленя и разные виды оленя, в то время как уникальные виды пестивируса были идентифицированы у жирафов и вилорогой антилопы. BVDV представляет собой небольшой РНК-вирус из семейства Flaviviridae. Он является близкородственным в отношении других пестивирусов, которые являются возбудителями пограничной болезни у овец и классической свиной лихорадки у свиней. Недавно в качестве возбудителя фетальной инфекции поросят в Австралии был идентифицирован дивергентный пестивирус, названный пестивирус Бунгованна (Bungowannah).

Заболевание, вызванное BVDV, в частности, у крупного рогатого скота, является широко распространенным и может быть экономически разрушительным. Инфекция BVDV у крупного рогатого скота может приводить к проблемам при размножении и может вызывать выкидыши или преждевременные роды. BVDV способен проходить через плаценту беременных самок крупного рогатого скота и может приводить к рождению хронически инфицированных (PI) телят, которые являются иммунотолерантными в отношении данного вируса и устойчиво виремическими в течение остальной части их жизни. Инфицированный крупный рогатый скот также может проявлять «вирусную диарею», характеризующуюся повышенной температурой, диареей, кашлем и образованием язв на слизистой оболочке пищеварительной системы. Эти хронически инфицированные животные служат источником распространения вируса в стаде для последующих вспышек вирусной диареи и сильно предрасположены к инфекции микроорганизмами, ответственными за возникновение кишечных заболеваний или пневмонии.

BVDV классифицируют на один из двух биотипов. Вирусы биотипа «ср» индуцируют цитопатическое действие на культивируемые клетки, тогда как вирусы нецитопатического или «ncp» биотипа не индуцируют такое действие. Кроме того, распознают два главных генотипа (тип 1 и 2), оба из которых, как было показано, вызывают ряд клинических синдромов.

Вирионы BVDV имеют диаметр от 40 до 60 нм. Нуклеокапсид BVDV состоит из одной молекулы РНК и белка капсида С. Данный нуклеокапсид окружен липидной мембраной с двумя гликопротеинами, Е1 и Е2, заякоренными в ней. Третий гликопротеин, E^rns, является слабо ассоциированным с данной оболочкой. Геном BVDV имеет длину приблизительно 12,5 тысяч пар оснований и содержит одну открытую рамку считывания, расположенную между 5' и 3' нетранслируемыми областями (NTR). Полипротеин приблизительно 438 кДа транслируется с этой открытой рамки считывания и подвергается процессингу клеточными и вирусными протеазами по меньшей мере на одиннадцать структурных и неструктурных (NS) вирусных белков (Tautz, et al., J. Virol. 71:5415-5422 (1997); Xu, et al., J. Virol. 71:5312-5322 (1997); Elbers, et al., J. Virol. 70:4131-4135 (1996); и Wiskerchen, et al., Virology 184:341-350 (1991)). Порядок генома BVDV представляет собой p20/N^pro, р14/С, gp48/E^rns, gp25/Е1, gp53/Е2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A и p75/NS5B. Три белка оболочки, gp48/E^rns, gp25/Е1 и gp53/Е2, являются сильно гликозилированными. E^rnz (ранее названный Е0 или gp48) образует гомодимеры, ковалентно связанные дисульфидами. Отсутствие гидрофобной мембранной якорной области свидетельствует о том, что E^rns является слабоассоциированным с данной оболочкой. E^rns индуцирует высокие титры антител у инфицированного крупного рогатого скота, но антисыворотка имеет ограниченную активность, нейтрализующую вирус.

Среди доступных в настоящее время вакцин против BVDV имеются вакцины, которые содержат химически инактивированный вирус дикого типа. Эти вакцины обычно требуют введения множества доз и приводят к кратковременному иммунному ответу; они также не защищают против переноса вируса плоду. Сообщали о субъединичной вакцине на основе очищенного белка Е2 у овец. Несмотря на то, что эта вакцина, по-видимому, защищает плоды от инфицирования, защита ограничена только гомологичным штаммом вируса и нет корреляции между титрами антител и защитой.

Модифицированные живые (ML) вакцины против BVDV продуцировали с использованием вируса, который был аттенуирован повторными пассированиями в клетках животных, являющихся представителями крупного рогатого скота или свиней, или посредством химически индуцированных мутаций, которые придают данному вирусу чувствительный к температуре фенотип. Оказалось, что одной дозы вакцины на основе MLV BVDV достаточно для обеспечения защиты от инфекции, и длительность иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота может сохраняться годами. Кроме того, сообщали о перекрестной защите при использовании вакцин на основе MLV (Martin, et al., In "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75:183 (1994)). Однако существующие вакцины на основе MLV не обеспечивают возможность дифференцировки вакцинированных животных от животных, инфицированных естественным путем.

Таким образом, очевидно, что существует потребность в новых вакцинах для контролирования распространения BVDV. Такая вакцина(ы) может оказаться бесценной в будущих национальных или региональных программах по искоренению BVDV и также может быть объединена с другими вакцинами крупного рогатого скота, представляя существенное достижение в данной промышленности. Более эффективной вакциной для контролирования и мониторинга распространения BVDV является «маркерная» вакцина. Такая вакцина может либо содержать дополнительную антигенную детерминанту, которая не присутствует в вирусе дикого типа, либо не иметь антигенную детерминанту, которая присутствует в вирусе дикого типа. В отношении первой, у вакцинированных животных устанавливается иммунный ответ к «маркерной» иммуногенной детерминанте, тогда как у невакцинированных животных он не устанавливается. Используя иммунологический анализ, направленный против маркерной детерминанты, вакцинированных животных можно отличить от невакцинированных животных, инфицированных естественным образом, по присутствию антител к этой маркерной детерминанте. В случае последней стратегии, у животных, инфицированных вирусом дикого типа, устанавливается иммунный ответ к маркерной детерминанте, тогда как у неинфицированных вакцинированных животных не устанавливается в результате того, что данная детерминанта не присутствует в маркированной вакцине. Используя иммунологический анализ, направленный против маркерной детерминанты, инфицированных животных можно отличить от вакцинированных неинфицированных животных. В обоих случаях посредством отбраковки инфицированных животных стадо с течением времени может освободиться от BVDV. Помимо пользы устранения угрозы заболевания BVDV, сертификация стада как не содержащего BVDV имеет непосредственную экономическую пользу свободы торговли.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный E^rns белок, и где указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный E^rns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный; синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного E^rns белка.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где гетерологичный E^rns белок указанного химерного пестивируса или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного E^rns белка происходят из пестивируса, выбранного из группы, состоящей из пестивируса северного оленя, пестивируса жирафа и пестивируса вилорогой антилопы.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где гетерологичный E^rns белок указанного химерного пестивируса имеет по меньшей мере один E^rns эпитоп, который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где в гетерологичном E^rns белке указанного химерного пестивируса отсутствует по меньшей мере один E^rns эпитоп, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена культура химерного пестивируса, как он описан выше.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена линия клеток или клетка-хозяин, содержащие химерный пестивирус, как он описан выше.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена молекула полинуклеотида, кодирующая химерный пестивирус, как он описан выше.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая данный химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.

В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где ветеринарно приемлемый носитель представляет собой адъювант.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где указанный химерный вирус является живым аттенуированным.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является инактивированным.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, дополнительно содержащая один или более чем один дополнительный антиген, полезный для лечения или предупреждения распространения одного или более чем одного дополнительного патогенного микроорганизма у животного.

В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая молекулу полинуклеотида, кодирующую химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где ветеринарно приемлемый носитель представляет собой адъювант.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является живым аттенуированным.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является инактивированным.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, дополнительно содержащая один или более чем один дополнительный антиген, полезный для лечения или предупреждения распространения одного или более чем одного дополнительного патогенного микроорганизма у животного.

В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая полинуклеотидную молекулу, кодирующую химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий в по меньшей мере одном контейнере вакцину, содержащую химерный пестивирус, как он описан выше.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предупреждения распространения инфекции вирусом диареи крупного рогатого скота, где животному вводят вакцину, содержащую химерный пестивирус, как он описан выше.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ вакцинирования животного, где указанному животному вводят пестивирусную DIVA-вакцину (вакцину, разработанную с возможностью дифференцировки инфицированных животных от вакцинированных), и где указанная пестивирусная DIVA-вакцина содержит химерный пестивирус, как он описан выше, где дополнительно указанный химерный пестивирус имеет по меньшей мере один E^rns эпитоп, который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ вакцинирования животного, где указанному животному вводят пестивирусную DIVA-вакцину, и где указанная DIVA-вакцина содержит химерный пестивирус, как он описан выше, где дополнительно в указанном химерном пестивирусе отсутствует по меньшей мере один Е^rns эпитоп, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ дифференцировки между животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, и животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, где животное, вакцинированное указанной вакциной, генерирует антитела к по меньшей мере одному E^rns эпитопу, который присутствует в химерном пестивирусе указанной вакцины, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, включающий стадии:

а) получения образца сыворотки от животных;

б) проведения анализа указанных образцов на присутствие или отсутствие антител;

в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной; и

г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ дифференцировки между животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, и животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, где животное, инфицированное вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, генерирует антитела к по меньшей мере одному E^rns эпитопу, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе указанной вакцины, включающий стадии:

а) получения образца сыворотки от животных;

б) проведения анализа указанных образцов на присутствие или отсутствие антител;

в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа; и

г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной.

В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор для дифференцировки между животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, и животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, содержащий реагенты, способные к обнаружению антител к по меньшей мере одному E^rns эпитопу, который присутствует в химерном пестивирусе данной вакцины, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор для дифференцировки между животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, и животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, содержащий реагенты, способные к обнаружению антител к по меньшей мере одному E^rns эпитопу, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе данной вакцины.

В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложено антитело, которое распознает эпитоп E^rns, который присутствует в химерном пестивирусе, как он описан выше, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.

В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложено антитело, которое распознает эпитоп, присутствующий в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе, как он описан выше.

В другом воплощении химерный пестивирус, как он здесь описан, используют в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекций, вызванных BVDV.

Подробное описание изобретения

Следующие определения можно применять в отношении терминов, используемых при описании воплощений данного изобретения. Следующими определениями заменяют любые противоречащие определения, содержащиеся в каждом отдельном источнике, включенном сюда посредством ссылки.

Если здесь не определено иначе, научные и технические термины, используемые в контексте настоящего изобретения, должны иметь значения, которые наиболее понятны обычным специалистам в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число.

Термин «аминокислота», как он использован здесь, относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют способом, аналогичным аминокислотам, встречающимся в природе. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицируются, например гидроксипролин, карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, аминокислоты, не являющиеся природными, такие как a- и a-двухзамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты, также могут быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры нестандартных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты.

Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же самую базовую химическую структуру, что и аминокислота, встречающаяся в природе, то есть углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и группу R. Типичные аналоги аминокислот включают, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метионин метилсульфония. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и аминокислота, встречающаяся в природе. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, имеющим структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая функционирует аналогичным образом, что и аминокислота, встречающаяся в природе.

Аминокислоты могут здесь быть названы либо их общепринятыми трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (Международный союз теоретической и прикладной химии - Международный союз биохимии).

Подразумевается, что термин «животное», как он использован здесь, включает любое животное, которое является чувствительным к инфекциям BVDV, включая, но не ограничиваясь видами жвачных животных, овец, коз и свиней, как одомашненных, так и диких.

Термин «антитело» или «антитела», как он использован здесь, относится к молекуле иммуноглобулина, способной к связыванию с антигеном посредством распознавания эпитопа. Антитела могут быть поликлональной смесью или моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, происходящими из естественных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела могут существовать в ряде форм, включая, например, такие как Fv, Fab', F(ab')2, а также в виде одиночных цепей.

Термин «антиген», как он использован здесь, относится к молекуле, которая содержит один или более чем один эпитоп (линейный, конформационный или оба), который при воздействии на субъекта будет индуцировать иммунный ответ, который является специфичным в отношении этого антигена. Термин «антиген» может относиться к аттенуированным, инактивированным или модифицированным живым бактериям, вирусам, грибам, паразитам или другим микробам. Термин «антиген», как он использован здесь, также может относиться к субъединичному антигену, который является отдельным и разобщен от целого организма, с которым данный антиген ассоциирован в природе. Термин «антиген» также может относиться к антителам, таким как антиидиотипические антитела или их фрагменты, и к мимеотопам синтетических пептидов, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин «антиген» также может относиться к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, как, например, в подходах по иммунизации ДНК.

Термины «BVDV», «изоляты BVDV» или «штаммы BVDV», как они использованы здесь, относятся к вирусам диареи крупного рогатого скота, включая, но не ограничиваясь типом I и типом II, которые состоят из вирусного генома, ассоциированных белков и других химических компонентов (таких как липиды). Специалистам в данной области техники известен ряд вирусов диареи крупного рогатого скота типа I и типа II, и они доступны, например, в Американской коллекции типовых культур (АТТС®). Вирус диареи крупного рогатого скота имеет геном в форме РНК. РНК может подвергаться обратной транскрипции в ДНК для использования в клонировании. Таким образом, сделанные здесь ссылки на нуклеиновую кислоту и последовательности вируса диареи крупного рогатого скота, охватывают как последовательности вирусной РНК, так и последовательности ДНК, происходящие из последовательностей данной вирусной РНК.

Термины «линия клеток» или «клетка-хозяин», как они использованы здесь, означают прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой вирус может реплицироваться и/или сохраняться.

Термин «химерный» или «химера», как он использован здесь, означает микроорганизм, например вирус, содержащий генетические или физические компоненты, происходящие из более чем одного предшественника.

Термин «культура», как он использован здесь, означает популяцию клеток или микроорганизмов, растущую в отсутствие других видов или типов.

Термин «DIVA», как он использован здесь, означает вакцину, которая способна дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных.

«Эпитоп» представляет собой специфичный сайт антигена, который связывается с рецептором Т-клетки или со специфичным антителом и обычно содержит от примерно 3 аминокислотных остатков до примерно 20 аминокислотных остатков.

Термин «гетерологичный», как он использован здесь, означает происходящий из другого вида или штамма.

Термин «гомологичный», как он использован здесь, означает происходящий из того же самого вида или штамма.

Термин «иммуногенная композиция», как он использован здесь, означает композицию, которая генерирует иммунный ответ (то есть имеет иммуногенную активность), когда ее вводят животному саму по себе или с фармацевтически приемлемым носителем. Иммунный ответ может быть клеточным иммунным ответом, опосредованным главным образом цитотоксическими Т-клетками, или гуморальным иммунным ответом, опосредованным главным образом хелперными Т-клетками, которые, в свою очередь, активируют В-клетки, приводя к продуцированию антител.

Термин «патоген» или «патогенный микроорганизм», как он использован здесь, означает микроорганизм, например вирус, бактерию, гриб, простейшее или гельминт, который способен индуцировать или вызывать заболевание, болезнь или аномальное состояние у животного-хозяина.

Термин «пестивирус», как он использован здесь, означает РНК-вирус из рода Pestivirus семейства Flaviviridae. Пестивирусы включают, без ограничения, следующие: BVDV (тип 1 и тип 2), вирус классической чумы свиней (CSFV) и вирус пограничной болезни овец (BDV), а также пестивирусы, выделенные из таких видов как дикий кабан, буйвол, антилопа канна, бизон, альпака, олень пуду, бонго, разные виды оленей, жираф, северный олень, серна и вилорогая антилопа (Vilcekand Nettleton; Vet Microbiol. 116:1-12 (2006)).

Термин «полинуклеотидная молекула», как он использован здесь, означает органическую полимерную молекулу, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепь. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) являются примерами полинуклеотидов с различной биологической функцией.

Термины «предупреждать», «предупреждающий» или «предупреждение» и тому подобное, как они использованы здесь, означают ингибирование репликации микроорганизма, ингибирование передачи микроорганизма или ингибирование внедрения микроорганизма в хозяина. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать ингибирование или блокирование одного или более чем одного признака или симптома инфекции.

Термин «терапевтически эффективное количество», как он использован здесь, означает количество микроорганизма, или субъединичного антигена, или полипептидов, или молекул полинуклеотидов и их комбинаций, которое является достаточным для индуцирования иммунного ответа у субъекта, которому его вводят. Иммунный ответ может включать, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета.

Термины «лечить», «лечащий» или «лечение» и тому подобное, как они использованы здесь, означают уменьшение или устранение инфекции микроорганизмом. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать уменьшение репликации микроорганизма, уменьшение передачи микроорганизма или уменьшение способности микроорганизма к внедрению его в хозяина. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать уменьшение, улучшение или устранение одного или более чем одного признака или симптома инфекции микроорганизмом или ускорение выздоровления от инфекции микроорганизмом.

Термины «вакцина» и «вакцинная композиция», как они использованы здесь, означают композицию, которая предупреждает или уменьшает инфекцию или которая предупреждает или ослабляет один или более чем один признак или симптом инфекции. Данные защитные эффекты вакцинной композиции против патогена обычно достигаются индуцированием у субъекта иммунного ответа, либо клеточно-опосредованного, либо гуморального иммунного ответа, либо комбинации их обоих. Говоря в общем, устранение или снижение распространения инфекции, уменьшение интенсивности признаков или симптомов или ускоренное устранение микроорганизма из инфицированных субъектов указывают на защитные эффекты вакцинной композиции. Вакцинные композиции по настоящему изобретению обеспечивают защитные эффекты против инфекций, вызванных BVDV.

Термин «вариант», как он использован здесь, относится к производному данной белковой и/или генной последовательности, где полученная последовательность по существу является той же, что и данная последовательность, не считая мутационных различий. Указанные различия могут быть встречающимися в природе или созданными синтетически либо генетически.

Термин «ветеринарно приемлемый носитель», как он использован здесь, относится к веществам, которые находятся в пределах объема надежной медицинской оценки, подходит для использования в контакте с тканями животных без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, соответствует приемлемому отношению польза:риск и является эффективным для его намеченного применения.

Следующее описание приведено для того, чтобы помочь специалистам в данной области техники воплотить настоящее изобретение на практике. Тем не менее, данное описание не следует истолковывать как ограничивающее настоящее изобретение ненадлежащим образом, поскольку обычные специалисты в данной области могут сделать модификации и изменения в обсуждаемых здесь воплощениях без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.

ВИРУСЫ. ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ

Согласно настоящему изобретению предложены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие один или более чем один химерный пестивирус, где указанные химерные пестивирусы включают вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный E^rns белок, но где указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный E^rns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного E^rns белка. Химерный пестивирус может быть выбран из группы, состоящей из химер BVDV/пестивирус северного оленя, BVDV/пестивирус жирафа и BVDV/пестивирус вилорогой антилопы, но не ограничен ими.

В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса жирафа представляет собой штамм, депонированный как UC 25547 в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС®), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, США, которому присвоен номер депонирования в АТСС® РТА-9938. В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса вилорогой антилопы представляет собой штамм, депонированный как UC 25548 в АТСС®, которому присвоен номер депонирования в АТСС® РТА-9939. В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса северного оленя представляет собой штамм, депонированный как UC 25549 в АТСС®, которому присвоен номер депонирования АТСС® РТА-9940.

Химерные пестивирусы по настоящему изобретению можно размножать в клетках, линиях клеток и клетках-хозяевах. Указанные клетки, линии клеток или клетки-хозяева могут представлять собой, например, без ограничения, клетки млекопитающих и клетки организмов, не являющихся млекопитающими, включая клетки насекомых и растений. Клетки, линии клеток и клетки-хозяева, в которых можно размножать химерные пестивирусы по настоящему изобретению, хорошо известны и доступны обычным специалистам в данной области техники.

Химерные пестивирусы по настоящему изобретению можно ослабить или инактивировать перед применением в иммуногенной композиции или вакцине. Способы аттенуации и инактивации хорошо известны специалистам в данной области техники. Способы аттенуации включают, без ограничения, серийный пассаж в культуре клеток на подходящей линии клеток, ультрафиолетовое облучение и химический мутагенез. Способы инактивации включают, без ограничения, обработку формалином, бета-проприолактоном (BPL) или бинарным этиленимином (ВЕ1) или другие способы, известные специалистам в данной области техники.

Инактивацию формалином можно проводить смешиванием суспензии данного вируса с 37%-ным формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,05%. Эту смесь вирус-формальдегид смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Смесь инактивированного вируса затем тестируют на остаточный живой вирус путем оценки роста на подходящей линии клеток.

Инактивацию BEI можно проводить смешиванием суспензии вируса по настоящему изобретению с 0,1 М BEI (2-бром-этиламин в 0,175 н. NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Эту смесь вирус-BEI смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 48 часов при комнатной температуре с последующим добавлением 1,0 М тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Смешивание продолжают в течение еще двух часов. Смесь инактивированного вируса тестируют на остаточный живой вирус путем оценки роста на подходящей линии клеток.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут включать один или более чем один ветеринарно приемлемый носитель. Термин «ветеринарно приемлемый носитель», как он использован здесь, включает все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу, известные среди прочих специалистам в данной области техники. Стабилизаторы включают альбумин, известный среди прочих специалисту в данной области техники. Консерванты включают мертиолат, известный среди прочих специалисту в данной области техники.

Адъюванты включают, без ограничения, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), квасцы, гель на основе гидроксида алюминия, эмульсии типа «масло-в-воде», эмульсии типа «вода-в-масле», такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) или другие фракции сапонина, монофосфориллипид А, липид-аминный адъювант авридин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин или мурамил-дипептид, известные среди многих других специалистам в данной области техники. Количества и концентрации адъювантов и добавок, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены квалифицированным специалистом. В одном воплощении согласно настоящему изобретению предусмотрены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта. В другом воплощении адъювант включен в количестве от примерно 100 мкг до примерно 1500 мкг, или от примерно 250 мкг до примерно 1000 мкг, или от примерно 350 мкг до примерно 750 мкг. В другом воплощении адъювант включен в количестве примерно 500 мкг/2 мл дозу иммуногенной композиции или вакцины.

Иммуногенные композиции и вакцины также могут включать антибиотики. Такие антибиотики включают, без ограничения, антибиотики из классов аминогликозидов, карбапенемов, цефалоспоринов, гликопептидов, макролидов, пенициллинов, полипептидов, хинолонов, сульфонамидов и тетрациклинов. В одном воплощении в настоящем изобретении предусмотрены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотика. В другом воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат от примерно 5 мкг/мл до примерно 55 мкг/мл антибиотика, или от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл антибиотика, или от примерно 15 мкг/мл до примерно 45 мкг/мл антибиотика, или от примерно 20 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл антибиотика, или от примерно 25 мкг/мл до примерно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат менее чем примерно 30 мкг/мл антибиотика.

Иммуногенные композиции и вакцины по данному изобретению могут дополнительно включать один или более чем один другой иммуномодулирующий агент, такой как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины, подходящие количества которых могут быть определены квалифицированным специалистом.

Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут включать одну или более чем одну полинуклеотидную молекулу, кодирующую химерный пестивирус. В иммуногенных композициях или вакцинах можно использовать молекулы либо ДНК, либо РНК, кодирующие весь геном химерного пестивируса, или одну или более чем одну открытую рамку считывания. Молекулу ДНК или РНК можно вводить в отсутствие других агентов или ее можно вводить совместно с агентом, облегчающим поглощение клеткой (например, с липосомами или катионными липидами). Общее содержание полинуклеотидов в иммуногенной композиции или вакцине в целом будет составлять от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 5,0 мг/мл. В другом воплощении общее содержание полинуклеотидов в иммуногенной композиции или вакцине будет составлять от примерно 1 мкг/мл до примерно 4,0 мг