Композиция для лечения рака легких, прежде всего, немелкоклеточного рака легких (нмкрл)

Композиция для лечения рака легких, прежде всего, немелкоклеточного рака легких (нмкрл)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к активной (иммуностимулирующей) композиции, содержащей по меньшей мере одну РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно, различных) антигена, способных вызывать (приобретенный) иммунный ответ у млекопитающего. Настоящее изобретение также относится к вакцине, содержащей указанную активную (иммуностимулирующую) композицию, и к применению указанной активной (иммуностимулирующей) композиции (для получения вакцины) и/или вакцины для индукции (приобретенного) иммунного ответа с целью лечения рака легких, прежде всего немелкоклеточных форм рака легких (НМКРЛ), предпочтительно выбранных из трех основных подтипов: плоскоклеточная карцинома легких, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легких или связанных с ними расстройств. В конечном счете, настоящее изобретение относится к наборам, прежде всего к наборам или к наборам компонентов, содержащим активную (иммуностимулирующую) композицию и/или вакцину.

В 25% случаев всех злокачественных опухолей зарегистрирована бронхиальная карцинома (карцинома легких). Во всем мире она является наиболее распространенной причиной смерти от рака у мужчин и второй по распространенности у женщин. В Германии этот тип рака является третьим по распространенности, затем карцинома предстательной железы и колоректальная карцинома. Карцинома легких является причиной 1,3 миллиона смертельных случаев во всем мире ежегодно. В Центральной Европе заболеваемость составляет приблизительно 60 на 100000 населения, а число пациентов с первичным диагнозом рака легких неуклонно растет (составляя в настоящее время в Германии приблизительно 50000 в год). После установления диагноза рака легких средняя выживаемость сроком 5 лет составляет менее 5%. Тем не менее, средняя продолжительность жизни каждого отдельного пациента полностью зависит от стадии заболевания (по классификации TMN) и установленного подтипа карциномы (рака легких) (см. ниже).

Основными подтипами рака легких, классифицируемыми по размеру и локализации злокачественных клеток, распознаваемых под микроскопом, являются мелкоклеточный рак легких (20%) и немелкоклеточный рак легких (НМКРЛ) (80%). Несмотря на то, что данная классификация основана на простом гистологическом критерии, она имеет чрезвычайно важное значение в клинической практике и прогнозировании развития заболевания, причем мелкоклеточный рак легких обычно лечат химиотерапией, в то время как для лечения немелкоклеточного рака легких в большинстве случаев в качестве лечения первого ряда используют хирургическое вмешательство.

Немелкоклеточные формы рака легких (НМКРЛ) объединяют на основании того, что их прогнозирование и лечение примерно одинаковы. Выделяют три основных подтипа: плоскоклеточная карцинома легких, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легких. При этом основным лечением является хирургическое вмешательство, однако только четверть пациентов успешно переносят резекцию, при этом частота рецидивов составляет 50%. Способы лечения заболевания на поздней стадии включают, вслед за хирургическим вмешательством, вспомогательную химиотерапию и/или вспомогательную лучевую терапию, причем было установлено, что при использовании в качестве монотерпии (терапии первого ряда) наблюдались неудовлетворительные результаты. При сравнении четырех обычно используемых курсов комбинированной химиотерапии ни один не являлся достаточно эффективным. Эффективность терапии изменялась от 15% до 22%, при этом коэффициенты выживаемости составляли за первый год от 31% до 36% (см., например, статью O'Mahony D., S. Kummar и др., "Non-small-cell lung cancer vaccine therapy: a concise review", J. Clin. Oncol. 23(35); 9022-9028 (2005)). Таким образом, оказалось, что даже предоперационная химиотерапия не приводит к ожидаемому увеличению средней продолжительности жизни, а вспомогательная химиотерапия, применяемая также в комбинации с лучевой терапией, также не приводит к значительному увеличению средней продолжительности жизни.

Один из химиотерапевтических подходов, применяемых в настоящее время, представляет собой комбинации веществ на основе платина, например, с гемцитабином, применяемые даже в качестве терапии первой линии, при этом применяют, например, пеметрексед в качестве терапии второго ряда.

Другой вариант, применяемый для лечения НМКРЛ, представляет собой так называемую «направленную терапию», то есть попытку усилить эффективность классической цитотоксической химиотерапии при воздействии на специфические структуры-мишени в опухоли на молекулярном уровне. Применяемые при этом вещества включают бевацизумаб (ингибитор ангиогенеза) или эрлотиниб, который воздействует на рецепторные тирозинкиназы эпидермального фактора роста (РЭФР).

Даже несмотря на то, что, несомненно, наблюдается положительная динамика при применении современных терапевтических подходов к лечению рака легких, прежде всего НМКРЛ, все еще существуют серьезные трудности, связанные с высокими коэффициентами смертности, и настоятельная потребность в дельнейших, альтернативных или усовершенствованных способах лечения.

Таким образом, в настоящем изобретении предлагается использовать иммунную систему при лечении НМКРЛ. Иммунная система играет важную роль в лечении и профилактике многочисленных заболеваний. В соответствии с современным состоянием науки млекопитающие обеспечены различными механизмами защиты организма, распознающими и убивающими, например, опухолевые клетки. Эти опухолевые клетки необходимо идентифицировать и распознавать от нормальных клеток и тканей организма.

Иммунная система позвоночных, таких как человек, состоит из многих типов белков, клеток, органов и тканей, которые взаимодействуют в сложной и динамичной системе. На одной из стадий этого чрезвычайно сложного иммунного ответа иммунная система в течение времени адаптируется к более эффективному распознаванию отдельных патогенов или опухолевых клеток. В результате адаптационного процесса создается иммунологическая память, что обеспечивает более эффективную защиту при последующих столкновениях с патогенами. Этот процесс адаптивного или приобретенного иммунитета формирует основу методик вакцинации.

Приобретенная иммунная система является антигенспецифичной и требует распознавания специфических «собственных» или «чужеродных» антигенов во время процесса, называемого презентацией антигена. Антигенная специфичность способствует формированию ответных реакций, направленных на специфические патогены или инфицированные патогеном клетки или опухолевые клетки. Способность формировать эти направленные ответные реакции поддерживается в организме так называемыми «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм несколько раз, то эти специфические клетки памяти используются для быстрого устранения патогена. Таким образом, приобретенная иммунная система обеспечивает более сильный иммунный ответ, а также иммунологическую память, при этом каждый патоген или опухолевая клетка «запоминаются» в виде одного или более характерных антигенов.

Основные компоненты приобретенной иммунной системы у позвоночных преимущественно включают лимфоциты на клеточном уровне и антитела на молекулярном уровне. Лимфоциты в качестве компонентов приобретенной иммунной системы включают В-клетки и Т-клетки, которые происходят из гематопоэтических стволовых клеток в костном мозге. В-клетки принимают участие в гуморальном иммунном ответе, в то время как Т-клетки принимают участие в клеточном иммунном ответе. Как В-клетки, так и Т-клетки включают рецепторные молекулы, которые распознают специфические мишени. Т-клетки распознают «чужеродную» мишень, такую как патогенная структура-мишень, только после того, как образуются процессированные антигены (т.е. низкомолекулярные фрагменты патогена) и презентируются в комбинации с «собственным» рецептором, называемой главным комплексом гистосовместимости (ГКГ). Напротив, B-клеточный антигенспецифичный рецептор представляет собой молекулу антитела на поверхности В-клетки и распознает патогены как таковые в случае, когда антитела на их поверхности связываются со специфическим чужеродным антигеном. Такой комплекс антиген/антитело поглощается В-клеткой и подвергается процессингу-протеолизу с образованием пептидов. Затем В-клетка презентирует эти антигенные пептиды на своих поверхностных молекулах ГКГ класса II. Эта комбинация ГКГ и антигена привлекает соответствующую хелперную Т-клетку, которая высвобождает лимфокины и активирует В-клетку. Так как активированная В-клетка начинает затем делиться, ее потомки секретируют миллионы копий антител, которые распознают данный антиген. Эти антитела циркулируют в плазме крови и лимфе, связывают патогены или опухолевые клетки, экспрессирующие антиген, и маркируют их для последующего разрушения за счет активации комплемента или поглощения и разрушения фагоцитами.

Являясь клеточным компонентом приобретенной иммунной системы, цитотоксические Т-клетки, ЦТК (CD8+) могут формировать ЦТК-ответ. Цитотоксические Т-клетки (CD8+) могут распознавать пептиды из эндогенных патогенов и собственные антигены, связанные с молекулами ГКГ типа I. CD8⁺-Т-клетки выполняют функцию киллеров при высвобождении цитотоксических белков в клетку.

Механизмы иммунной системы формируют мишени, предназначенные для лечения. Соответствующие способы, как правило, основаны на введении адъювантов для индукции врожденного иммунного ответа или на введении антигенов или иммуногенов для индукции приобретенного иммунного ответа. Так как антигенами обычно являются специфические компоненты патогенов (например, поверхностные белки) или их фрагменты, то введение пациенту нуклеиновых кислот, с последующей экспрессией требуемых полипептидов, белков или антигенов, можно рассматривать как перспективный способ лечения.

До настоящего времени стандартные способы индукции иммунного ответа, иммунизация или вакцинация, основаны на использовании ДНК с целью встраивания требуемой генетической информации в клетку. Разработаны различные методы введения ДНК в клетки, такие как трансфекция фосфатом кальция, трансфекция полипреном, слияние протопластов, электропорация, микроинъекция и липофекция, причем липофекция, как было установлено, является наиболее пригодным способом. Аналогичным образом можно использовать ДНК-содержащие вирусы в качестве переносчиков ДНК. Благодаря их инфицирующим свойствам, такие вирусы характеризуются чрезвычайно высокой скоростью трансфекции. Используемые вирусы генетически модифицированы таким образом, чтобы исключить образование функциональных инфекционных частиц в трансфектированной клетке. Однако, несмотря на такие меры предосторожности, невозможно исключить риск неконтролируемого размножения введенного гена и вирусных генов, например, из-за потенциально возможных случаев рекомбинации. Риск также заключается в возможности введения ДНК в здоровый ген в составе генома клетки-хозяина, например, в результате рекомбинации, с последующей мутацией этого гена, и, таким образом, происходит полная или частичная дезактивация гена, или он может содержать неверную информацию. Другими словами, существует возможность полного подавления синтеза генетического продукта, который жизненно необходим для клетки, или, напротив, возможность экспрессии измененного или неправильного генетического продукта. Особый риск возникает в случае, если ДНК вводят в ген, который принимает участие в регуляции клеточного роста. В этом случае клетка-хозяин может начать дегенерировать, что приводит к образованию рака или опухоли. Кроме того, если ДНК, введенная в клетку, должна экспрессироваться, возникает потребность в том, чтобы соответствующий переносчик ДНК содержал сильный промотор, такой как промотор вируса ЦМВ. Встраивание таких промоторов в геном подвергающейся воздействию клетки может привести к нежелательным отклонениям в регуляции экспрессии гена в клетке. Другой риск при использовании ДНК в качестве агента для усиления иммунного ответа (например, в форме вакцины) представляет собой индуцирование патогенных антител против ДНК у пациента, которому была введена чужеродная ДНК, что может индуцировать иммунный ответ (который может привести к летальному исходу).

В целом, таким образом, существует необходимость в разработке эффективной системы, которую можно использовать для эффективной стимуляции иммунной системы, обеспечивая лечение рака легких, прежде всего немелкоклеточного рака легких (НМКРЛ), исключая при этом проблемы, связанные с неконтролируемым размножением введенного гена при использовании композиций на основе ДНК.

Таким образом, целью настоящего изобретения является композиция, которая а) обеспечивает лечение рака легких в результате стимуляции иммунной системы и в то же время б) лишена вышеупомянутых недостатков.

Указанная цель достигается при разработке объекта настоящего изобретения, прежде всего активной (иммуностимулирующей) композиции, содержащей по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере два (предпочтительно различных) антигена, выбранных из группы, содержащей антигены: hTERT, WT1, MAGE-A2, 5Т4, MAGE-A3, MUC1, Her-2/neu, NY-ESO-1, СЕА, сурвивин, MAGE-C1 и/или MAGE-C2.

Неожиданно было установлено, что специфическая комбинация по меньшей мере двух антигенов, антигенных белков или антигенных пептидов из выше перечисленной группы, в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, может эффективно стимулировать (приобретенную) иммунную систему, обеспечивая лечение рака легких, прежде всего НМКРЛ. В данном контексте термины «антигены, антигенные белки или антигенные пептиды» используются в качестве синонимов. В контексте настоящего изобретения термин «активная» (иммуностимулирующая) композиция по настоящему изобретению обозначает композицию, которая вызывает иммунный ответ, предпочтительно, приобретенный иммунный ответ, как определено в данном контексте, при этом один из компонентов (или компоненты) содержится в композиции или кодируется компонентами активной (иммуностимулирующей) композиции, предпочтительно по меньшей мере одной РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей по меньшей мере два (предпочтительно, различных) антигена.

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может кодировать hTERT. В контексте настоящего изобретения термин «hTERT» обозначает теломеразу обратной транскриптазы человека, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «hTERT», в случае, если ее используют в активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и еще более предпочтительно, на фиг.8 (SEQ ID NO:8). В статье Minev, В., J. Hipp и др., "Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(9): 4796-4801 (2000) указано, что теломеразой является рибонуклеопротеиновый фермент, который связан со злокачественной трансформацией в клетках человека. Теломеразная активность возрастает в подавляющем большинстве опухолей человека, что приводит к тому, что ее генетический продукт становится основной молекулой, свойственной всем опухолям человека. Следовательно, накопление эндогенно процессированных теломеразных пептидов, связанных с молекулами ГКГ класса I, может направлять цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) к опухолям различного происхождения. Таким образом, согласно этим данным, указанный подход может представлять перспективный способ вакцинотерапии рака, что обеспечивается возможностью увеличения количества предшественника ЦТЛ, распознающего теломеразные пептиды у здоровых взрослых и раковых пациентов, в результате иммунизации. В указанной выше статье также описано, что у большинства здоровых субъектов и пациентов с раком предстательной железы, in vitro иммунизированных против двух пептидов HLA-A2.1, полученных в результате рестрикции теломеразы обратной транскриптазы (hTRT), вырабатываются hTRT-специфические ЦЛТ. В статье Carpenter E. L. и R. H. Vonderheide, "Telomerase-based immunotherapy of cancer", Expert. Opin. Biol. Ther. 6(10): 1031-1039 (2006) описаны прогрессивные исследования, начиная с клонирования теломеразы обратной транскриптазы человека (hTERT) в 1997 г. до первых клинических испытаний. Белок hTERT сверхэкспрессируется в подавляющем большинстве случаев рака человека, при этом он характеризуется ограниченной экспрессией в здоровых тканях человека. Он играет важную роль в онкогенезе и может экспрессироваться раковыми стволовыми клетками. Однако, несмотря на то, что он является собственным антигеном, hTERT проявляет иммуногенные свойства как in vitro, так и in vivo. Результаты нескольких клинических и иммунологических испытаний в первой фазе в ходе иммунотерапии с применением hTERT у пациентов с раком молочной железы, предстательной железы, легких и других форм рака, являются достаточно обнадеживающими. Иммунотерапия стимулировала у пациентов формирование функциональных противоопухолевых Т-клеток при отсутствии клинической токсичности. Существует также возможность вакцинации субъектов в качестве стратегии иммунопрофилактики в ходе лечения на основе hTERT. В статье Nair S. K., A. Heiser и др., "Induction of cytotoxic T cell responses and tumor immunity against unrelated tumors using telomerase reverse transcriptase RNA transfected dendritic cells", Nat. Med. 6(9): 1011-1017 (2000) описано развитие антимышиного TERT-иммунитета у мышей, вакцинированных дендритными клетками, трансфектированными мышиной TERT РНК. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген hTERT, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и более предпочтительно, на фиг.8 (SEQ ID NO:8). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген hTERT, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности hTERT, как показано на фиг.7 (SEQ ID NO:7), и более предпочтительно, как показано на фиг.8 (SEQ ID NO:8).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать WTI. В контексте настоящего изобретения термин «WT1» обозначает опухоль Вильмса стадии 1 и предпочтительную последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующую «WT1», при условии ее использования в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, как показано на фиг.9 (SEQ ID NO:9), более предпочтительно, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:10), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11). В статье Oka Y., A. Tsuboi и др., "Induction of WTI (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WTI peptide vaccine and the resultant cancer regression", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (38): 13885-13890 (2004) было установлено, что белок опухоли Вильмса сверхэкспрессируется при раке легких. В этой статье описана вакцинация 10 пациентов с раком легких пептидом из WT1. Было установлено, что клиническая ответная реакция коррелирует с антиопухолевой CD8+-T-клеточной активностью. Ген опухоли Вильмса WT1 сверхэкспрессируется при лейкозах и различных типах солидных опухолей, и было установлено, что белок WT1 является перспективным антигеном-мишенью для иммунотерапии против этих злокачественных новообразований. В статье Oka и др. (2004 г., см. выше) описаны результаты фазы I клинических испытаний в ходе иммунотерапии, основанной на применении пептида WT1 у пациентов с раком молочной железы и легких, миелодиспластическим синдромом или острым миелоидным лейкозом. У двенадцати из 20 пациентов, у которых можно было оценивать эффективность вакцинации WT1, наблюдалась клиническая ответная реакция, такая как уменьшение количества лейкозных бластных клеток или размера опухоли и/или онкомаркеров. Наблюдалась четкая корреляция между ростом частоты WT1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов после вакцинации WT1 и клинической ответной реакцией. Таким образом, было установлено, что вакцинация WT1 может индуцировать выработку WT1-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и приводит к ремиссии рака при отсутствии повреждения нормальных тканей. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген WT1, выбранный из последовательности, как показано на фиг.9 (SEQ ID NO:9), и более предпочтительно, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген WT1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности WT1, как показано на фиг.10 (SEQ ID NO:10), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.11 (SEQ ID NO:11).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-A2. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-A2» обозначает меланомный антиген семейства А, 2В, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «MAGE-A2», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и наиболее предпочтительно, на фиг.15 (SEQ ID NO:15). В статье Gillespie А. М. И R. Е. Coleman, "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy", Cancer Treat. Rev. 25(4): 219-227 (1999) описана экспрессия при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, колоректальном раке, раке желудка, раке головы и шеи, раке легких, раке челюсти, меланоме, раке пищевода, остеосаркоме и раке яичника. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MAGE-A2, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и более предпочтительно, как показано на фиг.15 (SEQ ID NO:15). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-A2, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-A2, как показано на фиг.14 (SEQ ID NO:14), и более предпочтительно, как показано на фиг.15 (SEQ ID NO:15).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать 5Т4. В контексте настоящего изобретения, термин «5Т4» обозначает трофобластный гликопротеин, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «5Т4», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции по настоящему изобретению, показана на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, на фиг.4 (SEQ ID NO:4). В статье Harrop R., N. Connolly и др., "Vaccination of colorectal cancer patients with modified Vaccinia Ankara delivering the tumor antigen 5Т4 (TroVax) induces immune responses which correlate with disease control: a phase 1/11 trial", Clin. Cancer Res. 12 (11 Pt 1): 3416-3424 (2006) было установлено, что онкоэмбриональный антиген 5Т4 представляет собой мембранный гликопротеин с повышенным содержанием лейцина и массой 72 кДа, который экспрессируется на высоком уровне в плаценте, а также при целом ряде карцином человека, включая колоректальный рак, рак желудка, почки и яичников, но редко встречается в здоровых тканях. Сверхэкспрессия 5Т4 связана с неблагоприятным прогнозом у пациентов с колоректальным раком, раком желудка и яичников. Несмотря на такое сочетание факторов, 5Т4-специфический клеточный и/или гуморальный иммунный ответ был индуцирован у большинства пациентов (16 из 17, 94%), после иммунизации TroVax, которая считается перспективной по сравнению с результатами испытаний множества других способов иммунотерапии рака. Таким образом, в указанной выше статье описаны безопасность и иммуногенность доставки TroVax внутримышечным и внутрикожным способами введения. В статье Zhao Y. и Y. Wang, "5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors". Cell Mol. Immunol. 4(2): 99-104 (2007) указано, что онкотрофобластный гликопротеин 5T4 является трансмембранным белком, экспрессируемым в эмбриональной ткани и на поверхности клеток различных злокачественных опухолей. Он играет жизненно важную роль в многочисленных биологических и патологических процессах, включая весьма обширную миграцию клеток при эмбриогенезе, клеточную инвазию, вызываемую имплантацией, и метастазы опухоли в процессе онкогенеза. В статье Kopreski М. S., F. A. Benko и др., "Circulating RNA as a tumor marker: detection of 5T4 mRNA in breast and lung cancer patient serum", Ann. NY Acad. Sci. 945: 172-178 (2001) указано, что 5T4 является трофобластным гликопротеином, который сверхэкспрессируется с высокой частотой при эпителиальных злокачественных образованиях, что является потенциальной мишенью при лечении рака. Отбирали сыворотку у 19 пациентов с прогрессирующим раком молочной железы (5 пациентов) или немелкоклеточным раком легких (14 пациентов), а также у 25 здоровых добровольцев, использованных в качестве контрольных пациентов с амплифицируемой РНК. РНК, экстрагированную из сыворотки, амплифицировали методом ОТ-ПЦР с использованием полугнездовой двухстадийной реакции, при этом продукты детектировали методом электрофореза. 5T4 мРНК воспроизводимо детектировали в 8 из 19 (42%) сыворотках пациентов, больных раком, включая 2 из 5 сывороток пациентов, больных раком молочной железы и 6 из 14 сывороток пациентов, больных раком легких, но только в 3 из 25 (12%) здоровых контрольных сыворотках (р=0,035). Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген 5Т4, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:4). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген 5Т4, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности 5Т4, как показано на фиг.3 (SEQ ID NO:3), и более предпочтительно, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:4).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MAGE-A3. В контексте настоящего изобретения термин «MAGE-A3» обозначает меланомный антиген семейства А, 3, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующая «MAGE-A3», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и наиболее предпочтительно, на фиг.17 (SEQ ID NO:17). В статье Gillespie А. М. и R. Е. Coleman, "The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy". Cancer Treat. Rev. 25(4): 219-227 (1999) описана экспрессия при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, колоректальном раке, раке желудка, глиоме, раке головы и шеи, раке легких, раке челюсти, меланоме, нейробластоме, раке пищевода и раке яичников. В статье Sienel W., С. Varwerk и др., "Melanoma associated antigen (MAGE)-A3 expression in Stages I and II non-small cell lung cancer: results of a multi-center study", Eur. I. Cardiothorac. Surg. 25(1): 131-134 (2004) описаны результаты исследования, проведенного с целью определения степени экспрессии MAGE-A3 на ранней стадии НМКРЛ. Были отобраны образцы первичной опухоли от 204 пациентов с НМКРЛ на операбельных стадиях I и II, и определена стадия развития патологии. Экспрессию MAGE-A3 анализировали в образцах ткани при детектировании транскриптов MAGE-A3 методом ОТ-ПЦР. Экспрессию MAGE-A3 наблюдали в 80 из 204 (39,2%) исследованных образцов первичных опухолей на стадиях I и II. В статье Atanackovic D., N. К. Altorki и др., "Vaccine-induced CD4+ Т cell responses to MAGE-3 protein in lung cancer patients", J. Immunol. 1 72(5): 3289-3296 (2004) описано, что MAGE-A3 является опухоль-асоциированным антигеном, первоначально идентифицированным в меланоме, а также в опухолях при немелкоклеточном раке легких. В ходе клинического испытания 9 пациентов с НМКРЛ вакцинировали белком, при этом наблюдалось 3 детектируемых гуморальных иммунных ответа. У семи из 8 пациентов, которым вводили MAGE-A3 в комбинации с адъювантом ASO2B, вырабатывались антитела против MAGE-A3. У нескольких из этих пациентов также наблюдались Т-клеточные иммунные ответы против белка. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MAGE-A3, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и более предпочтительно, как показано на фиг.17 (SEQ ID NO:17). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MAGE-A3, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MAGE-A3, как показано на фиг.16 (SEQ ID NO:16), и более предпочтительно, как показано на фиг.17 (SEQ ID NO:17).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать MUC1. В контексте настоящего изобретения термин «MUC1» обозначает муцин 1, а предпочтительная последовательность РНК, предпочтительно, мРНК, кодирующей «MUC1», при условии, что она применяется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2). Опухоль-ассоциированные муцины являются потенциальной мишенью при иммунотерапии. Эти молекулы, как полагают, способствуют метастазированию за счет ускорения адгезии злокачественных клеток к поверхности эндотелиальных клеток. В статье Denda-Nagai K. и Т. Lrimura, "MUC1 in carcinoma-host interactions", Glycoconj J., 17 (7-9): 649-658), описано, что MUC-I сверхэкспрессируется в 90% случаев всех аденокарцином, включая поражения молочной железы, легких, поджелудочной железы, предстательной железы, желудка, ободочной кишки и яичников. В статье Kontani K., О. Taguchi и др., "Modulation of MUC1 mucin as an escape mechanism of breast cancer cells from autologous cytotoxic T-lymphocytes", Br. J. Cancer. 84(9): 1258-1264 (2001) описано, что MUC-1 экспрессируется в 60% случаев рака легких, в то время как в статье Kontani K., О. Taguchi и др., "Dendritic cell vaccine immunotherapy of cancer targeting MUC1 mucin", Int. J. Mol. Med., 12(4): 493-502 (2003) описаны результаты исследований с использованием нагруженных MUC1 антигеном пульсирующих дендритных клеток (ДК) для индукции клеточного иммунитета в случаях MUC1-положительного рака, при этом клинически было установлено, что у семи из девяти MUC1-положительных пациентов наблюдается ответная реакция на соответствующее лечение, что выражается либо в уменьшении уровней онкомаркеров, либо в исчезновении злокачественного плеврального выпота. Причем у трех из этих пациентов с положительной ответной реакцией был установлен диагноз НМКРЛ. В статье Palmer M., J. Parker и др., "Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer", Clin. Lung Cancer, 3(1): 49-57 discussion 58 (2001) указано, что в фазе I клинических испытаний с применением пептида MUC1 на стадиях III/IV НМКРЛ, наблюдались безопасность и иммунность указанного агента. У 5 из 12 пациентов (42%) наблюдался иммунный ответ, у 4 из 12 пациентов (33%) наблюдалась стабилизация заболевания. Кроме того, в статье Wierecky J., M. Mueller и др., "Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1", Cancer Immunol. Lmmunother., 55(1): 63-67 (2006) описана идентификация двух HLA-A2-связывающих новых нонапептида из опухоль-ассоциированного антигена MUC1, который сверхэкспрессируется при различных гематологических и эпителиальных злокачественных образованиях. Цитотоксические Т-клетки, образующиеся под действием пульсирующих, нагруженных этими пептидами ДК, вызывали лизис опухолевых клеток, экспрессирующих MUC1 по антигенспецифичному и HLA-ограниченному механизму. По данным двух клинических испытаний было установлено, что при вакцинации пациентов с прогрессирующим раком с использованием ДК, нагруженных пептидами из MUC1, наблюдалась достаточно высокая переносимость без серьезных побочных эффектов, и формировался иммунный ответ. Из 20 пациентов с метастазирующей почечно-клеточной карциномой у 6 пациентов наблюдалась регрессия метастазов тремя объективными ответами (1 CR и 2 PR). Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген MUC1, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и более предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2). Согласно еще одному предпочтительному варианту настоящего изобретения по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или дополнительно кодировать антиген MUC1, выбранный из фрагмента, варианта или эпитопа последовательности MUC1, как показано на фиг.1 (SEQ ID NO:1), и более предпочтительно, как показано на фиг.2 (SEQ ID NO:2).

По меньшей мере, одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может также кодировать Her-2/neu. В контексте настоящего изобретения термин «Her-2/neu» обозначает гомолог 2 вирусного онкогена эритробластного лейкоза, v-erb-b2, а предпочтительная последовательность РНК, кодирующая «Her-2/neu», предпочтительно, мРНК, кодирующая «Her-2/neu», при условии, что она используется в составе активной (иммуностимулирующей) композиции согласно настоящему изобретению, показана на фиг.5 (SEQ ID NO:5), и наиболее предпочтительно, как показано на фиг.6 (SEQ ID NO:6). В статье Baxevanis C.N., P.A. Sotiropoulou и др., "Immunobiology of HER-2/neu oncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy". Cancer Immunol. Lmmunother., 53(3): 166-175 (2004) указано, что HER-2/neu (также известный как HER2 или c-erb-B2) представляет собой белковый рецептор массой 185 кДа, который характеризуется тирозинкиназной активностью и высокой степенью гомологии по сравнению с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР). HER-2/neu экспрессируется при многих эпителиальных опухолях и, как известно, сверхэкспрессируется, приблизительно, в 20-25% всех случаев рака яичников и рака молочной железы, 35-45% всех случаев аденокарциномы поджелудочной железы и до 90% случаев колоректальной карциномы. Сверхэкспрессия HER-2/neu является маркером неблагоприятного прогноза. Сверхэкспрессия HER-2/neu наблюдается при злокачественных опухолях молочной железы, яичников, поджелудочной железы, ободочной кишки, легких и других тканей. В норме Her-2 экспрессируется на низком уровне в различных тканях человека (в коже, эпителии пищеварительного тракта, молочной железе, яичниках, гепатоцитах). В статье Bernhard H., Salazar L. и др., "Vaccination against the HER-2/neu oncogenic protein", Endocr. Relat. Cancer, 9(1): 33-44 (2002) указано, что предварительные результаты клинических испытаний свидетельствуют о том, что у больных раком, активно иммунизированных против HER-2/neu, можно индуцировать иммунитет и что иммунный ответ сохраняется в течение некоторого периода времени. Современные клинические испытания вакцины направлены только на применение вакцин на основе эпитопов или пептидов, главным образом в связи с данными о том, что такая стратегия на основе пептидной вакцинации может исключить новую неспецифическую переносимость в моделях грызунов. Следующее поколение вакцин, как описано в статье Bernhard и др. (2002) (см. выше), будет, по-видимому, включать вакцины на основе белков, препаратов ДК, нагруженных антигеном HER-2/neu, и составов на основе нуклеиновых кислот. Доклинические испытания указанных подходов на модели грызунов оказались достаточно обнадеживающими. Рост HER-2/neu-специфических Т-клеток ex vivo после активной иммунизации или их культивирование in vitro с применением ДК, экспрессирующих HER-2/neu, считается, таким образом, перспективным методом лечения HER-2/neu-сверхэкспрессирующих опухолей на поздних стадиях. В статье Baxevanis C.N., N.N. Sotiriadou и др., "Immunogenic HER-2/neu peptides as tumor vaccines", Cancer Immunol. Lmmunother. 55(1): 85-95 (2006) было установлено, что у людей, несмотря на то, что были отмечены случаи иммунологического ответа на пептиды, использованные при вакцинации, не было описано случаев ответной реакции в ходе клинических испытаний. В статье Disis M.L., Т.A. Gooley и др., "Generation of Т-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines", J. Clin. Oncol. 20(11); 2624-2632 (2002) описано, что Her-2/neu является членом семейства рецепторов ЭФР. В большинстве случаев он сверхэкспрессируется при раке молочной железы, яичников, предстательной железы, колоректальном раке и раке легких. В фазе I клинических испытаний 38 пациентов (2 с диагнозом НМКРЛ) были вакцинированы пептидом Her-2/neu. У 92% пациентов наблюдалось развитие Т-клеточного иммунитета к Her-2/neu. Согласно предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может таким образом кодировать антиген Her-2/neu, выбранный из последовательностей, как показано на фиг.5 (SEQ ID NO:5), и более предпочтительно, как показано на фиг.6 (SEQ ID NO:6). Согласно еще одному предпочтительному варианту по меньшей мере одна РНК в составе активной (иммуностимулирующей) композиции может альтернативно или доп