Клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью

Клостридиальные нейротоксины с измененной персистентностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам, например ботулиническим нейротоксинам, которые изменены в отношении их белковой структуры по сравнению с соответствующими нейротоксинами дикого типа. Указанное отличие в белковой структуре приводит, среди прочего, к измененному периоду активности, например, пролонгированной активности или персистентности.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Химическая денервация относится к применению средства для предотвращения стимуляции нервом его ткани-мишени, например мышцы, железы или другого нерва. Химическую денервацию осуществляют, например, фенолом, этиловым спиртом или ботулотоксином. Химическая денервация целесообразна, например, для пациентов с локальной спастичностью в одной или в двух больших мышцах или в нескольких мелких мышцах. Ее можно использовать для снятия таких симптомов, как мышечный спазм и боль, и снижения гиперрефлексии.

Средства для химической денервации блокируют нейромышечную передачу в нервномышечном соединении, вызывая паралич или парез соответствующих скелетных мышц. Термин «парез» определяют в дальнейшем как состояние, характеризующееся частичной потерей подвижности или нарушенной моторикой. Такое действие осуществляется либо пресинаптическим воздействием посредством ингибирования синтеза или высвобождения ацетилхолина (ACh), либо постсинаптическим воздействием на рецептор ацетилхолина. Примером лекарственных средств, которые действуют пресинаптически, является ботулотоксин, тетродотоксин и столбнячный токсин.

Термин «химическая денервация» также охватывает все эффекты, которые напрямую или косвенно вызваны средством для химической денервации, следовательно, также охватывает восходящие, нисходящие или долговременные эффекты указанного средства для химической денервации. Следовательно, пресинаптические эффекты также охватывают постсинаптические эффекты, воздействия на ткань и/или непрямые воздействия через нейроны спинного мозга или афферентные нейроны.

Одно средство для химической денервации, ботулотоксин, хотя и является одним из наиболее токсичных соединений на сегодняшний день, раньше применялось для лечения большого количества состояний и нарушений, некоторые из которых описаны, например, в PCT/EP 2007/005754. Кроме того, коммерческие формы ботулотоксина типа A, основанные на белковом комплексе ботулотоксина A, доступны под торговым наименованием ботокс^® (Allergan Inc.) и под торговым наименованием диспорт (Ipsen^® Ltd.), соответственно. Фармацевтическая композиция, основанная на препарате токсина более высокой степени очистки и содержащая нейротоксичный компонент ботулотоксина типа A, не содержащая комплексообразующие белки в выделенной форме, коммерчески доступна в Германии от фирмы Merz Pharmaceuticals GmbH под торговым наименованием ксеомин^®.

Анаэробная, грамположительная бактерия Clostridium botulinum продуцирует мощный полипептидный нейротоксин, ботулотоксин, который вызывает нервно-паралитическое расстройство у людей и животных, называемые ботулизмом. Споры Clostridium botulinum обнаружены в почве и могут прорасти в ненадлежащим образом стерилизованных и герметично закрытых емкостях с продуктами при домашнем консервировании, что является причиной многих из случаев ботулизма. Ботулотоксин A (BoNT/A) является наиболее смертоносным природным биологическим средством, известным людям. Приблизительно 50 пикограмм ботулотоксина (очищенного комплекса нейротоксина) серотипа A является LD₅₀ для мышей. Однако, несмотря на его токсические воздействия, комплекс ботулотоксина, а также очищенный нейротоксин использовали в качестве терапевтического средства при большом количестве заболеваний.

Ботулотоксины высвобождаются из лизированых культур Clostridium, как правило, в виде белков, ответственных за токсические свойства ботулотоксина (нейротоксичный компонент) совместно с другими бактериальными белками (нетоксичные «комплексообразующие белки» или «клостридиальные белки»), которые совместно образуют комплекс токсина, также обозначаемый как «комплекс ботулотоксина». Комплекс ботулотоксина метастабилен в природе, поскольку его стабильность, по-видимому, зависит от различных факторов, таких как, например, концентрация соли и/или величина pH.

Молекулярная масса комплекса может меняться приблизительно от 300000 до приблизительно 900000 Да, то есть от 300 кДа до приблизительно 900 кДа. Комплексообразующие белки представляют собой, например, различные гемагглютинины. Белки данного комплекса токсина сами по себе не являются токсичными, но, как полагают, придают стабильность нейротоксичному компоненту и ответственны за токсичность при пероральном воздействии при интоксикации Botulinum. Существует семь антигенно различающихся серотипов ботулотоксина, а именно ботулотоксин A_, B, C1, D, E, F и G. Везде, где упомянут ботулотоксин серотипа A, B, C1, D, E, F или G, также охвачены известные варианты серотипов, такие как серотипы A1, A2, A3, A4 и так далее.

Компонент клостридиальных токсинов, ответственный за его высокую токсичность, представляет собой нейротоксичный компонент или белок (Mw≈150 кДа, точная молекулярная масса зависит от серотипа). Несколько различных серотипов отличаются по своей аминокислотной последовательности, но все обладают схожей структурой: легкая цепь (LC) приблизительно 50 кДа и тяжелая цепь (HC) приблизительно 100 кДа, которые могут быть связаны одной или несколькими дисульфидными связями (для обзора смотри, например, Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93). Нейротоксичный компонент комплекса ботулотоксина первоначально образуется в виде единичной полипептидной цепи. В случае серотипа A, например, протеолитическое преобразование полипептида приводит к появлению активированного полипептида в виде двухцепочечного полипептида, состоящего из тяжелой цепи и легкой цепи, которые связаны дисульфидной связью. У людей тяжелая цепь опосредует связывание с пресинаптическими холинэргическими нервными окончаниями и интернализацию токсина внутрь клетки. Легкая цепь, как полагают, ответственна за токсические эффекты, действуя как цинковая эндопептидаза и расщепляя специфические белки, ответственные за слияние мембран (SNARE-комплекс) (смотри, например, Montecucco C, Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354)).

Термин «ботулотоксин», используемый на всем протяжении настоящей заявки, относится к нейротоксичному компоненту, лишенному любых других клостридиальных белков, но также и к «комплексу ботулотоксина». Термин «ботулотоксин», используемый в настоящем документе, необходим или желателен в случае, когда нет различий между комплексом токсина и нейротоксичным компонентом. «BoNT» или «NT» являются общепринятыми сокращениями для ботулинического нейротоксина или нейротоксина, соответственно. Нейротоксичная субъединица комплекса ботулотоксина обозначается в данном документе как «нейротоксичный компонент» или «нейротоксичный компонент, не содержащий комплексообразующие белки». Получение нейротоксичного компонента ботулотоксина типа A и B описано, например, в международной патентной заявке WO 00/74703.

Несколько серотипов отличаются по продолжительности их терапевтического эффекта: нормальный период активности лекарственных средств с ботулотоксином A при внутримышечном введении людям находится в диапазоне от 3 до 4 месяцев. В единичных случаях период может продолжаться даже более чем 12 месяцев. В ходе обработки потовых желез сообщали об активности даже 27 месяцев (Bushara K., botulinum toxin and rhinorrhea, Otolaryngol. Head. Neck. Surg., 1996; 114(3):507 и The Laryngoscope 109: 1344 1346:1999). Период активности ботулотоксина типа C1 сравним с периодом активности ботулотоксина A (Eleopra et al., 1997 & 2002). К удивлению, период действия гораздо более короткий у грызунов (например, у мышей) по сравнению с людьми: приблизительно 1-2 месяца для ботулотоксина A, 21 день для ботулотоксина B и только 4 дня для ботулотоксина E (DePaiva et al., 1999, Juradinski et al., 2001).

Foran et al. в 2003 г. анализировал период действия in vitro на нейронах мозжечка крыс и обнаружил, что период полуингибирования экзоцитоза глутамата для ботулотоксина A составляет более чем 31 день; для ботулотоксина типа C1 - более чем 25 дней; для ботулотоксина типа B - приблизительно 10 дней; для ботулотоксина типа F - приблизительно 2 дня и для ботулотоксина типа E - только 0,8 дня.

Период активности ботулотоксина типа A при лечении, например, дистонии (например, кривошея, блефароспазм) у людей находится в диапазоне от 3 до 4 месяцев. Через данный период пациент должен получать другую инъекцию содержащего ботулотоксин лекарственного средства. Было бы большой выгодой для пациента пролонгировать период действия нейротоксина. При этом сократилось бы количество необходимых инъекций в год, а также общее количество клостридиальных белков. Это, в свою очередь, уменьшило бы риск продукции антитела против чужеродного белка. Следовательно, было бы желательно появление ботулотоксина с пролонгированной персистентностью.

Тем не менее продолжительная парализация не всегда желательна. Например, при определенных косметических процедурах иногда требуются только временные «тонкие корректировки». Для достижения уменьшения персистентности врач ограничивался способами предшествующего уровня техники: либо уменьшением объема, либо заменой серотипа. Данные методики, как оказалось, приводили к неудовлетворяющим результатам и требовали глубокого знания как кинетики активности, так антигенных свойств различных серотипов нейротоксина. Следовательно, появление нейротоксина со «встроенной» регулировкой персистентности было бы основным усовершенствованием.

В US 2003/0219462, EP1849801 и WO 02/08268 описаны модифицированные ботулотоксины с добавленными к природному нейротоксину мотивами на основе лейцина или тирозина.

Идея для таких изменений основана на наблюдении, что определенные мотивы на основе лейцина или тирозина способны ограничивать легкую цепь нейротоксичного компонента определенных подтипов внутренней мембраной клетки-мишени. Данный механизм, как предполагается, изменял персистентность определенных легких цепей. До сих пор тем не менее авторы были не в состоянии предоставить какие-либо свидетельства для такого действия и из более новых экспериментов предполагают, что гипотеза в целом неточна.

Более того, даже если в определенных случаях добавление мотивов приводило бы к ограничению мембраной, такой подход неприменим к модификации ботулотоксина A. Это от того, что природная легкая цепь ботулотоксина типа A уже ограничена внутренней клеточной мембраной, следовательно, дополнительное ограничение мембраной не обеспечило бы никакого дополнительного благоприятного действия.

Следовательно, настоящее изобретение следовало по различным направлениям. Как описано в данной заявке, было обнаружено, что добавление второй легкой цепи к нейротоксину, которая по-прежнему сохраняет свою протеолитическую активность, приводит к изменению периода активности. В зависимости от комбинации используемых серотипов период времени можно продлить, позволяя получать изготовленные для определенных целей нейротоксины. Предусматривается предоставить врачу ряд нейротоксинов, персистентность которых не зависит от их серотипа, позволяя проводить более стандартизованное лечение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к клостридиальным нейротоксинам, в одном из вариантов осуществления к ботулотоксинам, с увеличенной или пролонгированной активностью, то есть персистентностью. Таким образом, в первом аспекте настоящая заявка относится к полипептиду, содержащему:

(a) HC-домен нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент; и

(b) первый домен LC нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент; и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC нейротоксичного компонента клостридиального токсина или его фрагмент, где первый и, по меньшей мере, один дополнительный домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга и где каждый из указанных фрагментов указанного первого и указанного, по меньшей мере, одного дополнительного домена LC по-прежнему проявляет протеолитическую активность.

В одном из вариантов осуществления элементы и/или домены соединены связью, пептидным линкером, химическим линкером, дисульфидной связью или посредством комбинации двух или более из указанного выше.

В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность указанного домена LC и/или HC обладает, по меньшей мере, 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью нейротоксичного компонента ботулотоксина серотипа A, B, C_, D, E, F или G.

В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность указанного домена LC и/или HC обладает, по меньшей мере, 50% идентичностью с аминокислотной последовательностью столбнячного токсина (тетаноспазмина).

В одном из вариантов осуществления первый и/или второй домен LC и/или домен HC содержит, по меньшей мере, одну модификацию.

В одном из вариантов осуществления модификация представляет собой мутацию, в другом варианте осуществления - делецию, в еще одном варианте осуществления - инсерцию, в еще одном варианте осуществления - добавление или в еще одном варианте осуществления - аминокислотную замену, или в дополнительном варианте осуществления комбинацию двух или более из указанного выше.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к полипептиду, где связывающий ганглиозид домен и/или связывающий белковый рецептор домен нейротоксина модифицирован так, чтобы увеличить связывающую способность по сравнению с нейротоксином дикого типа, из которого происходит домен HC.

В одном из вариантов осуществления полипептид выбран из группы, состоящей из:

LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C и LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

В очередном варианте осуществления модификация представляет собой химическую модификацию, где химическую модификацию можно выбрать из группы, состоящей из фосфорилирования, пегилирования, гликозилирования, фосфорилирования, сульфатирования, метилирования, ацетилирования, липидизации, гидроксилирования, амидирования или, в дополнительном варианте осуществления, комбинации двух или более из указанного выше. В дополнительном варианте осуществления липидизация может представлять собой миристиолирование, пальмитоилирование, изопренилирование или связывание с глюкозилфосфатидилинозитолом или, в дополнительном варианте осуществления, комбинацию двух или более из указанного выше.

В изобретении также описано антитело, специфичное для любого из упомянутых выше полипептидов.

В изобретении также описана нуклеиновая кислота, кодирующая любой из описанных выше полипептидов. В изобретении, кроме того, описан вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту или ее фрагмент. Клетка-хозяин, содержащая указанную нуклеиновую кислоту или указанный вектор, также описана в настоящем документе.

В изобретении также описан способ получения полипептида, включающий в себя стадии культивирования клетки-хозяина, как упоминалось выше, получения и очистки указанного полипептида, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой или вектором и, необязательно, составление смеси указанного полипептида в фармацевтической композиции.

Изобретение, кроме того, описывает композицию, содержащую упомянутый выше полипептид или полипептид, получаемый упомянутым выше способом. В изобретении также описана указанная композиция, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления композиция дополнительно содержит буфер pH, эксципиент, криозащитное средство, консервант, обезболивающее средство, стабилизатор или любое их сочетание. В одном из вариантов осуществления композиция предлагается в виде лиофилизата. В другом осуществлении предлагается композиция в виде раствора.

В изобретении также описаны композиции для применения при терапевтическом лечении.

В изобретении также описано применение указанных композиций для промышленного производства лекарственных препаратов для терапевтического лечения.

В одном из вариантов осуществления указанное терапевтическое лечение включает лечение фокальной дистонии, спастичности или состояния, которое можно лечить, подавляя секрецию.

В изобретении также описано применение указанной композиции для косметической процедуры. При такой косметической процедуре может быть очень хорошо, что лечение получают, в особенности, млекопитающие, которые психологически страдают от состояния, например от морщинок или глубоких морщин от нахмуренных бровей над переносицей, которое необходимо вылечить.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к:

полипептиду, содержащему:

(a) домен HC нейротоксичного компонента или его фрагмент клостридиального токсина; и

(b) первый домен LC или его фрагмент, и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC или его фрагмент, где первый и второй домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга.

В частности, изобретение относится к полипептиду, содержащему:

(a) HC-домен или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина; и

(b) первый домен LC или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина; и

(c) по меньшей мере, один дополнительный домен LC или его фрагмент нейротоксичного компонента клостридиального токсина, где первый и, по меньшей мере, один дополнительный домен LC могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга, и где каждый из указанных фрагментов указанного первого и указанного, по меньшей мере, одного дополнительного домена LC по-прежнему проявляет протеолитическую активность.

К удивлению, было обнаружено, что добавление одной или нескольких (дополнительных) легких цепей (LC) к полипептиду, содержащему, по меньшей мере, одну тяжелую цепь (HC) и, по меньшей мере, одну легкую цепь (LC) нейротоксичного компонента клостридиальных нейротоксинов, как определено выше, приводит к появлению полипептида с увеличенной, то есть пролонгированной персистентностью активности токсина по сравнению с токсином дикого типа.

Не привязываясь к теории, предполагают, что после связывания с поверхностью клетки обе легкие цепи перемещаются внутрь клетки, увеличивая концентрацию протеолитически активных белков в клетке, тем самым увеличивая как активность, так и персистентность нейротоксина.

А именно, если требуется продолжительная персистентность полипептида по изобретению, специалист в данной области, как инструктируют, применяет определенные комбинации доменов HC и LC, например домены LC, полученные из серотипов с продолжительной персистентностью. В других вариантах осуществления более короткую персистентность обеспечивают, комбинируя определенные другие домены LC или фрагменты, например, такие домены, происходящие из серотипов с более короткой персистентностью.

Термин «персистентность», как применяют в настоящем документе, описывает период действия нейротоксичного компонента. В основном, он представляет собой период до тех пор, пока активное средство проявляет хотя бы половину своей активности по сравнению с его первоначальной активностью. Следовательно, термин «персистентность» можно использовать синонимично с термином «полупериод активности» или термином «полупериод метаболической стабильности», который определяет момент времени, когда только одна половина от исходной концентрации белка активна вследствие метаболических процессов, то есть время полужизни, пока белок не метаболизируется. Поскольку время полужизни белка коррелирует с продолжительностью терапевтического эффекта, термин «персистентность» также косвенно охватывает продолжительность воздействия или влияния, вызванного нейротоксичным компонентом, на клеточную функцию.

Специалисту известны различные анализы для определения персистентности. Согласно идее по настоящему изобретению персистентность можно определить в анализе подвижности мыши (Keller JE., 2006, Neuroscience. 139(2):629-37). Данный анализ позволяет определить корреляцию персистентности с двигательной активностью. Альтернативно, персистентность можно определить при анализе расщепления SNAP-25, который позволяет определить корреляцию протеолитической активности с персистентностью. Эффект увеличенной персистентности имеет место, если увеличение персистентности можно определить в одном из описанных выше анализов, где анализ расщепления SNAP-25 является предпочтительным.

Термин увеличенная персистентность и пролонгированная персистентность применяется в настоящем документе взаимозаменяемо.

Для определения влияния дополнительной цепи LC или фрагмента цепи LC на полипептид по изобретению в отношении персистентности полипептид по изобретению сравнивают с соответствующим полипептидом, не имеющим указанную добавленную (дополнительную) цепь LC. Он может представлять собой, например, полипептид по изобретению, у которого удалили дополнительную цепь LC. Любой из анализов персистентности, известных специалисту в данной области, можно использовать для определения персистентности. В одном из вариантов осуществления персистентность определяют, как описано в настоящем документе выше или в примерах, иллюстрирующих изобретение.

В другом варианте осуществления предусмотрена пролонгация персистентности короткодействующих серотипов нейротоксина. Например, персистентность серотипа E можно пролонгировать, добавляя легкие цепи серотипов с более длительной активностью, например серотипа A, тем самым получая нейротоксин с похожей персистентностью, как и ботулотоксин A дикого типа. Поскольку большинство антигенных эпитопов нейротоксина расположены на субъединице тяжелой цепи, данную модификацию можно использовать для того, чтобы применять нейротоксин у пациентов, у которых развился иммунный ответ в отношении определенного серотипа. Таким образом, комбинируя благоприятные эффекты получения другого серотипа, сохраняют предшествующий период активности

Как указано выше, термины «ΗC-домен» и «LC-домен» относятся, соответственно, к тяжелой цепи и легкой цепи нейротоксичного компонента нейротоксина, либо дикого типа, либо рекомбинантного происхождения. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления домены HC и/или LC происходят из различных серотипов и/или различных токсинов. Данным определением также охватываются фрагменты легкая цепь и тяжелая цепь. HC- и LC-домен можно дополнительно далее разделить на субдомены.

Термин «дополнительный домен LC или его фрагмент», как применяют в настоящем документе, относится к одному или нескольким, например двум доменам LC. Согласно идее по настоящему изобретению полипептид по изобретению может содержать также дополнительные добавочные домены LC или его фрагменты. Например, полипептид по изобретению может содержать домен HC нейротоксичного компонента клостридиального токсина и первый домен LC или его фрагмент, и второй домен LC или его фрагмент и третий домен LC или его фрагмент.

В одном из вариантов осуществления указанный фрагмент указанного первого и указанного дополнительного домена LC проявляет протеолитическую активность LC дикого типа.

Для получения эффекта увеличенной персистентности никакой мотив на основе лейцина или тирозина (как описано в US 2003/0219462, EP1849801 и WO 02/08268) не является необходимым или не является желательным. Следовательно, в одном из вариантов осуществления дополнительная легкая цепь не содержит никакого из указанных мотивов.

В одном из вариантов осуществления модифицированный нейротоксин не содержит мотив на основе лейцина, содержащий семь аминокислот, где первые пять аминокислот, начинающиеся на амино-конце мотива на основе лейцина, образуют «квинтет аминокислот» и следующие две аминокислоты образуют «дублет аминокислот», и где квинтет аминокислот содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глутамата и аспартата; и дуплет аминокислот содержит, по меньшей мере, аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из изолейцина и лейцина.

В другом варианте осуществления модифицированный нейротоксин не содержит никакой из последовательностей FEFYKLL, EEKRAIL, EEKMAIL, SERDVLL, VDTQVLL, AEVQALL, SDKQNLL, SDRQNLI, ADTQVLM, SDKQTLL, SQIKRLL, ADTQALL и NEQSPLL.

Термин «одинаковый», используемый в настоящем документе, относится к домену LC с идентичной аминокислотной последовательностью, то есть со 100% идентичностью аминокислотных последовательностей. Следовательно, например, второй домен LC, как применяют в настоящем документе, который «одинаков», обозначает, что он идентичен по аминокислотной последовательности указанному домену LC. С другой стороны, второй домен LC, который «отличается», относится ко второму домену LC, который обладает идентичностью последовательности менее чем 100%, то есть, например, 99,95% или менее по сравнению с первым доменом LC. «Отличающийся домен LC» представляет собой домен LC другого серотипа или домен LC с аминокислотной последовательностью, которая отличается от первого домена LC, например, заменой аминокислоты. Другой пример отличающегося домена LC представляет собой домен LC с укороченным N- или C-концом или с внутренней делецией. Еще одним примером отличающегося домена LC является домен LC с химической модификацией. «Отличающийся домен LC» может, следовательно, происходить из того же самого или другого серотипа, соответственно, по сравнению с первым доменом LC. Указанное выше также применимо к «третьему» или любому другому дополнительному домену LC.

В одном из вариантов осуществления серотипы всех доменов HC и LC происходят из ботулотоксина типа A_, в другом варианте осуществления вторая легкая цепь происходит из C1. Тем не менее специалисту в данной области очевидно, что все возможные комбинации серотипов A, B, C1, D, E, F и G охвачены данной заявкой, и специалист способен выбрать подходящую комбинацию на основе опубликованной персистентности различных серотипов. Ни комбинация серотипов, ни количество используемых тяжелых и легких цепей не ограничены данным изобретением. Следовательно, в другом варианте осуществления охвачены более длинные слитые белки, то есть слитый белок с более чем тремя субъединицами, например белок-конкатемер, содержащий три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять доменов LC.

Домены HC и LC, например, нейротоксина A C. botulinum содержат различные субдомены. Домен HC, например, содержит три субдомена, то есть аминоконцевой субдомен транслокации HC_N размером 50 кДа с последующим HC_CN-субдоменом размером 25 кДа и HC_CC-субдоменом размером 25 кДа, расположенным на карбоксильном конце. Взятые вместе, HC_N-, HC_CN- и HC_CC-домены обозначаются как HC-домен.

Соответствующие диапазоны аминокислот соответствующих доменов показаны для различных серотипов BoNT/A и их вариаций в таблице 1.

Термин «фрагмент домена LC», как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту домена LC с биологической активностью. Как применяют в настоящем документе, фрагмент с биологической активностью представляет собой фрагмент, который (по-прежнему) проявляет протеолитическую активность, предпочтительно, LC дикого типа, то есть, который способен расщеплять полипептид SNARE-комплекса, такой как, например, синтаксин, SNAP-25 или синаптобревин. Таким образом, биологическую активность можно проверить, например, анализом протеазы SNAP-25, LD₅₀-анализом, HDA-анализом, и тому подобным. Следовательно, любой LC-домен, который проявляет протеолитическую активность более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и вплоть до 100% протеолитической активности соответствующего LC-домена дикого типа в анализе с SNAP-25 считают «биологически активным» или «проявляющим биологическую активность» в объеме данного изобретения.

Подходящий анализ с SNAP-25 представляет собой, например, «анализ по высвобождению флуоресцентной метки GFP-SNAP25» (WO/2006/020748) или «усовершенствованный эндопептидазный иммуноанализ SNAP25»(Jones et al., Journal of Immunological Methods, Volume 329, Issues 1-2, 1 January 2008, Pages 92-101).

«Фрагмент домена HC», как применяют в настоящем документе, относится к фрагменту домена HC с биологической активностью. Точнее говоря, он представляет собой фрагмент, который по-прежнему способен связываться с природным рецептором домена HC, из которого он происходит. Кроме того, указанный фрагмент также является фрагментом, способным перемещать присоединенный к нему домен LC.

Фрагменты, следовательно, представляют собой, например, полипептиды, из которых 1, 2, 3, 5 или вплоть до 10, 50 или 100 аминокислот были удалены. При этом делеция может представлять собой укорочение с C- или N-конца или внутреннюю делецию.

В некоторых вариантах осуществления домены HC и/или LC дополнительно модифицированы, например, мутацией, делецией, инсерцией, добавлением или заменой аминокислоты. В дополнительных вариантах осуществления HC и/или LC дополнительно химически модифицированы, например, фосфорилированием, пегилированием, гликозилированием, фосфорилированием, сульфатированием, метилированием, ацетилированием, липидизацией (миристиолированием, пальмитоилированием, изопренилированием, связыванием и глюкозилфосфатидилинозитолом), гидроксилированием, амидированием или любой другой подходящей модификацией. Дополнительно связывающий гангиозид домен и/или связывающий домен нейротоксина в одном из вариантов осуществления модифицирован так, чтобы увеличить связывающую способность по сравнению с нейротоксином дикого типа, из которого происходит домен HC. В некоторых вариантах осуществления HC и/или LC содержит маркерную последовательность, то есть другую аминокислотную последовательность, которая позволяет упростить процедуру очистки.

Термин «способ очистки» охватывает все известные в данной области способы для очистки белка. Примерами для способов очистки нейротоксинов являются публикации DasGupta & Sathyamoorthy и WO2000074703, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Для дополнительных методических принципов способов очистки, применимых для очистки рекомбинантных нейротоксичных компонентов, представлена ссылка на документы Walker et al., 2002; Harris et al., 1989 и Scopes et al., 1994, которые процитированы ниже в разделе «Литература».

Термин «получение полипептида» охватывает все стадии, необходимые для получения полипептида, то есть, например, конструирование кодирующей нуклеиновой кислоты, встраивание указанной нуклеиновой кислоты в вектор, экспрессия полипептида in vitro и/или в клетке-хозяине, модификации полипептида in vivo и/или in vivo, очистка полипептида и/или получение композиции, содержащей указанный полипептид. Тем самым термин «экспрессия» или «экспрессия гена» определяют в настоящем документе как процесс, посредством которого наследуемая информация в гене, таком как последовательность ДНК, преобразуется в функциональный продукт гена, такой как белок или РНК.

В одном из вариантов осуществления предусматривают, что встраивание в полипептид по настоящему изобретению дополнительных сайтов связывания с рецептором обеспечивает получение нейротоксина, который обладает, помимо увеличенной персистентности, дополнительными характеристиками, создавая возможность для новых заявок, например, нейротоксин со специфичными для клеток сайтами связывания, подходящими, например, для лечения аллергий или боли (WO 2007/13839). Альтернативно, природный сайт связывания, расположенный в домене HC, можно изменить для того, чтобы нацелить полипептид по настоящему изобретению на специфичные типы клеток. В более конкретном примере домен HC по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления вторая легкая цепь соединена с N-концом первой легкой цепи. Такое соединение может осуществлять либо напрямую посредством связи или косвенно через линкер. В основном связывание между доменами можно осуществить посредством любой структуры, подходящей для удерживания различных субъединиц вместе, включая, помимо других, непосредственное связывание или связывание через пептидный линкер, через химический линкер или через дисульфидную связь. Указанная связь может представлять собой расщепляемую или нерасщепляемую связь. Расщепляемая связь представляет собой связь, которая расщепляется, например, специфичной для последовательности протеазой. Нерасщепляемая связь представляет собой связь, которая стабильна после клеточного захвата, другими словами, несколько доменов LC, соединенных нерасщепляемой связью, остаются связанными друг с другом даже после перемещения в цитоплазму.

Термины «связь», «связи» или «связывание» описывают любую возможность соединения различных полипептидных цепей друг с другом. В одном осуществлении указанная связь представляет собой химическую связь, например ковалентную связь (например дисульфидную связь), полярную ковалентную связь, ионную связь, координационную ковалентную связь, изогнутые связи, связи 3c-2e и 3c-4e, одно- и трехэлектронные связи, ароматическую связь, металлическую связь, межмолекулярное связывание, связывание постоянного диполя с постоянным диполем, водородную связь, связывание мгновенного диполя с индуцированным диполем (Ван-дер-Ваальса) и/или катион-пи-взаимодействие. Как указано выше, данное определение охватывает непосредственные связи, а также непрямые связи через химические линкеры.

«Химический линкер» определяют в настоящем документе как молекулярную структуру, получаемую химическими способами, которая подходит для соединения различных субъединиц полипептида по настоящему изобретению. Такое химическое связывание можно осуществить, например, при помощи бифункциональных агентов, известных в данной области. В другом варианте осуществления химическое связывание осуществляют при помощи дисульфидных связей, похожих на соединение между тяжелой и легкой цепью в диком типе. В очередном варианте осуществления введение дисульфидной связи осуществляют встраиванием содержащей цистеин последовательности тяжелой цепи (например, аминокислоты 449-459 BoNT/A) в легкую цепь. Дополнительные неограничивающие примеры для таких химических линкеров представляют собой карбоновые кислоты, этоксилированный многоатомный спирт, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и так далее.

«Пептидный линкер» определяют в настоящем документе как пептид длиной 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или вплоть до 100 аминокислот, который соединяет различные субъединицы полипептида по настоящему изобретению друг с другом. В одном из вариантов осуществления указанный пептидный линкер содержит, по меньшей мере, два цистеина. В другом варианте осуществления линкер содержит один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или вплоть до 20 гистидинов, в другом варианте осуществления линкер представляет собой участок расщепления протеазой. В дополнительном варианте осуществления линкер позволяет получить полный слитый белок рекомбинантными способами.

В другом варианте осуществления участок расщепления протеазой можно встроить между первой и второй легкой цепью, например, участок, которой можно разрезать протеазой E.coli, как они перечислены, например, в DE102005002978, но не ограничивая данные протеазы. В другом варианте осуществления участок расщепления протеазой представляет собой любой из участков распознавания для любой сериновой протеазы (например, химотрипсин, трипсин, эластаза, субтилизин), треониновой протеазы, цистеиновой протеазы (например, папаин, катепсин, каспаза, кальпаин), протеазы аспарагиновой кислоты (например, ВИЧ-протеаза, химозин, ренин, катепсин, пепсин, плазмепсин), металлопротеазы или протеазы глутаминовой кислоты или любого их сочетания.

Специалист в данной области поймет, что данное изобретение подходит не только для применения тяжелой и легкой цепи(ей) дикого типа, но что данным изобретением также охвачены рекомбинантные пептиды и/или гибридные нейротоксичные компоненты. Следовательно, в одном из вариантов осуществления предусмотрен слитый белок из