Производные fgf21 со связующим альбумина а-в-с-d-e- и их применение

Производные fgf21 со связующим альбумина а-в-с-d-e- и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к фактору роста фибробластов 21 (FGF21), более конкретно к производным соединений FGF21, имеющим ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-. Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, а также к фармацевтическому применению этих производных и аналогов FGF21, в частности, для лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Производные по настоящему изобретению обладают пролонгированным действием, например способны поддерживать низкий уровень глюкозы в течение более длительного периода времени, способны к увеличению времени полувыведения in vivo FGF21 и/или приводят в результате к более низкому клиренсу FGF21. Производные по изобретению предпочтительно, кроме того, обладают улучшенной устойчивостью к окислению.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Факторы роста фибробластов представляют собой полипептиды, экспрессирующиеся при развитии и в тканях взрослого организма. Они вовлечены в несколько физиологических механизмов, включая, например, регуляцию метаболизма и клеточную дифференциацию. Существует целое семейство более чем двадцати факторов роста фибробластов (семейство FGF). Три члена этого семейства FGF, включающие FGF19, FGF21 и FGF23, образуют подсемейство, функционирующее как эндокринные факторы, вовлеченные в регуляцию метаболизма.

Фактор роста фибробластов 21 или FGF-21, в данной заявке для краткости FGF21, экспрессируется преимущественно в печени, и показано, что он проявляет гормоноподобные метаболические эффекты.

Например, продемонстрировано, что FGF21 активирует захват глюкозы в адипоцитах мыши для защиты мыши от рациона, индуцирующего ожирение, при гиперэкспрессии у трансгенных мышей, и снижает уровни глюкозы и триглицеридов в крови при введении грызунам с диабетом (Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. (2005), 115: 1627-1635).

Понижающий эффект FGF21 на глюкозу и триглицериды крови также показан у обезьян с диабетом. FGF21 был также способен значительно снижать ЛПНП и повышать ЛПВП у обезьян с диабетом (Kharitonenkov et al., Endocrinology (2007), 148 (2): 774-81).

У мышей с ожирением, индуцированным диетой, и у мышей было, кроме того, показано, что FGF21 снижает массу тела, преимущественно за счет увеличения расхода энергии и уменьшения ожирения (Coskun et al., Endocrinology (2008), 149 (12): 6018-6027).

На основании этих результатов FGF21 предложен в качестве фармакологического агента с потенциалом лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома. Метаболический синдром включает такие аспекты, как устойчивость к инсулину, дислипидемия, висцеральное ожирение и гипертензия, см., например, определение метаболического синдрома в Grundy et al., Circulation (2004), (109): 433-438.

FGF21 можно, кроме того, применять в качестве фармакологического агента с потенциалом лечения неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), см. Coskun et al. Endocrinology, 2008, цитируется выше, и Xu et al. Diabetes (2009, 58 (1): 250-9, опубликованную в электронном виде 07-ОКТ-2008 перед выходом в печать). НАЖБП определена в статье Erickson, J. Lipid Res. (2008), опубликованной в электронном виде 12-ДЕК-2008 перед выходом в печать.

Авторами Yie et al. Исследована роль N- и С-концов FGF21 при взаимодействии с рецептором и его активации, см. FEBS Letters, 583 (2009), 19-24.

В WO 2003/011213 A2 раскрыт способ лечения диабета типа 1 и 2 или ожирения путем применения соединений FGF21 по меньшей мере с 95% идентичностью аминокислотной последовательности предшественника FGF21.

В WO 2003/061712 А1 раскрыты мутеины FGF21 с улучшенными фармацевтическими свойствами, например, А145Е.

В WO 2005/091944 A2 раскрыты пегилированные производные FGF21, FGF21-K59C и FGF21-K122C.

В WO 2005/113606 A2 раскрыты различные слитые белки FGF21 с участком Fc иммуноглобулина IgG4 или сывороточного альбумина человека.

В WO 2006/028595 A2 раскрыты дополнительные мутеины FGF21 со сниженной способностью к O-гликозилированию при экспрессии в дрожжах, например, L118C-A134C-S167A.

В WO 2006/028714 А1 раскрыты дополнительные мутеины FGF21 со сниженной чувствительностью к протеолитическому расщеплению при экспрессии в дрожжах, например, L153I.

В WO 2006/065582 A2 раскрыты еще дополнительные мутеины FGF21 со сниженным деамидированием, например, des-HPIP-L118C-A134C-N121D.

В WO 2006/078463 A2 раскрыт способ лечения сердечно-сосудистого заболевания посредством применения нативного зрелого FGF21 или его указанных вариантов.

В WO 2008/121563 раскрыты полипептиды FGF21, модифицированные включением не кодируемых в природе аминокислот, а также их производные.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Кратко, данное изобретение определено в п.1 приведенной ниже формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к производным соединений FGF21, имеющим связующее альбумина, ковалентно присоединенное к соединению FGF21, где связующее альбумина имеет формулу A-B-C-D-E-, в которой компонент А представляет собой жирную кислоту или ее производное. Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, а также к применению производных и аналогов по изобретению в фармацевтических композициях, в частности, для лечения диабета, дислипидемии, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, метаболического синдрома и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Производные по настоящему изобретению обладают пролонгированным действием, например, способны поддерживать низкий уровень глюкозы в течение более длительного периода времени, способны к увеличению времени полувыведения in vivo FGF21 и/или приводят в результате к более низкому клиренсу FGF21. Пролонгированные производные FGF21 сохраняют удовлетворительную биологическую активность, и их можно вводить менее часто. Производные по изобретению предпочтительно, кроме того, обладают улучшенной устойчивостью к окислению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к производным соединения FGF21, имеющим ковалентно присоединенное связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, где

А- представляет собой элемент формулы I, II или III:

,

;

где n равно 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19, и * представляет собой точку присоединения к -В-;

-В- отсутствует, представляет собой связь или выбран из -В1-, -В2- или их комбинаций, где

-В1- представляет собой элемент формулы IV, V, VI или VII:

, ,

;

где * представляет собой точку присоединения к -В2- или -С-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В2-; и

-В2- представляет собой элемент формулы IIX, IX или XXVIII или комбинацию вплоть до четырех элементов формулы IIX, и/или формулы IX, и/или формулы XXVIII:

,

где b равно 0, 1 или 2, с равно 0, 1 или 2, при условии, что b равно 1 или 2, когда с равно 0, и b равно 0, когда с равно 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С-, -В1- или к другому -В2-, и # представляет собой точку присоединения к А-, -В1- или к другому -В2-;

,

где d равно 1 или 2, е равно 0, 1 или 2, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-; либо

где u равно 2, 3 или 4, * представляет собой точку присоединения к -С- или -В1-, и # представляет собой точку присоединения к А- или -В1-;

-С- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы Х или XI:

,

где р равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, q равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21, и # представляет собой точку присоединения к -В-; либо

,

где k равно 0, 1, 2, 3, 4, 5, 11 или 23, m равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -D-, -Е- или к соединению FGF21; и # представляет собой точку присоединения к -В-;

-D- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XII или XIII:

,

где r равно 2, 3, 4 или 5, s равно 1, 2, 3 или 4, t равно 1, 2, 3, 4, 5 или 6, * представляет собой точку присоединения к -Е- или к соединению FGF21 и # представляет собой точку присоединения к -С-;

-Е- отсутствует, представляет собой связь или представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIIIa, XXIV, XXIVa, XXV, XXVI или XXVII:

, ,

, ,

, ,

,

где * представляет собой точку присоединения к соединению FGF21 и # представляет собой точку присоединения к -D- или -С-;

или к их фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение также относится к новым аналогам FGF21, включающим (а) по меньшей мере одну из приведенных ниже модификаций по сравнению с SEQ ID NO:1: -1G, -1C, -1S, S6C, S6K, А26Е, Q27E, Q28R, А31Е, K56R, K59R, K69R, 871 С, D102T, K122R, 1152K, L166F, S167G, M168L, V169aT, P171L, S172E, Q173A, G174V, Y179F, A180E и/или S181K,R; независимо необязательно с N-концевым М (например, -1М); и/или (b) N-концевое удлинение по сравнению с SEQ ID NO:1 из аминокислотных остатков в количестве вплоть до 25, предпочтительно вплоть до 20 аминокислотных остатков, более предпочтительно вплоть до 15 аминокислотных остатков, даже более предпочтительно вплоть до 10 аминокислотных остатков или наиболее предпочтительно вплоть до 6 аминокислотных остатков, где по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% удлиняющих с N-конца аминокислотных остатков представляет собой G или S. SEQ ID NO:1 является последовательностью зрелого пептида дикого типа FGF21 человека, имеющего 181 аминокислотный остаток.

Наконец, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим терапевтически эффективное количество аналогов или производных по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель; а также к способам лечения пациентов, проявляющих диабет, дислипидемию, ожирение, сердечнососудистые заболевания, метаболический синдром и/или неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП), включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества аналога, производного или композиции по изобретению.

В первом аспекте производное по изобретению имеет связующее альбумина формулы A-B-C-D-E-, ковалентно присоединенное к тиольной группе соединения FGF21, то есть к остатку цистеина.

Во втором аспекте производное по изобретению имеет связующее альбумина формулы А-В-С-, ковалентно присоединенное к аминогруппе соединения FGF21, которая может представлять собой N-концевую аминогруппу и/или внутреннюю аминогруппу, такую как эпсилон-аминогруппа остатка лизина.

Производные по данному изобретению и аналоги по данному изобретению должны обладать биологическим эффектом, подобным эффекту FGF21, например, в отношении эффекта снижения глюкозы, улучшения при дислипидемии, ожирении, сердечно-сосудистых заболеваниях, метаболическом синдроме и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "соединение FGF21", как используют в данной заявке, относится как к нативному FGF21 человека, так и к его аналогам.

Последовательность нативного белка FGF21 человека доступна из базы данных UNIPROT с номером доступа Q9NSA1. 209-аминокислотный белок-предшественник включает сигнальный пептид (аминокислоты 1-28) и зрелый белок (аминокислоты 29-209). Зрелый белок включен в данную заявку как SEQ ID NO:1 (аминокислоты 1-181), а сигнальный пептид как SEQ ID NO:2 (аминокислоты 1-28).

Изоформа или аллельная форма нативного FGF21 человека, имеющая Pro вместо Leu в зрелом белке в положении 146 SEQ ID NO:1, в данной заявке среди прочего известна из US 2001012628 А1 (остаток №174 SEQ ID NO:2 в опубликованной заявке США).

Другая изоформа, имеющая более короткий сигнальный пептид, в котором Leu в положении 23 SEQ ID NO:2, отсутствующая в данной заявке, известна из WO 2003/011213 (см. SEQ ID NO: 2 публикации WO, имеющую сигнальный пептид из 27 аминокислотных остатков).

Таким образом, конкретными примерами нативного FGF21 человека являются: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:1, имеющая замену L146P, а также любая из этих последовательностей, которой предшествует 27- или 28-аминокислотный сигнальный пептид, на который ссылаются выше. Предпочтительными примерами FGF21 человека являются зрелые участки, а именно SEQ ID NO:1 и ее изоформа L146P.

Термин "аналог", на который ссылаются в данной заявке в контексте FGF21, то есть аналог FGF21, относится к полипептидам, которые выведены или имеют происхождение, либо могут быть выведены или могут иметь происхождение от нативного FGF21, от SEQ ID NO:1 в частности, в результате модификации его аминокислотной последовательности. Такая модификация, изменение или замена может включать замену, делецию и/или добавление одной или более чем одной аминокислоты. Например, аминокислоты могут быть добавлены и/или делегированы с С-конца, с N-конца или внутри в аминокислотной последовательности. Предпочтительно аминокислоты добавлены и/или делегированы с С- и/или N-конца, более предпочтительно с N-конца. Аминокислотные последовательности с делегированными аминокислотами с С- или N-конца могут также называться укороченными последовательностями, как известно в данной области техники. Подобным образом, аминокислоты, добавленные внутри последовательности, могут называться инсерциями. Термин "вариант" или "мутеин" здесь и далее используют в данной заявке вместо термина "аналог".

Одним из примеров аналога FGF21 является укороченная форма нативного зрелого FGF21, в котором четыре N-концевых аминокислотных остатка зрелого белка (HPIP) удалены, которая раскрыта, например, в WO 2006/065582. Указано, что данная укороченная форма стимулирует захват глюкозы в адипоцитах мышей 3T3-L1 на том же уровне, что и FGF21 дикого типа. Данный белок имеет аминокислотную последовательность из аминокислот 5-181 SEQ ID NO:1 в данной заявке.

Следующим примером аналога FGF21 является полипептид SEQ ID NO:1, который имеет N-концевой Met (также обозначенный "Met-FGF21" или как замена, -1М ((минус 1)М) SEQ ID NO:1). N-концевой Met присоединяется, когда соединение FGF21 экспрессируют в Е. coli, см., например, WO 2006/050247, Таблица 6.

Другими примерами аналогов FGF21 являются модифицированные последовательности FGF21 (часто называемые мутеинами), которые раскрыты, например, в WO 2003/061712, WO 2005/091944, WO 2006/028595, WO 2006/028714, WO 2006/065582 и WO 2008/121563 (см. раздел предшествующего уровня техники данной заявки).

Следующие примеры аналогов FGF21 раскрыты в экспериментальном разделе данной заявки, а также в прилагаемой формуле изобретения.

Термин "аминокислота" или "аминокислотный остаток", на который ссылаются в данной заявке в контексте модификаций FGF21, включает двадцать стандартных альфа-аминокислот, используемых клетками в биосинтезе белка и определяемых генетическим кодом, а именно аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин. Этот термин также включает нестандартные аминокислоты, такие как селеноцистеин и пирролизин, которые также кодируются генетическим кодом, но редки в белках. Другие нестандартные аминокислоты, обнаруженные в белках, могут образоваться в результате посттрансляционной модификации, например, γ-карбоксиглутамат и гидроксипролин. Дополнительными примерами нестандартных или неприродных аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, являются орнитин и фосфосерин. Другими дополнительными примерами нестандартных аминокислот являются синтетические аминокислоты, включающие аминокислоты, полученные путем химического синтеза, например, D-изомеры аминокислот, кодируемых генетическим кодом, такие как D-аланин, D-глутамин, D-гистидин и D-лейцин, Aib (α-аминоизомасляная кислота), Abu (α-аминомасляная кислота), Tle (трет-бутилглицин), β-аланин, 3-аминометилбензойная кислота, антраниловая кислота, дез-аминогистидин (сокращенно DesaminoHis, альтернативное название имидазопропионовая кислота, сокращенно Impr), бета-аналоги аминокислот, такие как 3-аланин, 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, Na-ацетил гистидин, α-фторметилгистидин, α-метилгистидин, α,α-диметилглутаминовая кислота, m-CF₃-фенилаланин (сокращенно m-CF₃-Phe), α,β-диаминопропионовая кислота (сокращенно Dap), 3-пиридилаланин, 2-пиридилаланин или 4-пиридилаланин, (1-аминоциклопропил)карбоновая кислота, (1-аминоциклобутил)карбоновая кислота, (1-аминоциклопентил)карбоновая кислота, (1-аминоциклогексил)карбоновая кислота, (1-аминоциклогептил)карбоновая кислота и (1-аминоциклооктил)карбоновая кислота.

Для целей настоящего изобретения два принятых кода стандартных аминокислот (однобуквенный и трехбуквенный) используют взаимозаменяемо, либо здесь и далее название аминокислоты пишут полностью. Эти термины, конечно, считают полностью эквивалентными (например, S=Ser=серин).

Термин "производное", как используют в данной заявке, относится к соединению FGF21, которое ковалентно модифицировано. Этот термин как таковой является не ограничивающим, скорее, описательным, поскольку он предназначен, чтобы отметить различие между изменениями, осуществленными в соединении, составляющем полипептид FGF21 как таковой ("аналогами"), и ковалентным связыванием боковой цепи с соединением FGF21, посредством чего соединение "дериватизировано". Если желательно, этот термин может быть заменен другими общими химическими терминами, например соединение.

Термин "связующее альбумина" как таковой также не предназначен для ограничения. Опять же, он, скорее, является описательным, поскольку отражает общее направление или цель присоединения цепи A-B-C-D-E- к соединению FGF21, а именно, что полученное в результате соединение (производное) способно к связыванию с сывороточным альбумином человека, которое обеспечивает или по меньшей мере вносит вклад в пролонгированный эффект, на который направлены производные по изобретению. Если желательно, этот термин может быть также заменен другими общими химическими терминами, например соединение.

Номенклатура: Аналоги и производные названы в данной заявке с использованием взаимозаменяемо полипептидной номенклатуры, номенклатуры органической химии и химических формул или их смеси, что считается лучше подходящим для упрощения понимания обсуждаемого технического предмета. Например, производное Примера 4 может быть названо S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(17-карбокси-гептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксо-пирролидин-3-ил] [Cys122]-Met-FGF21 (что означает, что [Cys122] Met-FGF21 модифицирован 1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(3)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-илом по тиольной группе в Cys в положении 122). Но это соединение может быть также определено как K122С Met-FGF21, дериватизированное при С122 нижеследующим соединением:

Номенклатура вариантов (Номенклатура аналогов): Варианты (или аналоги) FGF21 названы в данной заявке с использованием взаимозаменяемо полипептидной номенклатуры, номенклатуры органической химии, химических формул, аминокислотных последовательностей или их смеси, что считается лучше подходящим для упрощения понимания обсуждаемого технического предмета.

Например, замена в варианте может быть указана как: "Исходная аминокислота-положение-замененная аминокислота". Может быть использован трех- или однобуквенный код. Соответственно, обозначение "K122С" или "Lys122Cys" означает, что вариант включает замену лизина цистеином в положении аминокислоты варианта, соответствующем аминокислоте в положении 122 в FGF21 (SEQ ID NO:1), когда вариант и FGF21 выровнены, как дополнительно описано ниже ("выравнивание").

Множественные модификации, такие как замены, могут быть разделены запятыми (с пробелом после запятой), и, если желательно, окружены скобками, чтобы сделать понятным, что они принадлежат одному и тому же варианту. Аналог, который дериватизирован в Примере 7, может быть обозначен, например, "K56R, K59R, K69R, K122R Met-FGF21" или "(K56R, K59R, K69R, K122R) Met-FGF21", либо на него могут ссылаться как на "SEQ ID NO:1 с K56R, K59R, K69R и K122R и N-концевым М". См. Соединение Y Примера 2 для номенклатуры варианта с множественными модификациями в форме смеси замен и инсерций.

Альтернативные модификации, такие как альтернативные замены в данном положении, могут быть разделены запятыми, как, например, в обозначении "S181K,R", что означает, что Ser в положении 181 может быть заменен Lys или Arg.

Удлинение может быть описано путем ссылки на SEQ ID NO:1 путем добавления номеров положений (продолжающиеся положительные числа на С-конце и отрицательные числа на N-конце) или, проще, путем добавления аминокислот обсуждаемого удлинения, используя их правильную последовательность, к обсуждаемому соединению, которому в этом случае часто дают тривиальное название, такое как FGF21, опять же, чтобы упростить понимание релевантного технического пункта. В качестве примера, соединение (s) MGGGGG-FGF21 обозначает полипептид SEQ ID NO:1 (FGF21) с G в положении -1, G в положении -2, G в положении -3, G в положении -4, G в положении -5 и М в положении -6, относительно SEQ ID NO:1. Подобным образом, соединение (q) MS-FGF21 (или Met-Ser-FGF21) обозначает полипептид SEQ ID NO:1 (FGF21) с S в положении -1 и М в положении -2 относительно SEQ ID NO:1.

Инсерция в варианте может быть указана как: "номер положения аминокислоты перед инсерцией-индекс-вставленная аминокислота". Номер положения аминокислоты перед инсерцией относится к положению аминокислоты в FGF21 (SEQ ID NO:1) непосредственно перед гэпом, который создают, когда выравнивают FGF21, как дополнительно описано ниже ("выравнивание"). Для аминокислот может быть использован трех- или однобуквенный код. Индекс представляет собой строчную букву в алфавитном порядке, например, "а" для первого вставленного аминокислотного остатка, "b" для второго вставленного аминокислотного остатка, как приемлемо. Соответственно, все обозначения "V169aT" (или "Val169aThr") или просто "169аТ" (или "169aThr") означают, что вариант включает инсерцию треонина после валина в положении 169 в FGF21 (SEQ ID NO:1), когда вариант и FGF21 выравнивают, как дополнительно описано ниже ("выравнивание").

В случаях, где существует дополнительный дисульфидный мостик в соединении FGF, два Cys напечатаны по соседству друг с другом и соединены тире, как, например, в "L118C-A134C", где имеется дисульфидный мостик между Cys в положении 118 и Cys в положении 134.

Для целей настоящего изобретения выравнивание двух аминокислотных последовательностей можно осуществить, используя программу Needle из пакета программ EMBOSS (http://emboss.org). Предпочтительной версией является 2.8.0. В программе Needle использован алгоритм глобального выравнивания, описанный в Needleman, S.В. and Wunsch, С.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Используемой матрицей замен является BLOSUM62, штраф на открытие гэпа составляет 10, и штраф на удлинение гэпа составляет 0,5.

Степень или процент идентичности между последовательностью аналога FGF21 по настоящему изобретению ("последовательностью по изобретению"; например, SEQ ID NO:1 с K56R, K59R и K69R) и другой аминокислотной последовательностью ("чужеродной последовательностью"; например, последовательностью FGF21 SEQ ID NO:1) вычисляют как число точных совпадений при выравнивании двух последовательностей, деленное на длину "последовательности по изобретению" или длину "чужеродной последовательности", той, которая является более короткой. Результат выражают в проценте идентичности.

Точное совпадение происходит, когда "последовательность по изобретению" и "чужеродная последовательность" имеют идентичные аминокислотные остатки в одних и тех же положениях перекрывания (в приведенном ниже примере выравнивания это представлено "*"). Длина последовательности представляет собой число аминокислотных остатков в последовательности (например, длина SEQ ID NO:1 равна 181).

Данный пример представляет собой пример выравнивания "последовательности по изобретению" и "чужеродной последовательности", на которые ссылаются выше:

Соответственно, процент идентичности данного аналога FGF21 и FGF21 равен 178/181×100%=98,3%.

В качестве альтернативы, степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью программы "align", которая представляет собой выравнивание Needleman-Wunsch (то есть глобальное выравнивание). Последовательности выравнивают с помощью программы, используя матрицу оценки по умолчанию BLOSUM50. Штраф на первый остаток гэпа составляет 12, и для последующих остатков гэпа штрафы составляют 2. Алгоритм Needleman-Wunsch описан в Needleman, S.B. and Wunsch, CD. (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, а программа align описана Myers and W. Miller в Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17. "Align" составляет часть пакета программ FASTA версия v20u6 (см. W.R.Pearson and D.J.Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, и W.R.Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98).

Фармацевтическая композиция, содержащая производное соединения FGF21 или аналог FGF21 по изобретению, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Для инъекции носитель может представлять собой воду, если желательно, с добавлением других веществ, например, солевого раствора, такого как физиологический солевой раствор. Можно также использовать другие фармацевтически приемлемые агенты, такие как разбавители и подходящие буферы. Если желательно, можно также использовать дополнительные фармацевтически приемлемые агенты, такие как эмульгаторы, суспендирующие агенты, растворители, наполнители, объемообразующие агенты, адъюванты, консерванты, антиоксиданты, красители и/или корригенты. Производное соединения FGF21 или аналог FGF21 можно использовать в форме очищенного полипептида или его производного, либо включать в препарат, используя подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как известно в данной области техники. Фармацевтическую композицию можно вводить любым путем, как известно в данной области техники, например, инъецировать, например, внутривенно (i.v.) или подкожно (s.c.).

Производное соединения FGF21 или аналог FGF21 можно включать в фармацевтическую композицию в терапевтически или профилактически эффективном количестве. Количество зависит от терапевтической или профилактической цели, такой как обсуждаемое показание, состояние пациента, нуждающегося в лечении, желаемый путь введения и т.д. Практикующему специалисту в области медицины может потребоваться регулировать дозировку и модифицировать введение в зависимости от этих факторов, что обычно в данной области техники.

Конкретные формы осуществления

Ниже приведены конкретные формы осуществления производного по изобретению, в частности, производного первого аспекта изобретения, в котором связующее альбумина формулы A-B-C-D-E- ковалентно присоединено к тиольной группе соединения FGF21, то есть к остатку цистеина:

В одной форме осуществления А- представляет собой элемент формулы I:

, в которой n равно 14, 16 или 18.

В одной форме осуществления -В- включает -В1-, предпочтительно элемент формулы IV или V:

.

В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX или IX:

или ,

в котором более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 (гамма-Glu) или с равно 0 и b равно 1 (бета-Asp), либо в котором более предпочтительно d равно 1 и е равно 2 или d равно 2 и е равно 1.

В одной форме осуществления -В- включает -В2-, предпочтительно один или два элемента формулы IIX:

, в которой более предпочтительно с равно 0 и b равно 2 (гамма-Glu) или с равно 0 и b равно 1 (бета-Asp).

В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:

, в которой предпочтительно q равно 0, 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно q равно 1 или 2.

В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы X:

, в которой предпочтительно р равно 1 или 2, более предпочтительно р равно 1, даже более предпочтительно р равно 1 и q равно 1 или 2, или наиболее предпочтительно р равно 1 и q равно 2.

В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:

, в которой предпочтительно m равно 0, 1 или 2, более предпочтительно m равно 1 или 2.

В одной форме осуществления, -С- представляет собой элемент формулы XI:

, в которой предпочтительно k равно 1, 2, 3, 4, 5 или 11, более предпочтительно k равно 5.

В одной форме осуществления -С- представляет собой элемент формулы XI:

, в которой m равно 1 и k равно 4, 5 или 11, предпочтительно m равно 1 и k равно 5.

В одной форме осуществления -D- представляет собой элемент формулы XII: , в которой предпочтительно r равно 2 и/или в которой предпочтительно s равно 1 или 2, наиболее предпочтительно r равно 2 и s равно 2.

В одной форме осуществления -D- представляет собой элемент формулы XIII: , в которой предпочтительно t равно 1, 2 или 3, более предпочтительно t равно 2.

В одной форме осуществления -D- отсутствует.

В одной форме осуществления -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXIV, XXV, XXVI или XXVII:

, ,

, ,

или связь.

В одной форме осуществления -Е- представляет собой элемент формулы XXII, XXIII, XXV или XXVI:

, ,

,

или связь.

В одной форме осуществления -Е- представляет собой продукт взаимодействия соединения FGF21 с активированным сложным эфиром, например с N-гидроксисукцинимидом (формула XIV), но не ограничиваясь им, или с реакционным элементом формулы XV, XVI, XVII, IIXX, IXX, XX или XI:

, или его амид (йодоацетамид),

, ,

,

или ,

где # представляет собой точку присоединения к -С- или -D-.

В одной форме осуществления производное имеет одно или два связующих 5 альбумина формулы A-B-C-D-E-.

В одной форме осуществления производное имеет два связующих альбумина, предпочтительно, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:

, или

; где n равно 8, 9, 10, 11, 12 или 13.

В одной форме осуществления имеет два связующих альбумина, предпочтительно, где А- представляет собой элемент формулы I, II или III:

, или

; где n равно 10, 11, 12 или 13.

В одной форме осуществления производное имеет одно связующее альбумина, в котором предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:

, или

; где n равно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.

В одной форме осуществления производное имеет одно связующее альбумина, в котором предпочтительно А- представляет собой элемент формулы I, II или III:

, или

; где n равно 14, 15, 16, 17 или 18.

В одной форме осуществления A-B-C-D-Е- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(12):

(1):

(2):

(3):

(4):

(5):

(6):

(7):

(8):

(9):

(10):

(11):

(12):

(13):

(14): или фармацевтически приемлемых солей любых из соответствующих производных. Производные, включающие (2) и (3), могут быть, впрочем, образованы путем расщепления производного, включающего формулу (1).

В одной форме осуществления A-B-C-D-E- выбрано из приведенных ниже формул (1)-(12):

(1):

(2):

(3):

(4):

(5):

(6):

(7):

(8):

(9):

(10):

(11):

(12):

или фармацевтически приемлемой соли любого из соответствующих производных. Производные, включающие (2) и (3), могут быть, впрочем, образованы путем расщепления производного, включающего формулу (1).

В одной форме осуществления связующее альбумина присоединено к остатку цистеина в одном или более чем одном (например, в двух) положении, выбранном из положений -1 (например, в аналоге MetCys-FGF21), 6, 71 и 122 соединения FGF21, где нумерация положений соответствует SEQ ID NO:1.

В одной форме осуществления соединение по данному изобретению выбрано из производных Примеров 4, 5 и 6, предпочтительно приведенных ниже: S-122-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys122]-Met-FGF21; S-71-[1-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этилкарбамоил}-этил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил] [Cys71]Met-FGF21 и S-71-({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(8)-4-карбокс