Способ повышения регенераторной активности эпителия кишечника крыс после лучевой нагрузки

Способ повышения регенераторной активности эпителия кишечника крыс после лучевой нагрузки

Реферат

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к разработке способов лечения лучевой болезни, и может быть использовано для восстановления эпителия тощей кишки после воздействия лучевой нагрузки.

Природа радиационного поражения организма животного и человека интенсивно изучается уже несколько десятилетий. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) относится к критическим системам клеточного обновления при облучении. Под действием ионизирующего излучения (ИИ) (лучевой нагрузки) в слизистой оболочке ЖКТ происходят резкие нарушения динамического равновесия между отдельными пулами, приводящие к тяжелым функциональным расстройствам в самой системе. В зависимости от выраженности расстройств это может иметь существенное значение для жизнедеятельности всего организма. Восполнение клеточной убыли составляет первостепенную задачу проводимой функциональной терапии, способствующей ослаблению первичных нарушений, угрожающих жизни. Первичным нарушением в тонком кишечнике является клеточное опустошение ворсинок и крипт.

Восстановление регенерации криптального эпителия после острого лучевого поражения можно свести к пролиферации клеток, сохранивших жизнеспособность, благодаря чему восполняется убыль популяции клеток, а следовательно, восстанавливается их функциональная полноценность (О.И. Василенко. Радиационная экология [Текст] / Василенко О.И. М.: Медицина, 2004. - 88 с.).

Следующим направлением в патогенетической терапии лучевых поражений эпителия кишечника является использование метаболических средств (Г.Л. Вышковский. Регистр лекарственных средств России (Текст) / Г.Л. Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С.195).

Препарат - бутилированный гидрокситолуол может использоваться при лучевых поражениях слизистой оболочки кишечника, так как оказывает выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, противовоспалительное, регенерирующее действие.

Недостатками применения этих препаратов (метаболических средств и, в частности, бутилированного гидрокситолуола) являются такие побочные эффекты, как аллергические реакции, уретрит, простатит.

Восстановление регенерации эпителия тощей кишки обеспечивается применением препаратов, повышающих регенераторный потенциал эпителиоцитов крипт. Типичным представителем препаратов, оказывающих стимулирующее действие на процессы регенерации, является деринат. Деринат представляет собой натриевую соль ДНК, полученную из молок осетровых рыб. Данный препарат применяют не позднее 24 ч после облучения. Его вводят однократно внутримышечно или подкожно в объеме 15 мл (75 г активного вещества) (Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита [Текст]: учеб. пособие для студентов мед. вузов / С.А. Куценко, Н.В. Бутомо, А.Н. Гребенюк. - СПб.: Фолиант, 2004. - 527 с.).

Однако применение препаратов данной группы сопряжено с побочными эффектами и противопоказаниями. Так, после инъекций водного раствора дерината через 1,5-3 ч возникает выраженная гипогликемия (Г.Л. Вышковский. Регистр лекарственных средств России (Текст) / Г.Л. Вышковский. - М.: РЛС, 2005. - С.303-304).

Наиболее близким решением к заявляемому является способ восстановления эпителия тощей кишки лабораторных животных после воздействия ионизирующего излучения, который осуществляют через 25-30 мин после облучения путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 6·10⁶ клеток/кг (RU, патент №2415476, МПК G09B 23/28, А61К 35/50, А61Р 43/00, опубл. 27.03.2011 г.) - прототип.

Данное изобретение позволяет расширить арсенал средств, способных обеспечивать регенераторный потенциал тканей, а именно антиапоптогенное действие, увеличение скорости клеточного обновления криптального эпителия тощей кишки, угнетенное воздействием ионизирующего излучения, при отсутствии осложнений, однако существуют теоретические предпосылки считать, что использование сочетанной трансплантации ММСК и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могло бы оказывать более выраженное действие на активацию регенерации миелоидной ткани по сравнению с введением только ММСК.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, способных обеспечивать регенераторный потенциал тканей.

Технический результат, который будет достигнут от использования изобретения, заключается в повышении активации регенерации эпителия кишечника.

Технический результат достигается тем, что в способе восстановления регенерации эпителия кишечника лабораторных животных после лучевой нагрузки путем внутривенной трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток в количестве 6 млн клеток/кг дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) в количестве 300 тыс. клеток/кг, трансплантацию клеток осуществляют через 60 мин после лучевой нагрузки.

Сущность изобретения заключается в применении впервые для восстановления регенераторного потенциала эпителия кишечника сочетанной трансплантации стволовых клеток: ММСК и ГСК, выделенных, соответственно, из плаценты и пуповинной крови.

Известно, что ММСК, вырабатывая хемоаттрактант для ГСК (SDF-1), регулируют хоуминг ГСК, усиливая миграцию последних в места наибольшего повреждения клеток тканей. ММСК продуцируют весь спектр противовоспалительных цитокинов (IL-4, 10, TGF-β) и способны оказывать цитопротективное действие, индуцируя выработку белков теплового шока (HSP70) в рядом расположенных клетках, а также вырабатывая цитокин HIF-1α, могут угнетать апоптоз. Указанный цитокиновый профиль может приводить к изменению клеточной популяции, к снижению степени выраженности воспалительной реакции и уменьшению зоны повреждения. ММСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и выполнять функцию замещенных леток. При внутривенной трансплантации аллогенных ММСК в количестве 6 млн кл/кг через 60 минут после облучения не возникает реакции отторжения трансплантата, а также не возникает реакции «трансплантат против хозяина» за счет иммуносупрессивных свойств ММСК. Именно эти свойства ММСК дают возможность их использовать для восстановления регенерации эпителиоцитов кишечника. Эксперементально доказана возможность слияния ГСК в количестве 300 тыс. клеток/кг со стволовыми клетками кишечника, которые затем дифференцируются в зрелые энтероциты. Данный механизм способствует активации регенерации эпителия кишечника.

Из анализа научно-технической и патентной информации, использования сочетанной трансплантации ММСК и ГСК в заявляемых количественных пределах, выделенных из плаценты, позволяющей после воздействия ионизирующего излучения повысить митотическую активность клеток, что приводит к значительному увеличению содержания криптального эпителия, а следовательно, к восстановлению регенерации эпителия кишечника, нами не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Общая характеристика лабораторных животных, использованных в исследованиях

Эксперименты выполнены на 42 белых лабораторных крысах-самцах возраста 6-8 месяцев, массой 200-220 г. Эксперименты по получению ММСК и ГСК выполнены на 9 лабораторных животных крысах-самках возраста 3-4 месяца, массой 150-170 г, срок гестации 18 дней. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария, предусмотренных «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г. и Приказом МЗ СССР №1179 от 10.10.1983 «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения».

Количество экспериментальных животных и распределение их по сериям экспериментов представлены в таблице 1.

Изучалось воздействие ионизирующего излучения дозой 3,0 Гр на лабораторных животных зрелого возраста, были выделены опытная и контрольная группы (без введения ММСК и ГСК). Животным опытной группы внутривенно вводилась суспензия ММСК и ГСК соответственно в дозе 6 млн кл/кг и 300 тыс. кл/кг в 0,5 мл раствора 0,9% NaCl. Животным контрольной группы внутривенно вводилось 0,5 мл раствора 0,9% NaCl. Также были выделены интактные лабораторные животные (не подвергшиеся облучению), которым внутривенно вводилось 0,5 мл раствора 0,9% NaCl. Внутривенные введения осуществлялись через 60 минут после облучения однократно в указанных выше дозах. Забой животных осуществлялся на 1- и 7-е сутки после облучения (таблица 1).

Таблица 1
Распределение животных по сериям экспериментов после воздействия ионизирующего излучения дозой 3,0 Гр
	Лабораторные животные
Время проведения аутопсии органов	Прототип	Время проведения аутопсии органов
Заявляемый способ
24 часа	7 сутки	24 часа	7 сутки
ИИ, дозой 3,0 Гр	Опытная группа	Внутривенно ММСК 6 млн кл./кг и ГСК 300 тыс. кл/кг в 0,5 мл 0,9% NaCl					7 шт.
7 шт.	7 шт.	Внутривенно ММСК 6 млн. кл/кг в 0,5 мл 0,9% NaCl	7 шт.
Контрольная группа
Внутривенно 0,5 мл 0,9% NaCl	7 шт.	7 шт.	Внутривенно 0,5 мл 0,9% NaCl	7 шт.	7 шт.
Без воздействия ИИ	Интактные
Внутривенно 0,5 мл 0,9% NaCl	7 шт.	7 шт.	Внутривенно 0,5 мл 0,9% NaCl	7 шт.	7 шт.

Методы оценки регенераторных процессов в слизистой оболочке тощей кишки

Для изучения обзорной гистологической картины и морфометрического анализа во всех сериях экспериментов для исследования производилась аутопсия тощей кишки.

Операция производилась под эфирным наркозом. По средней линии передней брюшной стенки производился разрез длиной 3 см, извлекались петли тонкой кишки. Резекции подвергалась верхняя треть тощей кишки.

Учитывая наличие суточных ритмов, животные забивались путем декапитации в одно и то же время суток (9-10 часов утра). Операции проводились в первой половине дня.

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине. Заливку проводили в парафин и готовили срезы с соблюдением строгой ориентации ворсин и крипт толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.

- Оценивали митотическую активность кишечного эпителия с помощью определения митотического индекса (МИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты с четырьмя стадиями митоза встречаемых на 3000-3500 клеток, полученный результат выражали в процентах.

М И = К о л и ч е с т в о   митотически делящихся эпителиоцитов 3000 − 3500  подсчитанных эпителиоцитов крипт * 100 %

- Оценивали уровень запрограммированной гибели эпителиоцитов с помощью определения апоптотического индекса (АИ) на гистологических срезах продольной ориентации. Подсчитывали эпителиоциты с морфологически выявляемой картиной апоптоза, встречаемые на 3000 клеток, полученный результат выражали в процентах.

А И = К о л и ч е с т в о   эпителиоцитов в состоянии  апоптоза 3000  подсчитанных эпителиоцитов крипт * 100 %

- Среднюю клеточность в одной крипте определяли, как отношение общего числа подсчитанных криптальных клеток к количеству анализированных крипт, выраженное в процентах (Труфакин В.А. Методы оценки пролиферации и дифференцировки кишечного эпителия. Методические рекомендации, Новосибирск, 1990 г.). Гистологические препараты тощей кишки анализировались с помощью микроскопа Micros МС - 50 (Австрия) при увеличении 100*15.

Морфологическая верификация и количественная оценка апоптоза осуществлялась при флуоресцентной микроскопии с использованием двух флуорохромов: акридин оранжевым (производство Финляндия) и Annexin V - FITC fluorescence microscopy (производство США).

Получение культуры ММСК

Производилось выделение плаценты (срок гестации 18 дней), образец ткани массой 1 г трижды промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (PBS) при рН 7.2, без ионов Са²⁺ и Mg²⁺ _, дополненным антибиотиками (пенициллин 50 ед/мл, стрептомицин 50 мкг/мл), после чего осуществлялось механическое измельчение ткани и энзиматическая обработка (0,25% трипсин - ЭДТА 15 мин при 37°C). Полученная суспензия клеток была дважды профильтрована через 100 мкм нейлоновую мембрану для очистки от крупных неизмельченных кусочков ткани. Суспензию разбавляли средой α-МЕМ, содержащей антибиотики, затем клетки осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1000 g. Полученный клеточный осадок суспендировали в среде α-MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Sigma, США) и однократным раствором антибиотиков (Chemicon). Суспензию клеток высевали в концентрации 150000-160000 кл/см² на чашки Петри 60 мм (Nunc, Дания).

1.1. Условия культивирования ММСК

Культивирование производилось при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂.

1.2. Подсчет клеток

Подсчет клеток производили в гемоцитометре. Расчет количества клеток в 1 мл суспензии производили по формуле Х=а*10000, где Х - число клеток в 1 мл суспензии; а - сумма клеток в малых квадратах.

1.3. Субкультивирование ММСК

Субкультивирование клеток осуществляли по достижении ими 80% монослоя. Клетки промывали смесью 0,25% трипсин - ЭДТА в соотношении 1:1, в которой клетки инкубировали около 5 мин при 37°C. Трипсин инактивировали добавлением ростовой среды с СЭК (10%) и центрифугировали суспензию при 200 g в течение 5 мин. Удалив супернатант, клетки суспендировали, производили подсчет и высевали в нужной концентрации (10000 кл/см²).

1.4. Характеристику культуры проводили с использованием набора первичных (Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit) и вторичных антител (secondary antibody Cy3 conjugated).

Выделение ГСК

Для выделения ГСК использовали набор Mouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set-DM (StemCell Technologies, Канада).

Методы статистической обработки полученных результатов

Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий между данными прототипа и заявки оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0,05.

Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки лабораторных животных на 1 сутки после воздействия ионизирующего излучения дозой 3,0 Гр, М±m, n=7 показаны в Таблице 2.

Таблица 2
			Заявка (введение ММСК и ГСК)	Интактные животные
Показатель	Контрольная группа	Прототип (ММСК)
Митотический индекс, %			7,33±1,12°*
5,73±0,86°	4,82±1,16°	8,88±0,74
Апоптотический индекс, %		13,85±1,32°	8,01±0,23°*
12,77±1,71°	4,68±0,41
Средняя клеточность 1 крипты (СКК)
55,82±3,74°	49,20±4,80°	64,24±3,15°*	73,22±4,26
Примечание: *отличие значения в опытной группе в заявке от показателей в опытной группе в прототипе, достоверно с р<0,05,° отличие значения от показателей интактных животных, достоверно с р<0,05.

Следует отметить, что на 1-е сутки после введения ММСК на фоне воздействия ИИ у лабораторных животных показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки существенно не отличаются от показателей в контрольной группе. В то же время после сочетанной трансплантации ММСК и ГСК при подсчете числа митозов в эпителиоцитах крипт выявлено, что данный показатель в заявке на 52,1% выше, чем в прототипе. При подсчете числа клеток в состоянии апоптоза установлено, что изучаемый показатель в заявке на 42,2% ниже, чем в прототипе. При подсчете средней клеточности 1 крипты установлено, что изучаемый показатель был на 30,1% выше, чем в прототипе.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что сочетанная трансплантация ММСК и ГСК на 1-е сутки после воздействия ионизирующего излучения через увеличение числа митозов и через ингибирование апоптоза приводит к увеличению содержания криптального эпителия в существенно большей степени, чем введение только ММСК.

Показатели регенераторной активности эпителия тощей кишки лабораторных животных на 7-е сутки после воздействия ионизирующего излучения дозой 3,0 Гр, М±m, n=7 приведены в Таблице 3.

Таблица 3
			Заявка (введение ММСК и ГСК)	Интактные животные
Показатель	Контрольная группа	Прототип (ММСК)
		Опытная группа
Опытная группа
Митотический индекс, %		12,08±0,92*
8,92±0,92	16,23±3,21***	8,88±0,74
Апоптотический индекс, %
6,60±0,63°	4,75±0,72*	4,83±0,77*	4,68±0,41
Средняя клеточность 1 крипты (СКК)
72,82±4,02	88,15±4,42*	106,73±5,68***	73,22±4,26
Примечание: * отличие от группы контрольных животных, подвергшихся воздействию ИИ дозой 3,0 Гр, достоверно с р<0,05; ** отличие значения в опытной группе в заявке от показателей в опытной группе в прототипе, достоверно с р<0,05;° отличие значения от показателей интактных животных, достоверно с р<0,05.

Как видно из таблицы 3, у лабораторных животных, которым была произведена внутривенная трансплантация ММСК на 7-е сутки после воздействия ИИ при подсчете числа митозов в эпителиоцитах крипт установлено, что данный показатель был на 34,4% больше, чем в прототипе, и не отличался достоверно от интактных животных. При подсчете клеток в состоянии апоптоза установлено, что содержание данных клеток существенно не отличалось от аналогичного показателя как в прототипе, так и от значения интактных животных. При подсчете средней клеточности 1 крипты обнаружено, что изучаемый показатель в заявке был на 21,1% больше, по сравнению со значением в прототипе и существенно не отличался от значения интактных животных.

Таким образом, к 7-м суткам после воздействия ионизирующего излучения происходит естественное восстановление количества митозов в эпителиоцитах крипт и содержание криптального эпителия (показатель СКК). В то же время полученные данные свидетельствуют о том, что сочетанная трансплантация ММСК и ГСК на 7-е сутки после воздействия ионизирующего излучения через увеличение числа митозов приводит к увеличению содержания криптального эпителия в существенно большей степени, чем введение только ММСК.

Способ повышения регенераторной активности эпителия кишечника крыс после лучевой нагрузки в дозе 3,0 Гр, включающий внутривенное введение аллогенных мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток, выделенных из плаценты, в количестве 6 млн клеток/кг, отличающийся тем, что дополнительно вводят гемопоэтические стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови, в количестве 300 тыс клеток/кг, причем такую трансплантацию клеток осуществляют через 60 мин после лучевой нагрузки.